gyrB基因在细菌分类和检测中的应用

gyrB基因在细菌分类和检测中的应用 江西农业2010,22(4):18—20 ActaAgricuhuraeJiangxi gyrB基因在细菌分类和检测中的应用 安然,易图永,肖启明,邓子牛 (1.湖南农业大学生物安全科学技术学院,湖南长沙410128;2.湖南农业大学柑橘研 究中心,湖南长沙410128) 摘要:gyrB基因是普遍存在于细菌内编码DNA促旋酶中B亚单位蛋白的基因.综 述了该基因近年来在细菌系统发育 分析,细茵鉴定及临床医学应用的研究进展,并展望了其广阔的应用前景. 关键词:gyrB基因;细菌;分类;鉴定 03 中图分类号:Q939文献标识码:.A文章编号:1001—8581(2010)04—0018— ApplicationofgyrBGeneinBacterialClassificationandDetection ANRan,?Tu—yong,XIAOQi—mi嚷,DENGZi—niu (1.CollegeofBio— safetyScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.CitrusResearchCenter,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China) Abstract:gyrBgeneiscommonlyfoundinbacteria,encodingDNAgyraseB— subunitprotein,andisveryimportanttothetran— scriptionandreplicationofbacteria.TheauthorsummarizedtheapplicationofgyrBgeneinth ephylogeneticanalysis,classification anddetectionofbacteriainrecentyears,anddiscussedtheprospectsofgyrBgeneapplication. Keywords:gyrBgene;Bacterialclassification;Bacterialdetection 细菌的分类和鉴定经历了漫长的研究阶段.随着分 子生物学的发展,以细菌的形态学,生物化学等为特征鉴 定细菌的传统方法,逐渐被一种以可 翻译 阿房宫赋翻译下载德汉翻译pdf阿房宫赋翻译下载阿房宫赋翻译下载翻译理论.doc 核苷酸序列为 基础的可定量,较精确的分析方法所取代.自1986年 Mullis等发明PCR技术以来,各种基因分类方法相继 诞生,如(G+C)含量测定,DNA—DNA分子杂交,rRNA 指纹图谱,质粒图谱和16SrDNA序列分析等. 1987年,Woese首次运用核糖体RNA序列分析技术 对细菌进行系统发育分类的研究.rRNA是研究细菌 进化和亲缘关系的重要指标之一,其基因组可分为保守 区和可变区,在细菌中具有高度保守性.原核生物的 rRNA可分为5s,16s,23S三大类,其中16SrDNA序 列分析已成为细菌种属鉴定和分类的标准方法,大约 有2500个种的16SrDNA全序列已经被报道.然而,这 种基于核苷酸序列的细菌分析方法存在一定的局限性. 第一,由于16SrDNA具有高度保守性,且分子小,包含 的信息量较少,对于亲缘关系较近的细菌,其分辨率不 高;第二,16SrDNA序列分析只能在属的水平上区分细 菌,而在水平分类这个环节上仍然需要借助其他手段加 如DNA—DNA杂交,且结果也不稳定. 以辅助分析, 正是由于用16SrDNA进行研究时存在上述的一些 限制,研究者们开始尝试着用其他的保守染色基因来取 代l6SrDNA基因序列.随着研究的不断深入,人们发 现非蛋白编码基因与蛋白编码基因不同,它们在进化过 程中受到不同的限制.由于密码子具有兼并性,蛋白编 码基因的DNA序列与所编码的蛋白相比可具有更多的 变化.