[指南]琼脂糖微球的制备及活化条件研究

[指南]琼脂糖微球的制备及活化条件研究 摘要 一般说来，琼脂糖磁性微球活化度越高，能连接的亲和配位体就越多，用其吸附纯化蛋白质及固定化酶效率就越高。本实验研究了用环氧氯丙烷活化琼脂糖磁性微球的最优条件。实验先用反相悬浮包埋法制备出琼脂糖磁性微球，微球因内部含有磁性四氧化三铁的超细粉末而具有磁响应性。以微球 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面的环氧基密度作为活化度的度量，考察了NaOH浓度、环氧氯丙烷体积分数、NaBH的浓度、活化温度和活化时间等因素对琼脂糖磁性微球活化反4 应活化度的影响，得到了最佳活化条件为:NaOH溶液浓度为0.9mol/L，环氧氯丙烷体积分数为40%，NaBH的浓度为0.5g/L，活化温度为40?，活化4 时间为4h。用环氧氯丙烷活化的载体稳定性好，且可提供相当于3个碳原子间距的空间臂。本文还研究过相似活化步骤和条件下，改用1,4-丁二醇二缩水甘油醚做活化剂，但未能成功活化琼脂糖磁性微球，该研究尚待进一步开展。 关键词:琼脂糖 磁性微球 活化 Abstract Generally speaking, the higher the activation degree of agarose magnetic microspheres is, the more affinity ligands can be grafted. So that the adsorptive capacity of microspheres for protein purification and the efficiency of immobilized enzyme can be higher. This paper investigated optimal conditions for the activation of agarose magnetic microspheres, using epichlorohydrin as activating agent. Firstly, agarose magnetic microspheres were prepared by reverse suspended embedding method. The microspheres possessed magnetic responsibility because of the interior FeO ultrafine powder. The effects of 34 sodium hydroxide concentration，epichlorohydrin volume fraction，NaBH 4 concentration，activation temperature and activation time on activation degree were investigated，according to the density of surface epoxy group . The optimal conditions are obtained as followed:sodium hydroxide concentration， epichlorohydrin volume fraction， NaBH concentration ，activation temperature 4 and activation time is 0.9 mol/L, 40%, 0.5 g/L, 40 ?, 4 h, respectively. The carrier activated by epichlorohydrin can be of good stability and has 3 carbon atom space arm. This paper also studied the activation of agarose magnetic microspheres using 1, 4-butyl glycol two glycidyl ether as activating agent. The experiments in which agarose magnetic microspheres were failed to be activated were operated under similar methods and conditions. The relevant researches are yet to be further developed. Keywords:Agarose; magnetic microspheres; activation 目录 摘要 ...........................................................................................I ABSTRACT ............................................................................ II 目录 ........................................................................................ IV 第一章 文献综述 .................................................................. 1 1.1固定化酶技术的研究意义 ............................................ 1 1.2固定化酶载体基质 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ................................................ 