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microRNA

149在顺铂耐药非小细胞肺癌细胞中的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达变化及相关机制研究

施凯 冯月娟 王建峰 王灿灿 郁东伟 陈学远

[Summary] 目的 探討microRNA-149（miR-149）在顺铂耐药A549细胞（A549/DDP）中的表达规律及作用机制。 方法 生物信息学方法分析顺铂耐药A549细胞中的microRNA表达变化。体外培养A549细胞并诱导对顺铂耐药的A549/DDP细胞系，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-149在两种细胞系中的表达差异。CCK-8试验及流式细胞术检测单纯miR-149 过表达以及miR-149和ABCC1同时过表达对细胞顺铂敏感性的影响。qRT-PCR及Western blot检测A549及A549/DDP细胞中ABCC1的表达差异，双荧光素酶报告试验检测miR-149以ABCC1之间的靶向关系，并利用qRT-PCR及Western blot加以证实。 结果 A549/DDP细胞中的miR-149 表达较低，与A549细胞相比，差异具有统计学意义（t=-4.65，P

[Key] 非小细胞肺癌；microRNA-149；ABCC1；顺铂；耐药性

[] R734.2 [] A [] 1673-9701（2018）30-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the expression principle and mechanism of microRNA-149（miR-149） in cisplatin-resistant A549 cells （A549/DDP）. Methods Bioinformatics methods were used to analyze microRNA expression changes in cisplatin-resistant A549 cells. A549 cells were cultured in vitro and induced to cisplatin-resistant A549/DDP cell line. Real-time fluorescence quantification PCR（qRT-PCR） was used to detect the differences in the expression of miR-149 in both cell lines. CCK-8 assay and flow cytometry were used to detect the effect of miR-149 overexpression alone and the simultaneous overexpression of miR-149 and ABCC1 on cell cisplatin sensitivity. qRT-PCR and Western blot were used to detect the difference of ABCC1 expression in A549 and A549/DDP cells. Dual luciferase reporter assay was used to detect the targeting relationship between miR-149 and ABCC1， which was confirmed by qRT-PCR and Western blot. Results The expression of miR-149 was lower in A549/DDP cells. The difference was statistically significant compared to A549 cells（t=-4.65， P<0.05）. Overexpression of miR-149 could reduce the viability of A549/DDP cells after cisplatin treatment but increase its apoptosis rate. The difference was statistically significant compared to the negative transfected control cells（P<0.05）. Compared with A549 cells， ABCC1 had high expression of mRNA and protein in A549/DDP cells， and the difference was statistically significant（t=8.44 and 5.14， P<0.05）. Overexpression of miR-149 could decrease the mRNA and protein levels of ABCC1 in A549/DDP cells. The difference was statistically significant compared to the negative transfected control cells（t=-3.14 and -4.54， P<0.05）. Dual luciferase reporter assay showed that miR-149 bound directly to the 3' UTR of ABCC1 mRNA. Compared with cells overexpressing miR-149 alone， combined overexpression of miR-149 and ABCC1 in A549/DDP cells showed increased cell viability and decreased apoptosis after cisplatin treatment， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion Insufficient expression of miR-149 may cause resistance of cisplatin to A549 cells. This mechanism is related to the inhibition of ABCC1 by miR-149.

[Key words] Non-small cell lung cancer； microRNA-149； ABCC1； Cisplatin； Drug resistance

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是常见的肺癌分型，约占全部病例的80%，且患者预后较差[1]。顺铂是NSCLC治疗的一线化疗药物，但临床应用过程中的顺铂耐药现象消弱了治疗效果，制约了化疗 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 的开展[2]。顺铂耐药现象的发生与多种原因有关，如P-糖蛋白的异常、患者基因突变、药物转运载体蛋白的结构功能缺陷、肿瘤干细胞的行为异常以及肿瘤微环境的异常等[3，4]。对顺铂耐药分子机制的研究有助于临床化疗效果的改进和疗效监测。

microRNA是一类非编码短链RNA，长度在21～26个核苷酸左右。哺乳动物中，microRNA可通过与靶基因mRNA 3端非翻译区（3-UTR）的互补结合，抑制靶基因mRNA的翻译，从而实现对靶基因的转录后调控[5，6]。研究证实microRNA的异常不但与多种肿瘤的发生发展有关，也与肿瘤对化疗的敏感性或耐药性的发生有关。有研究指出，microRNA-149（miR-149）的下调与结肠癌对5-氟尿嘧啶的耐药性有关，miR-149可以通过对FOXM1的调节增加结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性[7]。但关于miR-149是否参与NSCLC对顺铂的耐药及其机制还有待研究。ABCC1是ATP-结合盒转运蛋白超家族的成员，一般认为过量的ABCC1表达会引起肿瘤细胞的耐药，特别是多药耐药[8，9]。因此本研究探讨了miR-149与NSCLC对顺铂耐药的关系，并假设此过程中其以ABCC1为靶点，通过对ABCC1的调控来实现作用。