也就是说,与非编码蛋白基因相比,基于蛋白编码 的基因可以提供更为详细的遗传信息. gyrB基因就是蛋白编码基因的典型代表,与l6s rDNA相比,它更具优越性.gyrB基因存在于大多数细 菌中,并且不会发生频繁的水平转移,在不同的蛋白及蛋 白的不同位点,其氨基酸替代率也不相同.因此,gyrB 基因在细菌的系统发育学,特别是在近缘种和菌株的区 分及鉴定方面受到高度关注.作为细菌分类和鉴定研究 中的一个热点,以下就gyrB基因的一些特性及其在细菌 分类鉴定方面的作用作一简要的概述. 1grrn基因 gyrB即促旋酶(gyrase)的B亚单位基因,属于信息 通路中与DNA复制,限制,修饰或修复有关的蛋白编码 基因.在大多数细菌中,以单拷贝的形式存在细菌基因 组的rnpA—rmpH—dnaA—dnaN—recF—gyrB—rnpA基 因簇中,编码的是唯一一种能诱导DNA负超螺旋的拓 扑异构酶一DNA促旋酶的B亚单位蛋白GyrB.DNA 促旋酶是一种细菌?型拓扑异构酶,在DNA复制及DNA 超螺旋结构的维持过程中起着重要的作用. gyrB基因序列全长约为1.2—1.4kb,平均碱基替 换率为每100万年变化0.7%一0.8%,比l6SrDNA的 每5000万年变化1%的速度快.另外,由于其作为蛋 白编码基因,其所固有的遗传密码子的兼并性使得DNA 收稿日期:2010—02—04 基金项目:湖南省自然科学基金项目"湖南省柑橘溃疡病病菌遗传多样性及抗药 性的研究"(07JJ6062). 作者简介:安然(1985一),男,湖南衡阳人,硕士研究生,主要从事植物与病原物互作 方向的相关研究.通讯作者:易图永. 4期安然等:gyrB基因在细菌分类和检测中的应用19 序列可以发生较多的变异而不改变氨基酸序列,尤其是 密码子的第3位碱基,这就使得gyrB基因序列在区分 和鉴定细菌近缘种方面,比非蛋白编码基因16SrDNA 具有更高的分辨率. 目前,gyrB在研究细菌的系统发育和鉴定细菌亲缘 种方面得到了广泛的应用.日本已建立了细菌鉴定与分 类数据库(IdentificationandClassificationofBacteria, ICB),可提供关于gyrB序列的数据.同时,Kasai在对 小单孢菌属(Micromonospora)15个有效描述的种和4个 亚种的gyrB序列的研究中,得到了与基于16SrDNA序 列相似的系统发育关系,但种内关系结果不同.经过与 DNA—DNA杂交的比较分析,结果表明:基于gyrB序列 的分类关系更符合DNA—DNA杂交结果.Dauga 在利用gyrB基因比较肠杆菌科(Enterobacteriaceae)不同 属的系统进化关系时发现,与16SrRNA相比,gyrB序列 比较适用于属内或属间关系的比较分析. 以gyrB基因为靶标不但可以区分不同近缘种,同时 还可根据gyrB序列 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 特异性引物进行定量PCR分 析,并结合多重,巢式PCR对待检测细菌进行鉴别和分 类.与DNA杂交相比,该基因靶标同样适用于对新菌种 的鉴定工作.这也为在临床医学等不同条件下研 究和鉴定细菌新的近缘种带来了新的方法. 2gyrB基因在细菌系统发育中的应用 在系统发育研究领域发生 自20世纪80年代以来, 了一系列深刻的变革.从以往的比较形态学研究开 始转向核酸,免疫学研究,然后发展到氨基酸序列研究, 直到现在利用DNA序列来重建系统发育关系. 在系统发育学研究中,作为系统发育分析对象的一 些基因片段被称之为系统发育标记(PhylogeneticMark— ers).目前作为系统发育的靶标以16SrDNA为主,不过 随着分子技术的不断发展,一些其他新靶标序列将被相 继发现.gyrB基因作为细菌系统发育的"新生力量"而 开始逐渐被人们所熟悉和利用.Wang等在对8个枯 草芽孢杆菌群的系统发育研究时发现,当使用16SrDNA 作为靶标分子时,只能将其区分为2个亚群,亚群内16s rDNA序列相似度多在98%以上,无法准确的区分,而 gyrB基因序列在这2个亚群中的相似度分别为75.4% - 95.0%和88.5%,99.2%,结果显示:gyrB基因可以 在种的水平上清晰鉴定不同的种,更重要的是gyrB基因 的相似性与DNA杂交结果有很好的线性关系.