2 1.2.1固定化酶载体基质材料性质要求 .......................... 2 1.2.2固定化酶载体材料研究进展 .................................. 2 1.3固定化酶载体的表面修饰 ............................................ 3 3 1.3.1固定化酶载体表面修饰原则 .................................. 1.3.2固定化酶载体表面修饰环氧基 .............................. 4 1.4固定化酶载体的间隔臂 ................................................ 6 1.5固定化酶载体的配位体 ................................................ 7 1.6 展望 ................................................................................ 7 1.7本论文研究内容及意义 ................................................ 8 第二章 琼脂糖微球的制备 .................................................... 9 2.1实验试剂及仪器 ............................................................ 9 2.1.1实验试剂 .................................................................. 9 2.1.2实验仪器 .................................................................. 9 2.2实验方法及步骤 .......................................................... 10 2.3实验结果及讨论 .......................................................... 10 第三章 琼脂糖磁性微球活化条件研究 .............................. 12 3.1微球活化方法论证 ...................................................... 12 3.2环氧基分析方法论证 .................................................. 12 3.3实验试剂及仪器 .......................................................... 13 3.3.1实验试剂 ................................................................ 13 3.3.2实验仪器 ................................................................ 14 3.4实验方法及步骤 .......................................................... 14 3.4.1琼脂糖磁性微球的活化 ........................................ 14 3.4.2琼脂糖磁性微球环氧基修饰密度的分析 ............ 15 3.5实验结果及分析 .......................................................... 15 3.5.1活化后琼脂糖磁性微球的性质 ............................ 15 3.5.2琼脂糖磁性微球活化条件探究结果分析 ............ 16 3.5.2.1 氢氧化钠溶液浓度的影响 .................................... 16 3.5.2.2 环氧氯丙烷体积分数的影响 ................................ 17 3.5.2.3 硼氢化钠的浓度的影响 ........................................ 18 3.5.2.4 活化温度的影响 .................................................... 19 3.5.2.5 活化时间的影响 .................................................... 20 第五章 全文总结及展望 ...................................................... 22 5.1全文总结 ...................................................................... 22 5.2展望 .............................................................................. 22 参考文献 ................................................................................ 24 致谢 ......................................................... 错误～未定义书签。 附录:外文文献翻译............................................................... 