用Medimachine系统制备实体组织的单细胞悬液

用 Medimachine 系统制备实体组织的单细胞悬液 李 　宾 　周春喜 　　流式细胞术 (flow cytometry , FCM) 作为一种 可在单细胞水平上对大量细胞进行快速、准确、多参 数定量分析和分选的高技术 ,在细胞生物学、免疫 学、肿瘤学等方面的应用日趋广泛和深入。进行 FCM 分析的前提是样品为单细胞悬液 ,而大多数实 体组织都难以制成高质量的单细胞悬液样本 ,因而 大大限制了 FCM 对实体组织特别是实体瘤的分析 和研究〔1〕。 实体组织单细胞样本制备一般采用手工方法 , 主要有机械剪切法、酶消化法、去污剂化学处理法、 针头抽吸法等〔2〕。但上述方法均存在组织用量多 , 制样过程繁琐耗时 ,细胞产率及实验重复性低等问 题。我室采用 Medimachine 系统 (丹麦 Dako) ,仅在 数分钟内即完成了新鲜和冻存实体组织单细胞悬液 的样本制备 ,样本完全适合 FCM 分析 ,结果满意。 1 　Medimachine 系统 111 　结构和工作原理 　Medimachine 系统是采用 机械剪切的方法将剪成小块的实体组织制备成单细 收稿日期 :1998209203 作者单位 :解放军总医院医学实验测试中心流式细胞室 ,北京 　 100853 作者简介 :李　宾 ,32 岁 ,硕士 ,助理研究员 胞或单细胞核悬液的自动化系统。样品制备过程不 需加任何消化酶或去污剂等 ,它由 Medimachine、 Medicon 及 Filcon 3 部分组成。其中 Medimachine 为主机 ,后两者为配件。Medicon 为一圆形聚乙烯 元件 ,底部设有一个固定的不锈钢网筛 ,上有约 100 个正六边形筛孔 (直径约为 1 mm) ,每个筛孔周围 有 6 个经特殊设计的微型刀片以进行精细的组织切 割 ,主机则可以每分钟 100 转的转速带动 Medicon 中轴的旋转片转动。Filcon 为一直径 115 cm 的细 胞过滤器 ,可按不同孔径对组织细胞混悬液进行过 滤。 112 　使用方法 　先将新鲜的组织冲洗干净或将冻 存的组织解冻 ,去除脂肪及坏死组织 ,取一小块组织 (约 10 mm3) ,与约 1 ml PBS 一起加入 Medicon ,将 Medicon 插入 Medimachine 中 ,把开关转向运行位 置 ,运行 5～30 s (时间因样品而定) ,关机 ,取出 Medicon ,用注射器吸出混悬液 ,用相应孔径的 Fil2 con 过滤 ,400 g 离心 5 min ,以 PBS 或细胞培养液悬 浮即制得单细胞悬液。 113 　技术关键 　使用 Medimachine 系统时 ,除了要 预先将组织块清洗干净 ,去除脂肪及坏死组织外 ,针 对不同的组织 ,还要注意从以下几方面摸索实验的 条件。 　　p16 基因位于 9q21 区域 ,由 3 个外显子和 2 个 内含子组成 ,它编码 p16 蛋白的主要作用是抑制周 期蛋白依赖性激酶的活性与 cyclinD 竞争 CD K4 ,使 CD K42cyclinD 复合物的形成受阻 ,控制细胞进入合 成期。一旦 p16 基因发生改变而不能正常表达 ,细 胞增殖的负调控机制失败 ,从而为癌细胞失控性增 殖提供了有利条件。在非小细胞肺癌中 ,国内外报 道 p16 基因的改变频率为 30 % ,主要为纯合性缺失 和点突变。本文原位 PCR 检测 p16 基因阴性表达 为 8 例 (2218 %) ,主要反映了纯合性缺失的情况。 而对内源性基因重排 ,因为在所有细胞内都有未重 排的靶序列存在 ,而引物也会与相应的 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 发生特 异性结合 ,并在 DNA 聚合酶作用下延伸 ,这样就给 基因重排检测带来了困难〔4〕。通过原位 PCR 检测 p16 基因 ,结果表明在非小细胞肺癌中大部分癌细 胞均有 p16 基因纯合性缺失。 关键词 　肺肿瘤 ;基因 ,抑制 ,肿瘤 ;聚合酶链反应 中国图书分类号 　R73413 ;R39412 文献标识码 A 　　文章编号 　100127399 (1999) 0420351202 参考文献 1 　Washimi O , Nagatake M , Osada H et al . In vivo occurrence of p16 (NST1) and p15 (MST2) alterations preferentially in non small cell lung cancer. Cancer Res ,1994 ;55 (3) :514 2 　Haase AT , Reazel EF , Staskus KA. Amplification detection of lentivival DNA inside cell. Proc Sci USA ,1990 ;87 :4971～4975 3 　李立家 ,宋运淳. 原位 PCR 技术及其应用. 国外医学分子生物学 分册 ,1998 ;20 :91 4 　苏慧慈 ,刘彦仿主编. 原位 PCR. 