同样 的结论在IJa等?的研究中被证实,他们在比较4种不 同种属的芽孢杆菌的研究中发现,基于gyrB序列的系统 发育树可明显分为4组,而l6SrDNA却无法有效地将 它们区分开.Kasai等副在根据对放线菌,假单胞菌和 分枝杆菌等细菌的系统发育研究时发现,gyr/~基因符合 蛋白类编码基因作为分类鉴定和系统发育分子标记的要 求,特别是gyrB序列分析对高(G+c)含量的G细菌在 种水平上的分类很有用. 另外,由于生物在进化的过程中某些碱基会发生一 些随机的改变,尽管这只是一些极小的改变,但理论上这 种随机改变对进化速度的影响不能完全从分子发生系统 中消除,并且这些差别不能体现在2个进化树框架的 比较中.因此,为了更精确地对细菌进行分类和鉴别,一 些分类学家开始将gyrB基因与其他靶基因结合进行分 析,以获得更精确的系统发育图谱,如gyrB与rpoD序列 共同分析.Soler等.加用gyrB和rpoD序列分析气单胞 菌属(Aeromonas)的系统发育时发现,这2个基因具有相 同的置换率(小于2%)和相似的变异位点(分别为34% 和32%),分别用gyrB,rpoD或结合这2个基因的序列分 析的结果均与已有分类结果一致.可见,在种内水平上, gyrB对相近的种具有很高的分辨率,rpoD能把混杂在一 起的种区分开来,综合这2个基因的序列分析能更好地 区分相近的分类单元. 3以gyrB序列为基础的细菌快速检测技术 随着分子生物学技术的发展,利用基因型鉴定菌株 的方法已被广泛地应用.建立通用,快速的细菌检测方 法的关键在于寻找合适的靶分子,这种靶分子既要有一 定的保守区域,可以实现不同细菌间的通用扩增,又要有 一 定的变异性,可以进行后续的种间鉴别实验.1995 年,Yamamoto等根据大肠杆菌(Ecoli),恶臭假单胞 菌(Pseudomonoasputida),枯草芽孢杆菌(Bacillussubti- lis)的GyrB亚蛋白两端的保守氨基酸序列设计兼并引 物,并对不同种群的细菌进行扩增,研究结果表明:这组 引物可以扩增(G+C)含量低的革兰氏阳性细菌,大部分 革兰氏阴性细菌和某些革兰氏阳性细菌.另外,其他的 研究者在Yamamoto所扩增的序列特征的基础上,设计 出能明显区分恶臭假单胞菌(Pseudomonoasputida)的引 物,并以此为基础建立了快速鉴别自然环境中微生物近 zuirfi等通过分析9株变形假单胞菌 缘种的方法.L (Pseudomonoasplecoglossicida)和2株其他类群假单胞菌 的gyrB序列,设计出特异性引物,并对肠道和肾脏样品 进行PCR分析,结果表明,此种方法可以快速检测由变 形假单胞菌引起的细菌性疾病22.目前,gyrB序列分析 在蛭弧菌属(Vibrio),芽孢杆菌属(Bacillus),巴氏肺炎球 菌(Pasteurellapneumotropica)和苯酚分解菌等相近菌株 的分类问题上效果明显J. 3.1结合多重PCR鉴定苛养木杆菌Rodrigues等拼 结合16SrDNA和gyrB基因对苛养木杆菌(Xyldlaf~tid- iosa)进行了多重PCR分析,结果显示:在植物坏死细胞样 品DNA的多重PCR结果中,仅仅检测出gy基因区段的 目的条带,而且该方法可以检测出田间收集的植物,携带 病源的昆虫以及已经感染但未表现症状的植物中的苛养 木杆菌.此方法具有简单,快速,应用性较强的特点. 3.2gyrB基因在定量PCR中的应用gyrB基因由于 20江西农业22卷 近乎是以单拷贝的形式存在于细菌中,因此基于gyrB基 因为靶标的分析方法,可以应用到定量分析近缘种的含 量中去J.