27 第一章 文献综述 1.1固定化酶技术的研究意义 酶作为生物催化剂，因具备底物特异性、位置特异性、立体特异性等催化特点，且催化过程中具有极高的选择性、催化反应、条件温和、无污染等诸多优点，所以在油脂加工、去污剂与脱脂、食品加工与饲料、精细化工、医药、造纸业、化妆业、皮革加工、生物柴油、生物降解等诸多领域有着广 [1]泛的应用。然而，要把酶投入到生物化工工业中，酶的稳定性、活性和复用性亟待提高。因此固定化酶一直是酶技术的热门研究课题。人们提出了很多固定化酶的方法，比如物理吸附法、共价结合法、聚合物包埋法、交联法、 [2]氨基酸置换法和抗体偶联法等。 酶的固定化是指将酶束缚于一定的区域内，能连续进行其特有的催化反应，并可回收和重复使用的一类技术。其实固定化酶可以看作是通过化学或物理的处理方法，使原来水溶性的酶与固态的水不溶性支持物相结合或被载体包埋。因此，酶固定化的广泛概念应为:利用物理或化学方法处理，将游离酶限定或束缚于一定范围之内使其与整体流体分开，但仍能发挥催化作用 [3]的酶制剂。该过程将酶从单相催化剂形态转变为复相催化剂形态。制备固定化酶的过程被称为酶的固定化。经过固定化，酶具有了比原来水溶性游离酶更多的优点: (1)固定化酶对热、pH等的稳定性有较大提高，有的酶具有了抗蛋白酶分解的特性; (2)反应完成后经过简单分离，酶就可与底物、产物分开并回收，而且酶活力降低较少; (3)固定化体系适合于连续化、自动化生产，可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应，催化过程容易控制，后处理过程简单，提高了酶 、[45]的利用效率，降低了生产成本。 1.2固定化酶载体基质材料 1.2.1固定化酶载体基质材料性质要求 作为固定化酶的一部分，载体材料的结构和性能对固定化酶的各种性能都有着巨大的影响。优良的亲和基质应满足以下几点要求: (1)载体材料应带有能与酶发生反应的官能团，如-OH、-COOH、-CH等反应性基团，这样可大大提高载体材料与酶之间的结合力，同时亦可提高固定化酶的操作性和稳定性; (2)好的载体材料应具有大的比表面积和多孔结构，从而易和酶相交联，并可提高固定化率; (3)一般来说，载体材料要求是不溶于水的。这不仅可防止酶失活，还可防止酶受到污染; (4)机械刚性及其稳定性是载体材料非常重要的性质。由于固定化酶的一个最大的特点是要能重复使用，这就要求载体材料的机械刚性和稳定性都非常好; (5)材料的粒径越小，其比表面积就越大，与自由酶固定化程度就越高，固定化率也就越高; (6)在长时间的使用中，载体材料必须要能防止微生物的降解作用; (7)再使用性。 此外，随着人们对公共卫生和环境保护的日益关注，要求载体材料无毒、 [6]可降解;而从成本上来考虑，还要求载体材料经济、来源丰富。 1.2.2固定化酶载体材料研究进展 最早使用的基质是以琼脂糖为代表的多糖类软胶。Polson(1961)最先对粒状琼脂糖凝胶优良的性质作出高度评价。在适当条件下，琼脂糖凝胶既 [7]可对交联葡聚糖不能分离的高分子进行分离，又具有良好的机械稳定性。 现在常见的琼脂糖凝胶柱有Sepharose CL-4B，6B等。目前，多糖类凝胶仍是应用最广的亲和纯化基质。 近年来新兴的新载体材料为复合载体材料。其是以有机材料和无机材料复合组成的。以磁性高分子微球作为典型代表。它是一种内部含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末从而具有磁响应性的高分子微球。磁性高分子微球可以通过共聚、表面改性等化学反应方法在微球表面引入多种反应性功能基团(如:-OH、-COOH，-NH、-COH等)，也可以通过共价键来结合酶、细2 胞、抗体等生物活性物质。因其内部有磁性物质存在，在外加磁场的作用下，可快速有效地富集、分离、回收和再利用。与其它载体材料相比，磁性高分子微球作为固定化载体具有从反应体系中易分离和回收、操作简便、成本较 [7]低等诸多优点，因此引起了国内外许多学者的广泛关注。 人们已经成功用化学共沉淀法、沉淀氧化法、超声沉淀法、生物合成法、电热化学法、与天然生物大分子、合成高分子反应，辐射聚合、ATRP/DPE [8]可控制备法、与无机物反应的方法制备出纳米级的磁性复合微球。 另外其他载体材料的研究和开发也取得了可喜进展。如Ding Lianggi等[9]对聚苯乙烯这种有机高分子载体的亲水性改性，并用其固定化木瓜蛋白酶; [10]Suye则将葡萄糖氧化酶固定在改性聚碳酸酯膜上(膜预先用氨基甲酸乙酯和L-赖氨酸改性，并用戊二醛活化)。这种固定化酶的热稳定性和 pH稳定性大大优于天然酶。这种载有酶的膜常用于葡萄糖传感器。 1.3固定化酶载体的表面修饰 1.3.1固定化酶载体表面修饰原则 载体表面必须要有能够被活化或进行化学修饰的功能基团，在不损害载体骨架结构的条件下，此类功能基团能与间隔臂或配位体以共价键结合。欲使用的载体确定后，它的孔率和骨架结构也就确定了，此时，对载体的活化 [11]和功能化就成为了首要考虑的问题。色谱介质的活化为色谱配基的偶联创 造了必要的条件。环氧氯丙烷、1,4-二羟基正丁烷双缩水甘油醚、羰基二亚胺、二乙烯基亚砜等活化试剂被用于色谱介质的活化，以获得高密度、稳定 [12]的活化基团。这为进一步在微球上结合各种不同官能团或直接吸附生物分子提供了可能。 [8]载体表面修饰引入的一般为氨基、环氧基、羟基、氯甲基、酰肼基等。 活化方法的选取应遵循以下几点原则: (1)活化方法应能防止结合到载体上配基的脱落; (2)活化方法应避免产生非特异性吸附; (3)活化后不改变载体的其他性质; (4)活化方法利于后续配基的快速有效的偶联; [13](5)活化简单易行，可重复性高。 1.3.2固定化酶载体表面修饰环氧基 环氧基是一种常用的活性基团。环氧基固定化酶的原理是:酶分子上的氨基、羟基、巯基等亲核基团进攻环氧基，使环氧基开环，从而使酶分子固定于含有环氧基的载体材料上。