生物化学实验复习总结资料(全)

生化实验五大技术分光光度技术1.定义：根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收，每种物质都具有其特异的吸收光谱，而建立起来的一种定量、定性分析的技术。图1-1光吸收示意图2.基本原理：透光度T=It/Io吸光度A=lg(Io/It)朗伯-比尔(1ambert-Beer)定律:A＝KLc【K为吸光率，L为溶液厚度（cm），c为溶液浓度（mol/L）】摩尔吸光系数ε：1摩尔浓度的溶液在厚度为1cm时，在某一特定波长下的吸光度。c=A/ε3.定量分析：（1） 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线(工作曲线)法（2）对比法（3）计算法：c=A/ε（4）差示分析法（适用于浓度过浓或过稀）（5）多组分混合物测定4.技术分类分子吸收法&原子吸收法；可见光（400~760nm）&紫外光（200～400nm）&红外光（大于760nm）分光光度法；应用方向有机物成分分析&结构分析——红外分光光度法测定人体内的微量元素——原子吸收分光光度法电泳技术1.定义：带电荷的供试品在惰性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。2.基本原理：球形质点的迁移率与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。ν=Q/6πrη3.影响电泳迁移率的因素：电场强度：电场强度大，带电质点的迁移率加速溶液的pH值：溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大溶液的离子强度：电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低电渗：在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗技术分类：自由电泳（无支持体）区带电泳（有支持体）：滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等电泳分析常用方法及其特点：小分子物质——滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质——凝胶电泳（1）醋酸纤维素薄膜电泳①这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，消除纸电泳中出现的“拖尾”现象②分离速度快，电泳时间短③样品用量少④经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化，有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存→特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测（胰岛素、溶菌酶、胎儿甲种球蛋白）琼脂糖凝胶电泳①琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用②琼脂糖凝胶弹性差，不适合管状电泳→用于等电聚焦、免疫电泳、血清脂蛋白等蛋白质电泳，以及DNA、RNA、核苷酸的分析聚丙烯酰胺凝胶电泳①可调节孔径大小②机械强度好，有弹性③分辨率高，用途广④无电渗→用于不同分子量蛋白质的电泳分离SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳该种电泳使蛋白分子相对迁移率(Rf)的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量→最常用定性分析蛋白质的电泳方法，特别用于蛋白质纯度检测&分子量测定等电聚焦电泳技术利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质→由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分，适合研究蛋白质的微观不均一性毛细管电泳①高灵敏度②高分辨率③高效快速④样品少⑤成本低→符合对多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等生物大分子的分离条件层析技术固定相：固体物质或者是固定于固体物质上的成分；流动相：可以流动的物质，如水和各种溶媒1.原理：当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。2.技术分类：①按层析原理分类：　名称　　分离原理吸附层析法组份在吸附剂表面吸附，固定相是固体吸附剂，各能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂结和力不同凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离②按操作形式不同分类：名称操作形式柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离薄层层析法将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离薄膜层析法将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离3.层析法的特点与应用①根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量；②析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量，同时绘出层析图；③层析仪与电子计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间；④分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快→适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析应用方向柱层析、薄膜层析（以硅胶/氧化铝为吸附剂）——分离非极性或极性不强的有机物离子交换层析——分子量相对较小的球状蛋白的分离纯化纸层析——氨基酸、糖类、肽类、抗生素的分离排阻层析——分离纯化、分析生物大分子尤其是蛋白质亲和层析法——适用于蛋白质的分离纯化气象层析——氨基酸、脂肪酸、单糖、双糖、固醇类物质的分离，多肽、蛋白质结构的测定离心技术1.定义：利用旋转运动的离心力，以及物质的沉降系数或浮力密度的差别进行分离、浓缩和提纯的一项操作。2.