北京 :科学出版社 ,1995 :85 (图片见插页第 52 页) ·253· 临床与实验病理学杂志 　J Clin Ex p Pathol 　1999 Aug ;15 (4) © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 11311 　为使细胞保持活性 ,操作应冰镇条件下进 行。 11312 　采用 Medimachine 系统通常用数秒至数十 秒的时间方可将组织块剪切成单细胞。由于不同的 组织其组成及结构差异很大 ,且新鲜及冻存组织亦 不同 ,要经过摸索选择合适的剪切时间。如新鲜胃 癌组织的剪切时间 (18 s) 就长于新鲜肺癌组织 (10 s) ,时间太短则组织破碎不全 ,细胞产率低 ;时间太 长则细胞碎片增多 ,不仅同样影响细胞产率 ,还会影 响样本的质量。 11313 　由于 Medicon 的总容积为 2 ml ,因而将剪碎 的组织块加入 Medicon 时所用的缓冲液或培养液的 体积不应超过 2 ml ,以 015～115 ml 为宜 ,体积过多 或过少都不利于组织的完全剪切。 11314 　剪切后的组织细胞悬液用去针头的注射器 由 Medicon 的侧孔吸出 ,经 Filcon 过滤。分离人体 细胞应选择 50μm 和 70μm 孔径的 Filcon。 11315 　用 Filcon 过滤后 ,细胞悬液中通常会有一些 微小的细胞及组织碎片 ,可进一步采用缓速离心的 方法 (400～600 r·min - 1) ,通过控制离心力和离心 的时间 ,使细胞沉降而使碎片悬浮在上清液中而将 大部分碎片去除 ,从而进一步提高样本的质量。 2 　结果 我们利用 B2D 公司的 FACSCalibur 型流式细胞 仪 ,对 Medimachine 系统制备的单细胞悬液进行了 检验测试 ,结果显示 (图 1) ,在 FSC/ SSC 二维散射 光图中 ,除小部分碎片外 ,所制备细胞形态均匀 ,集 中成群 ,完全适合流式细胞术进一步进行表面标记 或细胞周期等分析 ,结果满意。 3 　讨论 采用 Medimachine 系统制备单细胞悬液的最显 著的特点是〔3〕: (1)操作简便快捷 ,大大缩短了 FCM 分析时间 ,对新鲜标本可在 1 h 内报告结果。(2) 使 样本制备过程 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 化、程序化 ,减少人为因素的影 响 ,变操作者依赖性为非操作者依赖性 ,也使各个实 验室的方法能统一起来 ,便于相互间进行实验结果 的比较及交流。(3)所需标本量少 ,一般有几个立方 毫米大小的组织块就足够了 ,活检及镜检组织均可 适用。(4)无需酶和化学试剂等的处理 ,不会损伤细 胞膜表面的结构 ,这对于要进行免疫分析的标本特 图 1 　Medimachine 系统制备不同类型组织单细胞 悬液的流式二维散射光图 a :人肺癌新鲜组织 ,b :小鼠 C57 肺癌新鲜组织 ,c :人肺癌 - 80 ℃ 冻存组织 ,d :小鼠 C57 肺癌 - 80 ℃冻存组织 别重要。(5) 所制备的细胞不仅适用于 FCM ,还可 进行组化 分析及细胞培养等。 　　近年来肿瘤的各类生物分子标志物及癌基因、 抑癌基因的研究进展迅速 ,并已开始应用于肿瘤的 临床病理诊断、判定疗效、预测预后、转移等方面。 流式细胞术则为上述研究及应用提供了先进有效的 方法。然而传统的实体瘤组织单细胞悬液制备手段 不能很好地满足 FCM 对样品分析的需要 ,Medima2 chine 系统则为实体瘤的 FCM 分析提供了一项新的 样品制备手段。 关键词 　单细胞悬液 ; medimachine 系统 ; 流式细胞术 中国图书分类号 　R44618 文献标识码 A 　文章编号 　100127399 (1999) 0420352202 参考文献 1 　Visscher DW , Zarbo RJ , Jacobsen G et al . Multiparameter de2 oxyribouncleic acid and cell cycle analysis of breast carcinomas by flow cytometry. L ab Invest , 1990 ;62 :370～378 2 　Engelholm SA , Spang Thomsen M , Brunner M et al . Disaggrega2 tion of human solid tumor by combind mechanical and enzymatic methods. B r J Cancer ,1985 ;51 :93～98 3 　Ottosen GL , Christensen IJ , Larsen J K et al . Tissue disaggregation for flow cytometric analysis : comparison of fine needle aspiration and an automated mechanical procedure. Cytomet ry ,1996 ;26 :65～ 68 ·353·临床与实验病理学杂志 　J Clin Ex p Pathol 　1999 Aug ;15 (4) © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.