环氧活性基不仅易与酶蛋白分子，进行化学结合，形成牢固的化学键，而且环氧基团易于进行化学修饰之后，再与酶分子共价结合，比如用乙二胺和环氧基修饰的载体反应，得到氨基修饰的载体，再用戊二醛作交联剂固定化酶。与氨基相比，环氧基修饰的载体直接固定化酶时反应条件温和(温度 25?，pH?7.0)，载体不需要预活化，非常适合工业化大批量生产固定化酶，而酶的活性在固定化过程中不易被破坏，此外环氧基可与酶分子中的多种活性基团如氨基、巯基及酚羟基、咪唑基等反应，在恰当条件下，酶与载体可发生多点键合，因此得到的固定化酶稳定性好，不易从载体上脱落。得到环氧化磁性微球之后，为进一步在微球上结合各种不同官能团提供了可能，为微球在生化分离当中的应用提供了实验载体和理论基础。 在磁性载体材料上引入环氧基不仅可进一步发挥环氧基固定化酶的各种优点，而且使载体材料在磁场作用下更容易回收使用，同时可应用磁性流动床技术使用固定化酶，具有更广泛的应用前景，但是目前在磁性载体表面引入环氧基的方法还不是很多。以下列举的是经典的几种环氧基活化方法 [13]。 (l)溴化氰活化法:在碱性条件下溴化氰与多糖上的羟基反应，将氰酯键与亚氨碳酸酯键合到基质上，然后偶联配基而制得亲和载体。溴化氰活化法操作步骤简单，重现性好，偶联条件温和，特别适用于偶联敏感性生物大分子。但是溴化氰活化法形成的异脲键易产生特异性吸附，且偶联时共价键不稳定，偶联配基容易脱落，此外，溴化氰活化法操作危险性大，反应后的残余液需经处理才可排放。 (2)环氧氯丙烷活化法:目前应用最广泛的活化方法，环氧氯丙烷试剂易得、偶联配基比较牢固，且价格比较便宜。该法操作简单易行，危险性相对较小。采用环氧活化法所形成的共价键稳定，配基不易脱落，活化过程中可以自动引入三个碳原子的间隔臂分子，且非特异性吸附小。环氧氯丙烷活化法是有机取代反应的机理，该反应过程是双分子亲核取代反应，当载体基质负离子游离进攻环氧氯丙烷时，环氧氯丙烷的C-O键断裂，此时，载体基质上的游离基上的O与环氧氯丙烷上的C重新形成C-O结合键。环氧活化法需在碱性条件下反应，不适用于碱敏感物质。此外，该法活化度低，载体载量小(只有溴化氰活化的几分之一)，而且偶联同时容易发生开环反应，其主要原因有: ? 环氧氯丙烷自身水解，活化反应为碱性条件下进行，碱液起到了催化的作用，但碱性时环氧氯丙烷易水解。 ? 环氧氯丙烷的溶解性低，微溶于水，因此水溶液中凝胶环氧化反应程度低。 ? 环氧基高温长时间与碱液接触会生成二醇，活化反应的产物因带有环氧基，可以继续与介质上的羟基反应生成交联物，生成的交联产物有可能 [14]再与活化产物上的环氧基团反应生成更进一步的交联产物。 (3)对甲苯磺酸氯活化法:主要用于活化含羟基基质，配基偶联过程中不产生新的电荷。但活化反应需在无水丙酮中进行，配基偶联简便，有机相或水相中均可进行反应。 (4)缩水甘油醚活化法:这种活化的凝胶其偶联配基密度虽然只有溴化氰活化75%，但其化学性质更稳定，配基很少脱落，分离效果好，此外此法对琼脂糖凝胶有交联作用，凝胶的刚性更好。 (5)高碘酸盐活化法等。 各种活化方法各有利弊，有的活化时间短，有的毒性低，有的形成的键稳定，可以根据不同的偶联对象和实验目的进行选择。众多学者亦对许多载体材料的活化和环氧基化做出了研究。 [12]史清洪等研究发现以二甲基亚矾为环氧氯丙烷活化溶剂可极大地提高凝胶的活化度，活化密度高达100mmol/mL以上，二甲基亚矾很好的消除了琼脂糖凝胶载体与环氧氯丙烷之间的界面现象，强化了活化反应。 [15]伍学勤等人采用羰基二咪唑(CDI) 活化琼脂糖树脂，并用其成功制备亲和层析柱及固定化酶。 [16]潘丹卓等对琼脂糖凝胶微球活化度条件的考察发现，通过引入亲水性有机试剂二甲基亚砜，提高了Sepharose CL-6B介质环氧基活化密度。在10%体积分数的环氧氯丙烷、0.8 mol/L氢氧化钠及反应时间2.5 h的优化条件下，环氧基活化密度可达100μmol/mL以上。 [17]沈维云探索过几种合成环氧基修饰的磁性二氧化硅载体(EMS)的方法，分别是二氧化硅微球(MS)和乙烯基三乙氧基硅反应合成表面含有乙烯基的磁性二氧化硅，然后用过氧乙酸氧化双键得环氧基;用环氧氯丙烷与 MS 反应制备 EMS;用 GPTMS 和 MS 在无水甲苯中反应制备 EMS，但这三种方法键合的环氧基均未被红外光谱及化学滴定方法检出。最后，作者直接用GPTMS和四氧化三铁纳米粒反应，在温和的条件下可以在四氧化三铁纳米粒表面引入较多的环氧基，制备得到 EMS。 [18]杨开伦等用环氧氯丙烷活化2% 的珠状琼脂糖凝胶与胰蛋白酶进行偶联反应制备固定化酶。考察了固定化胰蛋白酶的活力受环氧氯丙烷量，活化反应的碱浓度及给酶量的影响。 1.4固定化酶载体的间隔臂 不溶性载体亲和纯化的空间位阻大，通常需要引入一定长度的“手臂”分子，以保证亲和配基有合适的空间取向和伸展灵活性，常用的间隔臂分子一般为小于十个碳原子且分子两端具有活性基团的小分子有机物。但对于水溶性良好的水溶性载体，其配基偶联反应为均相反应，且由水溶性载体制备的亲和载体也是水溶性的，因此配基与载体之间也是均相反应，亲和分离纯化的空间位阻小，一般不需键和间隔臂分子。合适的间隔臂要求臂长适宜兼 具合适的亲水性。间隔臂太短，会存在空间位阻吸附性差，配体的空间利用率差;间隔臂太长则会产生非特异吸附，且臂易折叠缠绕，进而使有效臂长降低。此外，间隔臂的疏水性与蛋白质的疏水性相互作用，产生非特异性吸附，因此间隔臂还应有一定的亲水性。此外不同的配基需要键合的间隔臂不 [11]同，目前对于间隔臂的研究还比较少。 1.5固定化酶载体的配位体 许多学者针对特定分离系统下，对配位体的选择做出了大量的科研工作。酶的固定化及亲和纯化是利用目的蛋白质和配位体之间的选择性亲和相互作用进行分离，所以适宜的配位体是成功分离纯化生物大分子的关键。对配位体最基本的要求是性能好、稳定和价廉。通常情况下，酶的亲和纯化是从自然界存在的生物来源中选择那些与互补溶质有天然配对倾向的物质作配位体，例如:抗原、抗体、植物凝结素或酶抑制剂等，它们有很高的选择性。