基本原理：利用转子高速旋转时所产生的强大离心力，加快颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数或浮力密度差的物质分离开。颗粒在离心力场下的沉降情况都与沉降速度和沉降时间相关，沉降时间和速度取决于：(1)离心力；(2)颗粒的大小、形状和密度；(3)沉降介质的密度和粘度。3.离心形式：(I)离心过滤：在有孔转鼓的离心机中通过过滤介质分离悬浮液的过程为离心过滤。(2)离心沉降(或澄清)：利用固液两相比重的差异在离心机无孔转鼓或管子中进行悬浮液沉降分离者为离心沉降(如用于净制含少量固体的液体时也称离心澄清)；(3)离心分离：利用不同溶质颗粒在液体各部分分布的差异，分离不同比重液体的过程为离心分离。【离心过滤、离心沉降同属固-液分离，离心分离则属液-液分离】应用方向普通离心机——物质的分离&提取高速离心机——对样品中的悬浮物质进行高纯度的分离、浓缩、精制、提取，多用于血液、细胞、蛋白质、病毒、激素等的分离制备超速离心机——既可以分离细胞的亚细胞器，也可以分离生物大分子酶学技术酶活性：即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量（注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好）。影响酶活性的因素：酶浓度、底物浓度、温度、PH、抑制剂、激活剂、时间Km值的应用①鉴定酶的种类②反映酶与底物的亲合力（Km值越大，酶与底物亲合力越小）③选择酶的最适底物④计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的比率⑤设计适宜的底物浓度Vmax值的应用用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子酶可使底物发生化学反应的分子数酶学分析在临床诊断上的应用（1）在肝脏疾病诊断中的应用（2）在急性心肌梗死诊断中的应用（3）在急性胰腺炎诊断中的应用（4）在骨骼疾病诊断中的应用（5）在肌肉疾病诊断中的应用（7）在前列腺疾病诊断中的应用（8）在肿瘤诊断中的应用生化经典验证性实验《胰酶对蛋白质的消化和影响酶作用的因素》实验原理：①白明胶（胶片上蛋白质，黑色）胰酶肽或氨基酸（无色）【以底片上白明胶的水解程度说明胰酶活性的高低】②酶的活性受到酶浓度、底物浓度、温度、pH、抑制剂、激活剂、时间等影响实验操作：取试管4支，标上序号→按顺序加入所需试剂→混匀、水浴（预热）→放入底片（全部浸没）→水浴（间歇摇动试管）→立即记录褪色时间(完全或部分）①酶浓度对酶活性的影响（以酶浓度作为变量）：在其他条件不变的情况下，当[S]》[E]时,V与[E]成正比关系。②温度对酶活性的影响（先置于温度100°、40°、0°、0°→1~3号管放回40°保温）：在其他条件不变的情况下，一定范围内增加温度，酶反应速度升高；超过一定的温度范围以后再增加温度，酶反应速度下降【最适温度不是酶的特征性常数】③pH对酶活性的影响（pH分别为5.0、7.0、10.0）：pH通过影响酶或底物的电离状态，可影响酶的催化活性。【最适pH不是酶的特征性常数】④抑制剂对酶活性的影响（分别加入NaCl、HgCl2、空白试剂）：胰蛋白酶的抑制剂有重金属离子Hg2+，其与酶结合使酶活性降低或失活。注意事项：①在研究一种因素对酶的活性的时，需要严格的控制反应中其他因素保持不变，只能改变要研究的某一种因素。②掌握好水解程度是本实验的关键之一。③HgCl2有毒，操作时要格外小心，严防中毒。血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验原理：①以醋酸纤维素（醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点）为电泳支持物，在pH8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白全部带负电荷，在直流电场中向正极移动，移动速度与蛋白质所带电荷成正比，与颗粒大小成反比。120V电泳45min后，用氨基黑10B染色，可将血清依次分为清蛋白（最远）、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白②洗脱法定量：血清蛋白组分的相对百分数=Ax÷A总×100%清蛋白：球蛋白=A清÷﹙Aα1+Aα2+Aβ+Aγ﹚实验操作：准备→标记（粗糙面、铅笔划线）→点样（粗糙面）→电泳（点样面向下，点样端置于负极）→染色（多条薄膜时应逐条浸入）→漂洗（注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅）→洗脱定量法定量（剪下各蛋白区带→0.02mol/LNaOH洗脱→将洗脱液用分光光度计比色）注意事项：①点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。②点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。③电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。④应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。三．丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用1.实验原理：①琥珀酸脱氢酶是一种重要的脱氢酶，其辅基为FAD，在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，即无法使甲烯蓝变为无色甲烯白。②竞争抑制剂使酶的Km↑，Vmax不变，抑制程度取决于酶与抑制剂的相对亲和力&[I]/[S]。2.实验操作：酶提取液的制备→取试管6支，编号→按图步骤操作酶提取液（ml）磷酸缓冲液（ml）0.2mol/L琥珀酸（滴）0.02mol/L琥珀酸（滴）0.2mol/L丙二酸溶液（滴）0.02mol/L丙二酸溶液（滴）蒸馏水（滴）甲烯蓝（滴）试管12-8---83试管22-8--8-3试管32-8-8--3试管42--88--3试管5-28---83试管62-8---83（试管6，在酶提取液先在100℃的水浴加热煮沸5min）→各管溶液立即混均匀，沿试管壁加入液体石蜡，约0.5cm→各管置于37℃的水浴中保温，切勿摇动试管，随时观察比较各试管颜色的变化，记录褪色时间注意事项：①酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降低。②加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以避免空气中的氧气对实验造成影响，因此加石蜡时试管壁要倾斜，注意不要产生气泡。