1 资料与方法

1.1 主要试剂

胎牛血清（美国GIBCO公司）；DMEM培养基（美国GIBCO公司）；顺铂（美国sigma-aldaich公司）；CCK-8细胞活力分析试剂盒（美国sigma-aldaich公司）；Trizol试剂（美国thermofisher公司）；Prime script RT反转录试剂盒（大连宝生物有限公司）；SYBR premix EX taq实时荧光定量试剂盒（大连宝生物有限公司）；GoScript Reverse Transcription反转录试剂盒（美国Promega公司）；双荧光素酶报告分析试剂盒（美国Promega公司）；Annexin V-FITC和碘化丙啶（美国sigma-aldaich公司）；小鼠抗人ABCC1多克隆抗体、小鼠抗人多克隆GAPDH及HRP标记的山羊抗小鼠lgG二抗（美国Santa-Cruz公司）；ECL超敏发光试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 生物信息学分析

检索Gene Expressionomnibus（GEO）公共基因数据库中的相关基因芯片数据，分析miR-149在顺铂耐药非小细胞肺癌中的表达差异。使用Target scan及miRanda数据库预测miR-149的靶基因。

1.3 细胞培养

人类肺腺癌A549细胞系购自中国科学院上海细胞研究所。通过将A549细胞暴露于逐渐增高的浓度的顺铂中可获得对顺铂耐药的A549细胞株（最大顺铂暴露浓度为1 μg/mL），该细胞株命名为A549/DDP细胞。细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5% CO2培养箱中常规培养。为维持A549/DDP细胞的耐药性，培养液中需加入0.5 μg/mL的顺铂。进行其他试验前1周，A549/DDP需培养于无顺铂的培养液中，以避免药物干扰。

1.4 细胞活力分析

细胞活力分析采用CCK-8细胞活力分析试剂盒。将A549细胞和A549/DDP细胞以4000个/孔的密度种植于96孔板中，培养24 h待细胞贴壁后，加入不同浓度的顺铂（0～20 μg/mL），继续培养48 h后，每孔加入10 μL CCK8试剂，温箱孵育1 h后使用酶标仪（Biotech Elx800）测量450 nm处吸光度。

1.5 荧光实时定量PCR

使用Trizol试剂提取A549细胞及A549/DDP细胞的总RNA样本。为检测样品中miR-149的水平，使用Prime script RT反转录试剂盒对RNA样本进行反转录，获取的cDNA使用SYBR premix EX Taq试剂盒进行扩增定量。反应体系和条件严格按照厂商说明书进行设定，内参基因使用SNORD-48。为检测ABCC1 mRNA水平，使用GoScript Reverse Transcription反转录试剂盒将RNA反转为cDNA，接着使用GoTaqRqPCR 试剂盒进行扩增定量，反应体系和条件按照说明书提供的方案进行。使用GAPDH作为内参，miR-149和ABCC1的相对表达水平通过2-△△CT计算，△CT=CT目标-CT内参。

1.6 细胞转染

通过向A549/DDP转染miR-149 mimic以提高细胞内的miR-149水平。将细胞以3×105/孔的密度种植于6孔板，当细胞汇合度到达70%时，进行转染，转染试剂采用Lipofectamine RNAiMax试剂，转染混合物的配置及用量参考厂商提供的说明书。转染All star 无关序列作为mimic阴性对照（mimic NC）。通过转染PcDNA3.0-ABCC1真核表达质粒提高A549/DDP细胞以实现ABCC1的过表达，转染试剂采用lipofectamine 2000，以PcDNA3.0空質粒为阴性对照。转染48 h后，使用qRT-PCR及Western blot对转染效果进行验证，选择转染有效的细胞进行随后试验。CCK-8试验分析转染后细胞对不同浓度顺铂处理的敏感性变化。

1.7 双荧光素酶报告试验

采用双荧光素酶报告试验验证miR-149与ABCC1的靶向关系。分别构建ABCC1 3-UTR野生型及突变型荧光素酶报告质粒，分别命名为pMIR-ABCC1-wild与pMIR-ABCC1-mut。对A549细胞实施报告质粒与miR-149 mimic的共转染，转染组合为miR-149 mimic+pMIR-ABCC1-wild、mimic 阴性对照+pMIR-ABCC1-wild、miR-149 mimic+pMIR-ABCC1-mut以及mimic 阴性对照+pMIR-ABCC1-mut。将转染后的各组细胞以1×104/孔的密度种植于96孔板，继续培养48 h，随后每孔加入100 μL裂解液，收集裂解后的上清液，取出部分上清液加入40 μL萤火虫荧光素底物，混合均匀15 s 后测定荧光强度。剩余上清液加入40 μL海肾荧光素酶底物，混合均匀后测定荧光强度，计算萤火虫荧光素强度值与海肾荧光素强度值的比值。