人们也在不断努力开发新的其他高选择性的配体如染料配位体、定位金属离子配位体、包合配合物配位体、电荷转移配位体等。 1.6 展望 (1)加强已开发载体和方法的优化并不断开发新载体、新方法来进一步提高固定化酶的活力、回收率、延长半衰期、降低成本; (2)开发新型、高效固定化酶反应器，进一步提高转化率和生产能力， [2]使固定化酶在工业化生产中的应用更加广泛有效; (3)充分考虑纯化量和纯度级别、酶蛋白的来源来将固定化酶工程精细化，根据用途不同及酶的性质差异合理设计不同的策略; (4)新型分离材料、高度自动化和人工智能仪器设备的不断涌现以及蛋白质工程等分子生物学技术的引入，推动固定化酶分离化学进入了新的发展阶段。开发先进、灵活的蛋白质化学技术分离纯化天然酶、重组酶、人工模拟酶及杂合酶势在必行。随着对酶三维结构的阐明越来越多,基于分子识别可望开发出简易有效的、针对不同酶分子的专一性分离纯化技术。酶-底物、 [19]酶-底物类似物、酶-辅因子的亲和层析也是酶分离纯化中亟待开发的技术。 1.7本论文研究内容及意义 亲和吸附微载体一般为粒径分布小的纳米或微米级微球，具有大比表面积，高表面活性基团，通过键和一定长度和性质的间隔臂减小亲和吸附的空间位阻，而后对生物大分子进行吸附分离。磁性高分子微球因其内部有磁性物质存在，在外加磁场的作用下，可快速有效地富集、分离、回收和再利用。与其它载体材料相比，磁性高分子微球作为固定化载体具有从反应体系中易分离和回收、操作简便、成本较低等诸多优点。和固定床吸附纯化蛋白质过程具有的生产能力有限，不利于连续化生产，介质微球在床层挤压中易破碎的缺点相比，磁性高分子微球能和目标分子在悬浮状态吸附结合后，利用外加磁场快捷简便地与混合物系统分离。介质载体可以反复利用。该法处理量大，利于工业放大，为规模化的蛋白质生产提供了技术支持。 本研究根据以上的技术研究意义，先采用反相悬浮包埋法制备了磁性琼脂糖微球，采用环氧氯丙烷活化法进行活化，得到环氧化琼脂糖磁性微球。并考察了活化的最优条件。为进一步在微球上结合各种不同官能团或直接吸附生物分子提供了可能，为琼脂糖磁性微球在生化分离中的应用提供了实验载体和理论基础。 第二章 琼脂糖微球的制备 2.1实验试剂及仪器 2.1.1实验试剂 实验所用试剂如表2-1所示。 表2-1 实验试剂一览表 名称 纯度/规格 厂商 氯化高铁 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氯化亚铁 分析纯 天津市大茂化学试剂厂 氨水 分析纯 成都市科龙化工试剂厂 Span-80 分析纯 成都市科龙化工试剂厂 液体石蜡 分析纯 成都市科龙化工试剂厂 琼脂糖 分析纯 阿拉丁试剂有限公司 石油醚 分析纯 广东光华化学厂有限公司 异丙醇 分析纯 成都市科龙化工试剂厂 无水乙醇 分析纯 成都市科龙化工试剂厂 吐温-20 分析纯 广东汕头市西陇化工厂 2.1.2实验仪器 实验所用仪器如表2-2所示。 表2-2 实验仪器一览表 名称 型号/规格 厂商 数显电子恒速搅拌器 S212 上海申顺生物科技有限公司 电子天平 DV214C Ohaus. Co., Ltd 超声波清洗器 SK8200HP 上海科导超声仪器有限公司 旋涡混合器 XW-80A 上海青浦沪西仪器厂 台秤 JY10001 上海精密科学仪器有限公司 金怡数显恒温水浴锅 HH-S2 金坛市医疗仪器厂 光学显微镜 XSZ 梧州市光学仪器厂 2.2实验方法及步骤 根据文献的相关描述，本文选用比较成熟的反相悬浮包埋法制备琼脂糖磁性微球。 [20]制备磁流体:在具塞玻璃瓶中加入3g自制的油酸改性四氧化三铁微粒(60~70nm)、10ml去离子水和3滴吐温-20，超声匀质10min，封口保存于4?冰箱中。每次使用磁流体前均需要超声匀质; 准备有机相:250ml三口烧瓶内加入2g Span-80，50ml液体石蜡并在恒温水浴中加热至80?; 准备水相:0.125g琼脂糖与4ml水共同煮沸至琼脂糖完全溶解，加入1ml自制磁流体，在旋涡混合器上充分混合; 在850rpm的持续机械搅拌下，迅速将水相滴加入有机相中，并在80?下反应10min。然后冷却至40?以下，并保持250rpm转速机械搅拌5min使微球成形。制得的微球用10ml石油醚及1ml异丙醇洗涤、抽滤，之后分别用石油醚和去离子水清洗2次，以清除残余油相。将洗净的微球置于20%乙醇水溶液，4?下保存备用。 2.3实验结果及讨论 用上述方法制得的琼脂糖磁性微球在放大400倍的显微镜下成像如图2-1所示，微球球形规整，粒径分布均匀。在显微镜下随机抽取500个微球进行粒径测量，微球粒径分布范围在3.6~36μm之间，平均粒径是12.44μm。微球具有良好的磁响应性，在外加磁场下能迅速聚集，磁场撤去后又能充分地分散于水中。 图2-1 琼脂糖磁性微球的光学显微镜照片(×400) 第三章 琼脂糖磁性微球活化条件研究 3.1微球活化方法论证 琼脂糖磁性微球的表面存在大量的羟基，可以用来偶联配基。但羟基不够活泼，难以在温和条件下与亲和配基反应，所以需要对琼脂糖微球进行活[21]化。 前期，溴化氰是应用最广泛的载体活化剂。但是，溴化氰是具有挥发性的剧毒试剂，在使用时需要十分小心。从试剂的称量到偶联后微球的洗涤都 [15]不能出现差错。 与经典的溴化氰活化方法相比，本文选择用环氧氯丙烷作为活化剂。反应方程式如下式所示: 该方法具有方便、快速、活化率高、活化后的载体稳定性好、毒性低的 [12]特点。并且可提供相当于3 个碳原子间距的空间臂，因而有利于大分子 [18]的配体与相应的大分子物质之间相互作用等优点。 缩水甘油醚活化法活化的凝胶其偶联配基密度虽然只有溴化氰活化效率的75%，但其化学性质更稳定，配基很少脱落，分离效果好。此外，此法 [13]对琼脂糖凝胶有交联作用，凝胶的刚性好。本研究也尝试过用1,4-丁二醇二缩水甘油醚作为活化剂对琼脂糖磁性微球进行活化，但是活化效果不理想，活化后 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 不出环氧基的存在。 