③37℃水浴保温过程中，不能摇动试管，避免空气中的氧气接触反应溶液，使得还原型的甲烯白重新氧化成蓝色。④实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体石蜡。猪肝中核酸的提取与鉴定1.实验原理：①核蛋白的提取：②从核蛋白中提取核酸：③核酸（DNA、RNA）成分的鉴定实验操作：①匀浆制备②分离抽提：将肝匀浆倒入离心管内→加入2％三氯醋酸4ml，搅拌后静置3分钟→3000转离心5分钟→倾去上清液，向沉淀中加入95%乙醇，搅匀后置于沸水中加热2min→冷却后离心5min→倾去上层酒精液，在沉淀中加入10％NaCl溶液4ml搅匀→置于沸水中加热8分钟并不断搅拌→冷却后离心（3000转每分钟，5分钟）→将上清液倒入小烧杯内→取等量的95％乙醇，逐步滴加小烧杯内，边加边摇匀→白色沉淀逐渐出现后，静置10分钟→将小烧杯内容物倒入离心管，离心（3000转每分钟，5分钟）→倾倒上清液即得到核酸钠的白色沉淀③RNA与DNA的成分的鉴定注意事项：①在离心管平衡后，对称放入离心机，切忌将没加管套的离心管放入离心机，离心完后取出离心管②避免液体洒在离心机上面或钻头上③启动离心机后，离心机如有不正常反应或噪音，应立即停止离心，并分析原因双缩脲法测定血清蛋白质含量实验原理：①血清中蛋白质的多肽的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。蛋白质+CuSO4+OH-→紫红色络合物这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。②利用吸收光谱对蛋白质进行定量分析（最大波长位于540nm处）（1）标准曲线法（2）标准管法CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX实验操作：取7支试管，编号，按照图1操作并记录。空白管标准管测定管12345蛋白质标准液-0.20.40.60.81.0-待测血清 样本 保单样本pdf木马病毒样本下载上虞风机样本下载直线导轨样本下载电脑病毒样本下载 ------1.0氯化钠溶液1.00.80.60.40.2--双锁脲试剂4.04.04.04.04.04.04.0λ光吸收值00.0850.1810.2610.3540.4380.317混匀各管，室温放置10min，以空白管调零，在波长540nm比色，读取各管光吸收值。注意事项：①须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。②样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。③用分光光度计要注意：取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污；液体的体积为比色杯的2/3-3/4;不要将比色杯放在分光光度计上；试验完成后，关闭电源，洗净比色皿。纸层析法观察转氨基作用实验原理：①氨基酸的转氨基作用实验组发生转氨基反应，最后体系中有两种氨基酸；对照组不发生转氨基反应，体系中只有一种氨基酸；②纸层析法（分配层析）：滤纸——支持物固定相——水流动相——乙醇（有机溶剂）由于混合物中的各成分的分配系数不同，分离受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度不同，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附和交换作用，最终结果是使混合物得到分离。③在固定相中分配趋势较大的组分，随流动相移动的速率较慢，不同组分在纸上移动的速率不同，用Rf表示：Rf=溶质中心到原点中心的距离/溶剂前缘到原点中心的距离物质在一定的溶剂中的分配系数是一定的，故比移值Rf可用来鉴别被分离的物质。实验操作：①肝匀浆的制备②转氨基反应：取干净试管2支，分别标明测定管与对照管，按下表操作试剂（d）　　　测定管　对照管肝匀浆　　　10　　　10　　　　　　37℃水浴10min　　沸水浴10min丙氨酸　　　10　　　10α-酮戊二酸　　　10　　　10　　　　　　　③点样（注意点样斑点不可太大，直径应小于0.5cm）④层析：在滤纸圆心处打一小孔，另取同类滤纸卷成圆筒如灯芯插入小孔；将滤纸放在培养皿上，灯芯下端浸入层析液中,待溶剂前沿距滤纸边缘约1/3处，取出滤纸。⑤显色/染色：将上述滤纸平放在培养皿上，用喷雾器向滤纸均匀喷射0.1%茚三酮溶液，再用烘烤机烘干，此时可见紫红色斑点出现，用铅笔圈下各显色点。⑥分析结果：比较色斑的位置及色泽深浅，用铅笔描出色斑轮廓,并按下表记录有关数据,分别计算丙氨酸和谷氨酸的Rf值及样品中氨基酸的Rf值，分析是否发生了转氨基反应。3.实验讨论与注意事项：1、从 表格 关于规范使用各类表格的通知入职表格免费下载关于主播时间做一个表格详细英语字母大小写表格下载简历表格模板下载 （1）中可以看出，测定管上清液点样出现了两个色斑，根据Rf值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质b为谷氨酸，则未知溶质a为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应，只有丙氨酸，所以色斑只有一个。2、层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以免污染。3、点样点不宜过大，直径小于0.5cm.血糖的测定（葡萄糖氧化酶法）1.实验原理：葡萄糖氧化酶(GOD)能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。后者在过氧化物酶(POD)作用下，分解为水和氧的同时将无色的4-氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色的醌类化合物，其颜色的深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比，在500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血糖的浓度Ps:该方法特异性高，反应条件温和，能反映血中葡萄糖的真实含量实验操作：取3支试管,编号，按下表操作。加入物(ml)空白管标准管测定管血清－－0.2葡萄糖标准液－0.2－蒸馏水0.2－－酶酚混合液2.02.02.0混匀，置37℃水浴中保温15分钟，在波长505nm处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。　【计算】血清葡萄糖(mmol/L)=(测定管吸光度/标准管吸光度)×5.55【正常参考范围】3.9～6.1mmol/L