蔡潭溪等根据gyrB基因序列设计引物, 建立了一种基于LightCyele平台的快速,定量检测副溶 血弧菌的方法,研究表明:基于TaqMan的探针可特异性 地针对副溶血弧菌产生扩增曲线,对细菌的定量检测可 达到1CFU/PCR反应体系,其ct值和初始细胞数的对 数的相关系数为一0.99,并且RTPCR定量分析结果与 平板计数结果也具有良好的相关性(=0.98). 3.3结合PCR—RFLP进行细菌鉴定Gulati等对 分别来自印度,法国,德国和美国的81株不同血清型的 Yersiniaenterocoliticabiovar1A进行了gyrBPCR—RFLP 结果显示,gyrB基因可将它们分为2群,分别将各 分析, 群中的致病菌和非致病菌分为若干亚群.另外,该结果 与l6SrDNA和16S,23SrDNA转录间隔区(ITS区) 的序列多态性分析结果一致,这为该菌的鉴定提供了很 好的依据. 3.4结合DGGE技术分离和鉴定细菌Moura等"以 gyrB序列设计特异性引物,对从虹鳟鱼皮肤,肾脏以及 在水中分离的气单胞菌进行了PCR扩展,再将扩展结果 进行了DGGE分析.结果表明:gyrB—DGGE技术能有 效地追踪复杂环境样品中微生物的动态变化. 4gyrB在临床医学上的应用 在临床细菌检测中,往往需要检测一些混合感染的 复杂样品,而传统PCR检测方法由于受引物的限制,每 次只能鉴定1种细菌,这种一对一的检测方法极大地降 低了工作效率.有研究者发现,通过gyrB序列与生物芯 片技术相结合可以实现多种目标基因的同时检测. Fukushima等的研究结果显示:基于gyrB基因的基因 芯片技术可从种的水平上鉴别分支杆菌,并能将结核分 支杆菌与密切相关但临床意义不同的菌种相区别.这对 临床治疗具有重要的参考价值. 同时,gyrB与微阵列基因技术相结合的系统发生核苷 酸微阵列,在细菌分类和鉴定方面的发展和应用也得到了 广泛的研究.该技术可以在较短时间内为患者的诊疗提 供指导信息,为临床合理用药提供依据.邓晔等在第3 代功能基因微阵列(FGAIII)中设计了gyrB基因探针,单独 制备了gyrB微阵列,并在随后的实验中验证了gyrB微阵 列对混合的基因组DNA和PCR产物的灵敏性和特异 性.gyrB基因微阵列检测方法的敏感性不低于基于 PCR扩增的方法,并且错误较少,特别是可以对一个样 品同时分析几种细菌,可以明确是否双重感染.gyrB基 因微阵列不仅可以用来快速鉴别菌种,而且为应用于临 床诊断的耐药性基因表型特征研究开辟了新视角. 5展望 综上所述,以gyrn序列为基础的系统发育分析,分 类鉴定细菌等微生物的研究得到了广泛的应用,并且相 关数据库ICB也在逐渐壮大.但是,要想获得更精确的 分子标记和更简便准确的分析方法仍然需不断的研究和 探索.随着测序技术的发展,细菌全基因组序列的分析 和比对研究逐渐变得较为容易,系统发育分类将依据对 大量细菌进行序列分析,然后进行比较或是通过能够反 映序列变异的高通量的芯片方法进行深入研究. 另外,以gyrB序列为靶标建立的快速,准确的鉴定 技术也在食品病原微生物的鉴定中得到了应用,提高了 人类的饮食质量,保障了人类的饮食健康.但是,目前以 编码蛋白基因的研究多局限于细菌当中,而在真菌鉴定 的研究中很少涉及,因此,为了能更加准确地认识和利用 微生物,就必须取长不短,以开放的思路打破非蛋白编码 基因的传统模式,探索更多,更有效的综合研究方法. 参考文献: [1]MullisKB,FaloonaFA.SpecificSynthesisofDNAInVitroVia aPolymeraseCatalyzedChmnReaction[J].MethodsEnzymo1., 1987,(155):335,350. [2]WoeseCR.BacterialEvolution[J].Microbio1.Rev.,1987,51 (2):221—271. 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