3.2环氧基分析方法论证 琼脂糖磁性微球表面环氧功能基团的量决定了其最终与配基或生物分 [22]子作用的鳌合点的数量。所以，微球表面环氧基团的密度便是本研究工作衡量琼脂糖磁性微球活化程度的一个重要指标。 环氧基团的检测方法很多。定性分析的有傅立叶变换红外光谱和漫反射傅立叶变换红外光谱等，它们可以对环氧基修饰的微球表面进行定性表征， [4]测定微球的内部结构组成及表面功能基团的特征吸收峰。环氧基的定量分 [4]析主要用化学滴定法，如盐酸-丙酮法，盐酸-吡啶法等。如曾力希曾用盐酸吡啶溶液溶解微球，并将该反应系统放入95至100?的甘油浴中保温回流30min后取出，冷却后加入酚酞指示剂，用0.2mol/LNaOH乙醇标准溶液滴定至浅粉红色。利用消耗NaOH的体积计算出微球表面环氧基的量。 参照众多文献的磁性复合微球表面环氧基化学滴定的方法，本文决定采用硫代硫酸钠滴定法测定微球表面环氧基密度。这种方法相对精确，并且操作简便。其原理为利用硫代硫酸钠与活化琼脂糖磁性微球表面的环氧基定量反应生成氢氧根离子，反应方程式如下: -2,2,—CH?CH+ +HO —CH?CH—+ OH,SOSO2 22 2323 ? ? ? O OH 再用己知浓度的盐酸滴定该反应中生成的氢氧根离子的浓度来计算环氧基 [23]团的量。 在活化过程中，NaOH作为催化剂的加入和使用方式也有多种。NaOH [12]可以在配制成一定浓度的水溶液后加入反应体系，也可以以固体颗粒形态 [24]加入。也有相关研究利用NaOH溶液对琼脂糖微球进行预处理之后，再把 [23]与预处理好的微球用以活化。本文采用将NaOH配制成一定浓度的水溶液后加入反应体系，这样保证了NaOH的完全溶解与浓度均匀，操作更加简便易行。另外，本实验的反应体系试剂量较少，将NaOH配成水溶液加入反应体系也可适当增加反应锥形瓶液位，使得震荡反应能够更加充分。 3.3实验试剂及仪器 3.3.1实验试剂 实验所用试剂如表3-1所示。 表3-1 实验试剂一览表 名称 纯度/规格 厂商 硫代硫酸钠 分析纯 成都市科龙化工试剂厂 氢氧化钠 分析纯 成都市科龙化工试剂厂 酚酞 分析纯 天津基准化学试剂有限公司 硼氢化钠 96% 国药集团化学试剂有限公司 环氧氯丙烷 分析纯 广东汕头市西陇化工厂 3.3.2实验仪器 实验所用仪器如表3-2所示。 表3-2 实验仪器一览表 名称 型号/规格 厂商 全温度恒温培养振荡器 ZHWY-2102 武汉赤城生物股份有限公司 电子天平 DV214C Ohaus. Co., Ltd 光学显微镜 XSZ 梧州市光学仪器厂 3.4实验方法及步骤 3.4.1琼脂糖磁性微球的活化 将琼脂糖磁性微球在布氏漏斗上用去充分离子水洗净，抽干。称取0.5g微球放入磨口锥形瓶内，加入不同浓度梯度的NaOH溶液2.0ml，体积分数(环氧氯丙烷体积与反应混合物总体积的百分比)为20%的环氧氯丙烷及1mg的NaBH ，在设定了40?的恒温培养振荡器中反应4h。4 按照单因素实验的设计要求，分别将NaOH溶液浓度定为0.3mol/L、0.6mol/L、0.6mol/L、1.2mol/L、1.5mol/L;环氧氯丙烷体积分数为10%、20%、 30%、40%、50%;NaBH的浓度为0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L;4 活化温度为30?、35?、40?、45?、50?;活化时间为2h、4h、6h、8h、10h。逐步进行最优反应条件的确定。 活化后，用大量去离子水抽滤洗涤活化微球。清洗液中残留的氢氧根和环氧基用如下方法检测:抽取约3ml清洗液，加入1~2滴酚酞指示剂，震荡后溶液不变红，则氢氧根已清洗干净;抽取约3ml清洗液，加入1~2滴酚酞指示剂，再加入1.3mol/L硫代硫酸钠溶液3ml，剧烈震荡后溶液不变红，则说明残留环氧基已被清洗干净。 3.4.2琼脂糖磁性微球环氧基修饰密度的分析 经大量去离子水清洗后的，确定无残留氢氧根及环氧基的活化微球置于布氏漏斗中真空抽干至无水滴下后继续抽1min，随后称取抽干的微球0.2 g(精确至0.1mg)，置于磨口锥形瓶中并加入约3 mL 1.3 mol/L 硫代硫酸钠和~2滴酚酞指示剂，锥形瓶封口后于室温下振荡反应30 min. 反应后的溶液1 用0.003 mol/L 盐酸标准溶液滴定，直至溶液由红色变为无色为止。根据环 --氧基与硫代硫酸钠反应并释放出OH，以标准HCI溶液中和滴定OH，即可求得每克凝胶上包含的环氧基即环氧基密度。实验中用未活化微球作为空白 对照。由下式计算环氧基修饰密度: CVV(),HCl01S, m 其中，S为环氧基修饰密度(mol/g)，C为HCl浓度(mol/L)，V、HCl0V为滴定前、后HCl的体积(ml)，m为活化微球质量(mg)。1 3.5实验结果及分析 3.5.1活化后琼脂糖磁性微球的性质 活化后，琼脂糖磁性微球的整体形态、粒径以及磁响应性较活化前无显 著改变。活化后的琼脂糖磁性微球在放大400倍的显微镜下成像如图3-1所示。微球亦能继续在外加磁场下迅速聚集，磁场撤去后又能充分地分散于水中。虽然环氧氯丙烷亦常作为琼脂糖凝胶介质的交联剂使用，高浓度环氧氯丙烷的引入会导致琼脂糖介质交联度的提高。但由于环氧氯丙烷分子的碳链长度有限，而且采用的环氧氯丙烷体积分数不大，所以这种交联主要发生在 [12]琼脂糖胶束内，对介质内孔道结构和溶质在介质内的传质行为没有影响。 图3-1 活化后琼脂糖磁性微球的光学显微镜照片(×400) 3.5.2琼脂糖磁性微球活化条件探究结果分析 3.5.2.1 NaOH溶液浓度的影响 按照上述活化及分析方法考察了NaOH溶液浓度对活化反应的影响，得到的微球表面环氧基密度如图3-2所示。 