【doc】 番茄晚疫病菌的分离、扩繁及人工接种研究

【doc】 番茄晚疫病菌的分离、扩繁及人工接种研究 番茄晚疫病菌的分离、扩繁及人工接种研究 第20卷 2005正 第5期 l0月 云南农业大学 JournalofYunnanAgriculturalUniversity Vo1.20No.5 0ct.2005 番茄晚疫病菌的分离,扩繁及人工接种研究 吴涛,朱海山 (云南农业大学园林园艺学院,云南昆明650201) 摘要:研究了叶片诱导法,薯片诱导法分离番茄晚疫病菌及其在15%T-Rye,Oat,PDA这3种培养基上的扩繁效 果,同时应用苗期接种,离体叶片接种两种方法,用生理小种Tl,2,3的不同孢子囊悬浮液浓度对抗,感番茄品种 进行人工接种研究.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:(1)叶片诱导法容易分离到菌株;(2)15%T-Rye培养基最适合做扩繁培养基,病 原菌在其培养基上生长最好,产孢量最多;(3)以2000个/mL的孢子囊悬浮液接种番茄离体叶片后,根据第5d 的发病情况即可鉴别品种抗性. 关键词:番茄;晚疫病菌;分离;扩繁;人工接种 中图分类号:S436.412.12文献标识码:A文章编号:1004—390X 【2005)05—0655一o4 StudiesonIsolation,PropagationandInoculationof PhytophthorainfestansonTomato WUTao.ZHUHai.shan (CollegeofLandscapeandHorticulture,YAU,Kunming650201,China) Abstract:TheresultsofisolationofPhytophthorainfestansontomatowerestudiedbypotatodiscand invitroleaf.Theselectedmediumsofpropagationweretomatojuice—ryeme dium,oatmediumand PDAmediumrespectively.ThedifferentconcentrationsofinoculationsporangiaofP.infestanswere0, 2000,4000,6000,8000,10O00/mLonyoungplantsand0,1000,2000,3000,4000,5000,6000/ mLondetachedleavesoftomato.Theresultsshowedthat(1)itwaseasiertogetP.infestansbyin vitroleafthanbypotatodisc;(2)thetomatojuice—ryemediumwasthebeston eamongthethree media;(3)themostproperconcentrationwas2000sporangiapermillilitertodistinguishdifferentkind ofresistantvarietybydetachedleaf. Keywords:tomato;lateblight;Phytophthorainfestans;isolation;propagatio n;inoculation 番茄晚疫病又称番茄疫病,黑杆病,是由鞭毛 菌亚门,卵菌纲,霜霉目,腐霉科,疫霉属中的致病 疫霉[Phytophthorainfestans(Mont.)deBary]浸染 所致.它是一种毁灭性的世界蔬菜病害,美国,加 拿大,墨西哥,法国,澳大利亚,瑞士等国家均报道 该病危害严重?”.我国北京,山西,云南,贵州, 重庆,山东,陕西,河南,河北等省市晚疫病普遍发 生.1990—1994年云南昆明严重发生了3次晚疫 病,每次发病率都达100%.近年来,随着保护 地种植面积的增加,番茄晚疫病已成为频频发生的 周年病害.本试验研究了番茄晚疫病菌的分离,扩 繁及人工接种方法,为进一步的番茄晚疫病抗病育 种打下基础. 1材料与方法 1.1材料 植株材料:感病番茄材料:5号自交系;抗病番 茄材料:由台湾亚洲蔬菜研究中心引人的高抗晚疫 收稿日期:2005—04—12 基金项目:云南省”十五”攻关项目(2001NG21) 作者简介:吴涛(1979一),男,云南宣威人,硕士研究生,主要从事蔬菜 遗传育种研究. 