1.8 凋亡分析

细胞经转染处理48 h后，以3×105/孔的密度种植于6孔板，待细胞贴壁后，加入15 μg/mL顺铂，处理48 h后收集细胞，70%预冷酒精固定12 h，随后使用Annexin V-FITC和碘化丙啶对细胞进行染色，避光孵育半小时，使用流式细胞仪（GuavaR easyCyte system）分析各组细胞凋亡情况，计算凋亡率。

1.9 Western blot分析

使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取细胞中的总蛋白，BCA试剂盒测定样本浓度后，以每孔50 μg的浓度上样。电泳采用10%聚丙烯酰胺凝胶，电压为100 V。电泳完成后，90 V电压进行转膜。将转膜完成后的PVDF膜置于5%脱脂奶粉中室温封闭1 h。随后分别使用1：500的小鼠抗人ABCC1多克隆抗体、1：1000小鼠抗人GAPDH多克隆抗体进行一抗孵育，时间12 h，温度4℃。一抗孵育完成后，使用PBST洗涤3次，除去多余抗体。使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗（1：2000）室温继续孵育1～2 h，ECL超敏发光试剂盒显色并分析条带。

1.10 统计学分析

统计学分析使用SPSS19.0软件，符合正态分布的计量资料以均数± 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差表示，两组间均数的比较采用独立样本t检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-149在顺铂耐药A549细胞中的表达

编号GSE85603的芯片数据集显示顺铂耐药A549细胞中的miR-149表达水平较低，与顺铂敏感的A549细胞相比降低了2.11倍，且差异具有统计学意义（P<0.05）。体外实验显示，miR-149在A549/DDP细胞中的相对表达水平为（0.51±0.03），与A549细胞相比（1.00±0.02）显著降低，差异具有统计学意义（t=-4.65，P<0.05）。

2.2 上调miR-149可增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性

CCK-8试验的结果显示，通过转染miR-149 mimic上调miRNA-149的水平，并经不同浓度顺铂处理后，A549/DDP细胞的活力明显低于阴性转染对照细胞（mimic NC），差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。凋亡分析显示，经15 μg/mL顺铂处理48 h后，上调miR-149后A549/DDP细胞的凋亡率为（30.12±4.21）%，转染mimic NC的A549/DDP细胞凋亡率为（10.21±2.45）%，两组间的差异具有统计学意义（t=-5.25，P<0.05）。

2.3 miR-149与ABCC1的靶向关系

qRT-PCR结果显示，A549/DDP细胞中ABCC1 mRNA的相对水平为（4.31±0.52），而A549细胞中的ABCC1 mRNA的相对水平为（1.00±0.03），差异具有统计学意义（t=8.44，P<0.05）。Western blot结果显示（图1），A549/DDP细胞同时存在ABCC1蛋白水平的高表达（t=5.14，P<0.05）。上调miR-149 后，A549/DDP细胞内ABCC1的mRNA相对水平降至（0.61±0.24），而阴性转染对照细胞的ABCC1 mRNA相对水平为（1.00±0.20），差异具有统计学意义（t=-3.14，P<0.05），同时ABCC1蛋白表达也有所降低（t=-4.54，P<0.05）（图2）。

通过Target scan及miRanda数据库进行生物信息学预测显示，ABCC1可能为miR-149的靶基因。双荧光素酶报告试验显示（表2），共转染miR-149 mimic+pMIR-ABCC1-wild的细胞内相对荧光强度低于共转染miR-149 mimic+pMIR-ABCC1-mut的细胞，差异具有统计学意义（P<0.05），提示miR-149可以结合ABCC1的3-UTR區域，可以ABCC1为直接靶基因。当转染PcDNA3.0-ABCC1表达质粒实现A549/DDP细胞中的ABCC1的过表达后，可见miR-149提高A549/DDP细胞顺铂敏感性的作用被抑制。表现为与仅上调miR-149的A549/DDP细胞相比，同时过表达ABCC1的细胞在顺铂处理后的活力增加（表3），差异具有统计学意义（P均<0.05）。另一方面，仅上调miR-149的A549/DDP细胞的凋亡率为（35.41±5.21）%，同时过表达ABCC1的细胞凋亡率降至（20.11±3.98）%，差异具有统计学意义（t=4.62，P<0.05）。