140 120 100 80 60 40 环氧基密度S(μmol*g-1)20 0 00.20.40.60.811.21.41.6 NaOH浓度(mol/L) 图3-2 NaOH溶液浓度对微球表面环氧基密度的影响 从图中可以看出，随NaOH溶液浓度的增大，微球表面环氧基密度先呈线性增大，而后线性减小，在NaOH溶液浓度为0.9mol/L时达到最大值。琼脂糖磁性微球表面含有大量羟基，羟基接触NaOH后被激活，为下一步环氧 [13]氯丙烷的亲核取代反应提供游离基负离子。NaOH作为环氧氯丙烷与琼脂糖上羟基反应的催化剂，当其浓度过低时，活化反应不完全。而且一定浓度的碱液可以保证溶液中的碳负离子的稳定性。但另一方面，环氧基易水解， [21]而氢氧根也是环氧基开环水解的催化剂。因此碱液浓度过高时，增大了环氧基自身的开环和水解副反应，导致活化度反而降低。所以活化反应的最适宜NaOH溶液浓度可确定是0.9mol/L。 3.5.2.2 环氧氯丙烷体积分数的影响 按照上述活化及分析方法考察了环氧氯丙烷体积分数对活化反应的影响，得到的微球表面环氧基密度如图3-3所示。 140 120 100 环氧基密度S(μmol*g-1) 80 0%10%20%30%40%50%60% 环氧氯丙烷体积分数 图3-3 环氧氯丙烷体积分数对微球表面环氧基密度的影响 从图中可以看出，随环氧氯丙烷体积分数的增大，微球表面环氧基密度先明显增加，后趋于稳定，在环氧氯丙烷体积分数为40%时达到最大值。说明40%体积分数的环氧氯丙烷与琼脂糖磁性微球上的羟基反应已经饱和。在环氧氯丙烷体积分数为50%时，微球表面环氧基密度稍有下降。这可能是由 [12]于环氧氯丙烷在水中的溶解度有限(约为6.58%)，环氧氯丙烷体积分数过高，其强疏水性反而不利于 NaOH 扩散，从而导致在高环氧氯丙烷体积分 [24]数时，环氧基修饰密度反而降低。 3.5.2.3 NaBH的浓度的影响 4 按照上述活化及分析方法考察了环氧氯丙烷体积分数对活化反应的影响，得到的微球表面环氧基密度如图3-4所示。 120 100 环氧基密度S(μmol*g-1) 80 00.511.522.53 NaBH4浓度(mol/L) 图3-4 NaBH的浓度对微球表面环氧基密度的影响 4 实验结果显示，NaBH的浓度不断加大，琼脂糖磁性微球表面环氧基密4 5g /L时，琼脂糖的活化度出现峰值。度有下降的趋势。硼氢化钠浓度在0. 所以比较适合的硼氢化钠浓度是0.5g /L。在琼脂糖的活化反应中，硼氢化钠作为封闭剂去掩蔽琼脂糖磁性微球表面的剩余活性基团和电荷，防止或降低琼脂糖磁性微球偶联配基后剩余的活性基团仍通过基团共价结合或电荷离子交换引起不可逆性吸附，也避免了琼脂糖微球亲和吸附蛋白质时与杂离子进行交换。但是如果活化时硼氢化钠过量，会引起环氧化合物的开环反应， 、[1316]降低微球的表面环氧基密度。 3.5.2.4 活化温度的影响 按照上述活化及分析方法考察了活化温度对活化反应的影响，得到的微球表面环氧基密度如图3-5所示。 140 120 100 80 环氧基密度(μmol*g-1) 60 25303540455055 活化温度(?) 图3-5 活化温度对微球表面环氧基密度的影响 如图3-5所示，琼脂糖磁性微球表面环氧基密度随活化温度的升高先增大后减小。40?下反应得到的表面环氧基密度最大。升高温度有利于快速进行，但同时微球表面环氧基的水解副反应和其与琼脂糖微球表面其它羟基的交联反应速率也会加快，但这三个反应受温度的影响程度不同。在温度较低(30?)时升温，活化反应增加的速率大于环氧基水解和交联副反应的速率。在温度较高(40?)时，继续升温会导致环氧基的水解和交联副反应迅速增 [21]加，水解和交联副反应占有更强的优势，因而环氧基密度反而逐渐下降。 3.5.2.5 活化时间的影响 120按照上述活化及分析方法考察了活化时间对活化反应的影响，得到的微球表面环氧基密度如图3-6所示。 100 环氧基密度S(μmol*g-1) 80 024681012 活化时间(h) 图3-6 活化时间对微球表面环氧基密度的影响 反应时间小于4小时时，随活化时间的延长，琼脂糖磁性微球表面的活环氧基密度增加比较明显，再继续延长反应时间，活化度反而有所下降，由此说明适宜的反应时间为4小时左右。当反应时间过长时，活化反应经已基本完成，但微球表面的环氧基和环氧氯丙烷在碱性条件下的水解反应仍在继续，部分已经修饰于微球表面的环氧基由于发生水解而开环失活。 综上所述，得到的琼脂糖磁性微球活化最佳条件是NaOH溶液浓度为0.9mol/L，环氧氯丙烷体积分数为40%，NaBH的浓度为0.5g/L，活化温度4 为40?，活化时间为4h。 第五章 总结及展望 5.1总结 本论文较为系统地综述了固定化酶技术的研究意义及其国内外的研究进展，包括固定化酶载体基质材料、载体表面修饰、间隔臂和配位体的相关阐述。其中着重介绍了载体表面修饰环氧基的研究进展。 本研究通过方法论证，设计了用环氧氯丙烷活化琼脂糖磁性微球的 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ，并成功制备了表面修饰环氧基的琼脂糖磁性微球，并且考察了在琼脂糖磁性微球的活化反应中，NaOH浓度、环氧氯丙烷体积分数、NaBH的量、4反应温度和反应时间对活化度的影响，得到了最佳活化条件:NaOH溶液浓度为0.9mol/L，环氧氯丙烷体积分数为40%，NaBH的浓度为0.5g/L，反应4 温度为40?，反应时间为4h。为之后在活化了的琼脂糖磁性微球上偶联亲和配位体的研究打下了基础。 5.2展望 由于时间仓促，研究中还有一些工作尚待开展。后续的研究方向可以有以下几点: (1) 琼脂糖磁性微球粒径越小，就会具有越大的比表面，在相同的质量下，其能交联的环氧基的微球表面积就可能越大，其被环氧氯丙烷活化的程度就可能越高，所以活化度可能越高。后续研究可以在本文考察了同一粒径的琼脂糖磁性微球活化条件的基础上，考察微球的粒径对活化度的影响。 (2) 由于环氧氯丙烷在水中的溶解度有限(约为6.58%)，该活化反应是一个 [12]复杂的油(环氧氯丙烷)-水-固(微球)三相反应体系，反应速率较慢;史清洪曾在反应系统中引入水溶性有机溶剂反应体系以促进环氧氯丙烷在反应体系中的溶解。