656云南农业大学第20卷 病自交系CLN2037E.幼苗在人工气候箱内培养 至5,6叶时进行苗期人工接种浓度试验.生长环 境:温度:昼/夜23?/18?,相对湿度:昼/夜 65%/80%,光照时间14h/d,强度15000lx. 病原菌:由云南农业大学植物病理重点 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 真菌资源开发利用及马铃薯病害研究室分离,纯化 及鉴定的生理小种T1,2,3.在非选择性15%T- Rye培养基上培养l4,21d.在冯兰香对我国l8 个省,市,自治区分离并纯化的201个番茄晚疫病 菌株中,TI,2,3在7个省市出现,占样本总数的 8.9%.本试验人工接种所用的病原菌具有一 定代表性. 番茄栽培基质:3份灭菌的腐殖质和2份灭菌 的过筛水稻土混匀. 人工气候箱:型号:HPG-320H,哈尔滨市东联 电子技术开发有限公司生产. 1%水琼脂培养基的制备:10g琼脂溶于 1000mL蒸馏水,121oC灭菌20min,倒培养皿. 选择性15%T-Rye培养基的制备:将80g黑麦 置于400mL蒸馏水中浸泡36h,4层纱布过滤,滤 液待用;再向黑麦中加入400mL水,100oC水浴 40min,4层纱布过滤,将两次滤液混合,加入 150mL番茄原汁,加水至1000mL.依次加入蔗 糖10g,碳酸钙1.0g,琼脂15g,pH值调至6.5, 7.0,121oC灭菌20rain.冷却至大约50?时,在 超净工作台上依次加入抗生素Ampicillin250mg, Rifampicin25mg,Nystatin20mg,混匀,倒平皿. 15%T-Rye培养基的制备:同选择性15%T. Rye培养基,只是不加入抗生素. Oat培养基的制备:称取80g燕麦放于400mL 水中浸泡36h,4层纱布过滤,滤液待用;再向燕麦 中加入400mL水,100oC浸提30min,4层纱布过 滤,将两次滤液混合,加水至1000mL,再加入蔗糖 10g,碳酸钙1.0g,琼脂15g,pH值调至6.5, 7.0,121cc灭菌20min,倒平皿. PDA培养基的制备:称取洗净去皮的米拉品 系马铃薯200g,粉碎机绞碎,加水1000mL, 100oC水浴30min,4层纱布过滤,加水补足 1000mL.加蔗糖20g,琼脂17g,121?灭菌 20min,倒平皿. 1.2方法 1.2.1分离方法 叶片诱导法:在田间选取病症典型的病叶,一 片病叶装一个样品袋,袋上注明采集地点,日期和 寄主品种名称,放于冰盒迅速带回实验室.若在外 地采样,样品不能及时带回实验室时,可短时间放 于4?冰箱.在超净工作台上将病叶浸于75%酒 精中表面消毒l0,30S,灭菌蒸馏水浸洗,吸水纸 吸干水后将病健交界处剪成5,10mm小块.将 小块置人选择性15%T-Rye培养基上,封口膜密 封,l6,l8qC黑暗诱导2,4d,待菌丝长出后将其 转移至新的选择性15%T.Rye培养基上,16, 18oC培养3,5d,待菌丝形成后,再进行纯化. 薯片诱导法:取洗净的横径5,8cm的米拉品 系马铃薯,在超净工作台上表面灭菌后切成 0.5cm厚的马铃薯片.将上述的5,10mm小块 病叶置于新鲜薯片下,16,18?黑暗诱导2,3d, 待菌丝穿过薯片长出后将其移至选择性15%T. Rye培养基上,继续纯化. 纯化方法参照田亩英等人的方法,将菌落 边缘少许菌丝连同培养基一起切下,置于选择性 15%T.Rye培养基上,l8qC黑暗培养;待菌落形成 后重复操作,直至镜检确定所分离的病原菌为纯的 晚疫病菌为止. 根据菌落的分离率和分离效果来确定适于番 茄晚疫病菌分离的方法.分离率=(分离菌落数/ 接种病斑数)×100%,分离效果=(番茄晚疫病菌 落数/分离菌落数)×100%. 1.2.2病原菌扩繁培养基的筛选 用于病原菌扩繁的培养基有非选择性15%T. Rye培养基,Oat培养基,PDA培养基.把16, 18?黑暗培养14d的纯病原菌用6.0mm打孔器 打取菌片,分别移到上述的3种培养基上,每皿中 央放1块菌片,9次重复,第7d,14d观察菌落直 径,然后用20mL灭菌蒸馏水淋洗培养基上的菌 丝,用血球计数板计算孢子囊浓度.根据菌落直 径,孢子囊浓度来确定适宜番茄晚疫病菌生长的培 养基. 1.23人工接种晚疫病菌的适宜孢子囊浓度筛选 (1)苗期人工接种孢子囊浓度筛选 人工接种孢子囊浓度梯度:2000个/mL, 4IX10,mL.6000,mL.8IX10,mL10000, mL,蒸馏水为对照.