3 讨论

尽管基于铂类药物的化疗方案已经广泛地应用于NSCLC的治疗，但其临床疗效仍然受限于原发或继发性的药物耐受[2]。因此充分掌握NSCLC对铂类药物耐受的机制，有助于临床治疗方案的制定和改进，从而提高治疗效果。关于NSCLC对顺铂耐药的机制，不少研究已经有所报道，主要有以下几个经典的机制：（1）细胞表面膜蛋白异常，导致药物摄取减少或泵出增多；（2）DNA修复功能过强，凋亡减少；（3）细胞代谢增强，药物被代谢酶过多清除[10，11]。近期研究发现，获得性的顺铂耐药与microRNA的失调有关[12-15]。如Su等[16]发现，miR-135b在对顺铂耐药的肺癌细胞系中存在显著低表达，恢复其水平后，该细胞系对顺铂的敏感性提高。其机制可能为miR-135b能够降低FZD1基因的表达，后者表达的产物为Wnt通过的受体，FZD1过度表达可以引起肿瘤细胞的耐药性。还有研究指出，一些microRNA的过表达可以诱导NSCLC对顺铂的耐药性。如miR-379会导致其靶基因EIF4G2的表达抑制，EIF4G2具有抑制肿瘤细胞生长、诱导凋亡的功能，因此miR-379的过表达引起EIF4G2的不足，从而导致NSCLC细胞对顺铂的敏感性降低[17]。关于microRNA与NSCLC顺铂耐药性的研究近期较为热门，涉及microRNA及其相关靶基因各不相同。但关于miR-149与NSCLC顺铂耐药的研究还较少，因此本研究将焦点集中在miR-149。

研究表明，miR-149具有抑癌作用。有研究证实其可抑制结肠癌细胞的转移和侵袭，在乳腺癌中也能发挥抑制侵袭的作用[7，18]。在脑胶质瘤中miR-149可以抑制肿瘤细胞的增殖[19]。更重要的是，有研究发现，miR-149可以增加结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性[7]，因此基于miR-149在肿瘤中的抑癌作用及涉及耐药性的相关研究，本研究推测，miR-149可能与NSCLC细胞对顺铂耐药有关。首先我们分析了公共数据库中的已发表数据，结果显示miR-149在A549/DDP中存在较低的表达。本研究也通过qRT-PCR验证了miR-149在顺铂耐药NSCLC细胞株 A549/DDP细胞中的表达，结果显示与非顺铂耐药的A549细胞株相比，miR-149在耐药株中存在低表达。通过转染miR-149 mimic提高其在A549/DDP细胞中的表达后，耐药株对顺铂的敏感性得到了提高，表现为增殖抑制增加，凋亡增加。另一方面，我们也发现ABCC1在A549/DDP细胞中存在高表达，生物信息学分析也显示，ABCC1为miR-149的潜在靶基因。因此，我们进一步推测miR-149可能通过调控ABCC1来实现对NSCLC细胞顺铂耐药性的影响。之所以关注ABCC1，是因为已经有研究指出，ABCC1与肿瘤细胞的耐药密切相关，特别是与多重耐药的发生密不可分。如有研究发现ABCC1的高表达能引起肺癌化疗敏感性的降低，其基因多态性可以作为肺癌治疗敏感性的指标。Pei等[20]证实，在小细胞肺癌中，ABCC1的过表达意味着患者对化疗的敏感性较差，提示不良预后。Liu等[21]在小细胞肺癌中发现，ABCC1可受microRNA-7的直接靶向调节，microRNA-7可以抑制ABCC1的表达从而提高小细胞肺癌对多种化疗药物的敏感性。还有研究发现ABCC1同时受microRNA-185的调控，从而参与NSCLC对顺铂的耐药调控。本研究证实A549/DDP细胞株中存在ABCC1的高表达，提示其参与顺铂的耐药，与既往研究一致。为明确其与miR-149的靶向关系，本研究设计了双荧光素酶报告试验，结果提示，在A549/DDP细胞中，miR-149可直接以ABCC1为靶点。增加miR-149的表达后，ABCC1的mRNA和蛋白水平均降低。更重要的是，当使用ABCC1表达质粒转染A539/DDP后，即使提高miR-149水平，也无法增加细胞对顺铂的敏感性。该结果提示miR-149 对顺铂耐药的NSCLC敏感性的提高有赖于对ABCC1的靶向调节。本研究未使用动物实验验证结果，这是本研究的局限性，有待于在进一步研究中解决。

总之，本研究发现miR-149可通过靶向抑制ABCC1的水平增加NSCLC细胞对顺铂的敏感性。设计可改变miR-149水平的靶向方案，具有提高NSCLC患者顺铂治疗疗效的潜力。同时，检测miR-149可能成为预测患者化疗敏感性的指标。

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