用微量移液枪吸取10孢子囊 悬浮液,各接种于番茄幼苗所有展开的4,nfnf背主脉 两侧,每个处理10株.接种后置于相对湿度为95%, 温度为20?的人工气候箱中,黑暗保湿36h后,打开 第5期吴涛,等:番茄晚疫病菌的分离,扩繁及人工接种研究657 光照,光照时间14h/d,光强120O0lx接种后第3d, 第5d,第7d观察病情.找到一个使感病品种感病, 而抗病品种不感病或轻微感病(形成限制性病斑)的 孢子囊悬浮液浓度,则该浓度即为番茄晚疫病苗期抗 性鉴定的最适孢子囊浓度 番茄晚疫病发病情况分级标准参照王添成的 《番茄晚疫病研究训练 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 》,采用0,6级病情 严重度(diseaseseverityrating,DSR)计算. (2)人工接种离体叶片准备 从田间采取5号自交系,CLN2037E番茄植株 完全展开,生长一致且健康的小叶,灭菌水冲洗后 用吸水纸洗干水,叶背朝上,置于lr/r水琼脂培养 基上.每个9em培养??放3片4,uf.. (3)离体叶片人工接种孢子囊浓度筛选 孢子囊浓度浓度梯度:1000个/mL, 2000/mL.3000/mL.4000/mL.5000 mL,6000个/mL,蒸馏水为对照接种方法同前, 每个处理6皿,用封口膜密封培养皿接种后放于 气候箱内,温度20c【=,黑暗培养36h后,打开光 照,光照时间14h/d,光强3000Ix:接种后第3d 开始记录发病情况,直至感病处理l00%发病时停 止记录.找到一个使感病品种感病,而抗病品种不 感病或轻微感病(形成限制性病斑)的孢子囊悬浮 液浓度,则该浓度即为番茄晚疫病离体叶片抗性鉴 定的最适孢子囊浓度;同时找适宜的观察时间. 2结果与分析 2.1诱导分离 表1叶片诱导法,薯片诱导法的分离效果 Tab.1Resultsofisolationofinvitz?oleafmethod andpotatodiscmethod 内容美 从表1可以看出,叶片诱导法的分离率和分离 效果各为100%和66.7%,皆大于薯片诱导法的 66.7%和50.0%.采用叶片诱导法容易分离到菌 株,菌丝生长良好,但要求标本新鲜且病症典型. 薯片诱导法要注意保持薯片水分.两者均要求及 时把诱导出的菌丝转移至选择性15%T—Rye培养 基上进行纯化. 2.2适宜的扩繁培养基 本试验的主要目的是为进一步的番茄晚疫病 抗性鉴定做前期准备,进行抗性鉴定需要大量的具 有侵染力的病原菌孢子囊,因此找到一种适宜的培 养基可以大量繁殖病原菌是后期鉴定l丁作的前提. 试验中,病原菌在3种培养基上都能生长,但以 15%T—Rye培养基为最好,产孢量也最多;在Oat培 养基上的生长情况比15%T—Rye培养基稍差,孢 子囊较瘦小,但由于Oat比Rye更容易获得,所以 Oat培养基可用于保存晚疫病菌.PDA培养基效 果较差,不适宜扩繁用(见表2). 表2晚疫病菌在3种培养基上扩繁培养的效果 Tab.2ResultsofmediumOllmyceliumandspol’angia 2.3苗期人工接种后病情比较 抗性鉴定需要确定适宜的孢子囊悬浮液浓度 及观察时间,本试验中所用的植株材料CLN2037E 经多年多点试验鉴定后认为是抗病材料,5号母 本彳F田间表现感病.两个抗,感番茄品种的幼苗人 工接种晚疫病菌后第2d不能观察到有病斑形成, 第3d才开始发病;随着孢子囊浓度的增加,病情 严重度逐渐增大.感病品种一开始发病就较重且 病斑扩展速度快.接种后第7d有95%的叶面积形 成病斑,湿度大时,可见到明显的白色菌丝;抗病品 种存4000个/mL浓度及以下时,开始发病较轻, 病斑扩展慢(见表3).根据试验结果,苗期人工接 种可用4000个/mL的孢子囊悬浮液作为接种浓 度,记录接种后第5d的发病情况,若DSR为0, 2.5表示品种抗病,2.6,4.5表示中抗,4.6,6.0 表示感病:. 2.4离体叶片接种后病情比较 离体叶片接种法是番茄晚疫病抗性鉴定方法 中的重要方法之一..本试验中,离体叶片人 丁接种晚疫病菌后第3d开始发病.相同时间内, 离体叶片接种法发病严重度较苗期接种的高.感 658云南农业大学第20卷 病品种离体叶片一开始发病就比抗病品种的重,病 斑扩展迅速;在接种孢子囊浓度为2000个/mL 时,接种后第5d即有90%的叶面积形成病斑(见 表4),镜检可观察到有孢子囊产生.接种后第 7d,除对照和处理1000个/mI外,其它处理 100%发病.可用2000个/mL的孢子囊悬浮液作 为接种浓度,记录接种后第5d的发病情况,据此 鉴定番茄品种的抗性. 表3苗期人工接种的发病严重度 Tab.3Thediseaseseverityrating(DSR)oftomato seedlingafterinoculatedsporangia 表4离体叶片人工接种的发病严重度 Tab.4ThediseaseseverityratingfDSRof detachedIeafaftel’inoculatedsporangia 本试验中,以2000个/mL的孢子囊悬浮液接 种番茄离体叶片后,根据第5d的发病情况即可鉴 别感,抗品种. 3小结与讨论 通过2种分离方法,3种扩繁培养基筛选及2 种人工接种方法在不同孢子囊悬浮液浓度条件下 对感,抗番茄材料的抗性鉴定,筛选出一套简单易 行的分离,扩繁,人工接种晚疫病菌的试验方法:番 茄晚疫病菌的分离要注意采集病症典型的病叶,要 求样本新鲜.病原菌在15%T—Rye培养基上生长 良好,产孢量多.苗期接种所用的孢子囊悬浮液浓 度为4000个/mL,根据第5d的发病情况进行抗 性鉴定;离体叶片接种所用的孢子囊悬浮液浓度为 2000个/mL,也根据第5d的发病情况进行抗性 鉴定,若DSR为0,2.5表示品种抗病,2.6,4.5 表示中抗,4.6,6.0表示感病. 为保持晚疫病菌的侵染能力,在培养基上培养 了1,2年后,应接种于易感番茄品种植株上再重 新分离.在对番茄晚疫病抗性进行鉴定时,苗期接 种与离体叶片接种两种方法结果相近,但两者所用 孢子囊悬浮液浓度及发病情况有差异薛敏菊的 研究结果也表明,在相同时间内,离体叶片接种法 发病较苗期接种严重,病斑扩展速度更快.离 体叶片接种法对于还要进行后期l丁作(如测量株 高,产量,品质等)的试验来说,是要优先考虑的方 法.并且,离体叶片接种法可在培养箱内进行,脱 离田问或接种室环境,温湿度易于控制,试验结果 更准确.另外,在人丁接种病原菌进行抗病性鉴定 时,应注意严格控制相关的温度,湿度,方法等. 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(3)红波罗花褐斑病为花卉栽培上的一种新 病害,国内外均未见研究报道J,目前无抗病品种 作为控制病害流行的替代品种.进一步研究病害 的发病规律,找出病害发生与栽培密度,连作时问, 施肥管理措施的关系,筛选有效农药控制病害的发 生流行很有必要. [参考文献] [1]王文采.中国植物志[M].北京:科技m版社,1990. [2]赵清盛.横断山角蒿属植物研究[J].大自然探索, 1988,4(12):170—174. [3]suTroNBC.TheCoelomycetes[M].England:C.M. I.1980. [4]魏景超.真菌鉴定 手册 华为质量管理手册 下载焊接手册下载团建手册下载团建手册下载ld手册下载 [M].上海:上海科技出版社, 1979. [5]张中义.植物病原真菌学[M].成都:四川科学技术 出版社,1988. [6]SACCARDOPA.SyllogeFungorum(1—4)[M].Ita- ly.,1886. [7]白金铠.中国真菌志[M].北京:科学}n版事1:,2003. [8]戴芳澜.中国真菌总汇[M].北京:科学出版礼, 1979 (上接第658页) 4] [5] [6] [7] [8] PETERRD,PLATrHW,HallP.Hypothesesforthe inter—regionalmovementofnewgenotypesofPhytophthora infestansinCanada[J]CanaPlantPathol,1999,21: 132—136. 张绍松,宋令荣,王芳,等.诱发番茄晚疫病流行的气 象条件[J].西南农业,1997,10(1):l19—122. 冯兰香,杨宇红,谢炳炎,等.中国18省市番茄晚疫病 菌生理小种的鉴定[J].同艺,2004,31(6):758— 761. 田亩英,冯兰香,龚会芝,等.番茄晚疫病菌的分离和 纯化[J].植物保护,2000,26(5):36. 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