最后用二甲基亚砜消除了琼脂糖凝胶与环氧氯丙烷之间的相界面，强化了在琼脂糖凝胶介质中的环氧基活化反应。与不加入有机溶剂的常规活化方法比较，该方法制得的活化介质对5-氨基吲哚的配体偶联度提高了 [24]75%以上。张松平等人发现了在无水体系中，以二甲基亚砜为溶剂，环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶的环氧基密度可达165μmol/L。所以可以在本实验的基础上引入适合的有机溶剂来优化反应。 (3) 环氧基密度过高时，过量的环氧基没有偶联配基而保留在介质上，反 [21]而会增大介质的空间位阻。从而会影响亲和介质上的配基与目标蛋白的结合能力。所以最好能通过调节环氧基密度而不是通过调节配体加入量来调控亲和介质的配基密度。这时，进一步探索微球表面环氧基密度与活化反应时的条件的规律就尤为重要。 (4) 研究其它更适合的活化剂，使得活化效率更高;活化后的介质更加稳定，性能更加卓越;活化操作更加安全简便;反应成本更加低廉等。 (5) 琼脂糖为多糖类软胶，其结构疏松，不易吸附敏感生物大分子也不使 [25]其变性，价格比较便宜。但其质软，不耐压，在较低的pH范围内易降解。为了克服这些缺点，我们可以通过寻找适合的交联方法琼脂糖磁性微球的刚 度。 参考文献 [1] 阎金勇, 丁双, 杨江科, 等. 微生物酶分离纯化研究进展[J]. 现代 化工. 2007, 27(6): 19-23. 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[25] 苗奕, 温守明,等. 亲和色谱法的研究进展[J]. 国外医学药学分册. 1999. 26(1):41-44. 附录:外文文献翻译 环氧基磁性微球固定化脂肪酶的研究 摘要 选用甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、甲基丙烯酸(MAA)、二乙烯基苯(DVB)，在油酸改性的Fe3O4纳米粒子存在下进行悬浮聚合，制备了磁性环氧基高分子微球。利用带环氧基的磁性微球从猪胰脏提取并固定化三酰甘油脂肪酶，酶的活力回收高达63%(72.3%)，酶固定化能力是39(70.5)mg/g载体。较之游离脂肪酶，固定化脂肪酶拥有更高的适宜温度，更高的温度和pH值的稳定性以及优良的复用性。此外，固定化脂肪酶在非水性溶剂12小时，催化乙基乙酸盐的酯化转化率达到83%(72.5%)，证明了固定化脂肪酶的催化性能。 固定化酶 关键词:磁性微球 悬浮聚合 脂肪酶 1.引言 酶因其较高的特异性经常被用于生物传感。它可以高的特异型、速率及产率催化很多反应。然而，要把酶投入到生物化工工业中，酶的稳定性、活性和复用性亟待提高。因此固定化酶一直是酶技术的热门研究课题。人们提出了很多固定化酶的方法，比如物理吸附法、共价结合法、聚合物包埋法在和交联法。 脂肪酶(三酰甘油水解酶;EC 3.1.1.3)是使用最广泛的催化水解三酰甘油成为甘油和脂肪酸的一种酶。根据基质性质和反应条件，酶可以促进一系列的有抗性的和特异性的反应，如水解、酯化、酯基转移、氨解。由于各种各样的环境条件，酶经常容易失活且难以从反应系统中分离再用。因此，脂肪酶的进一步工业化应用受到了限制。为了解决以上的问题，人们设计了新的固定化方法和合成了新的载体。带有功能基团的磁性微球(微米级微球和纳米级微球)因其优越性能引起了广泛关注。一方面，在这些功能基团中，环氧基能在中性甚至水环境下保持稳定，所以，一些商业出售的载体不能用来制备固定化酶，而环氧基活化的载体似乎成了固定化酶的理想系统。再者， 带环氧基的载体可以和蛋白质的各种亲核基团(如氨基酸高分子、羟基、巯基)反应形成极强的键(次级氨键、其他化学键)，而蛋白质的化学改性能很小。另一方面，除了其他载体的优点，固定化脂肪酶的磁性载体可以在外加磁场下更容易从反应体系中分离和在流化床反应器中固定。磁性载体的运用也可以减少资金和操作成本。在目前的研究工作中，人们已用悬浮聚合法，用GMA、MAA，在油酸改性的Fe3O4纳米粒子存在下，以DVB作为交联剂，制备了带活泼环氧基的磁性复合微球(甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、甲基丙烯酸(MAA)、二乙烯基苯(DVB))。磁性聚乙烯(GMA-DVB-MAA)微球的形态、结构、磁性特征分别用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、扫描电子显微镜(SEM)、x射线衍射(XRD)、振动样品磁强计(VSM)和热失重分析(TGA)表征。猪胰脂肪酶(PPL)被认为是具有代表性的共价在磁性微球上的的酶。本文对固定化猪胰腺脂肪酶的最佳条件和一些固定化脂肪酶的理化特性进行了研究。此外，笔者还用了固定化PPL来催化合成己基醋酸。 图表1. 磁性微球与脂肪酶的固定化反应 2.实验部分 2.1原料、试剂 GMA购于广州汽巴精细化工有限公司;MAA， DVB，过氧苯甲酰(BPO)、亚甲基蓝、可溶性淀粉均购于天津化学试剂有限公司;猪胰脂肪酶(Type Q，177.3μ/毫克蛋白质)购于西格玛化工有限公司;六水三氯化铁(FeCl3 6 H2O)、四水氯化亚铁(FeCl24H2O)、氨水(25 wt %)及其它分析纯 均购于天津化学试剂公司。 2.2磁性复合微球的合成 2.2.1磁性纳米粒子的制备 用常规的共沉淀法制备油酸改性的Fe3O4纳米粒子并将其改性。在氮气保护下，把0.196 mol FeCl3•6H2O和0.098 mol FeCl24•H2O溶解于大烧杯的600ml去离子水中，在80?下强烈搅拌，之后加入30 ml NH3•H2O (25 wt%)，然后在20分钟内往悬浮液中逐滴加入油酸。几分钟后，用磁铁将生成的Fe3O4从溶液中分离，用蒸馏水反复洗去过量油酸。 2.2.2. 微球的制备 用悬浮聚合法制备磁性微球。饱和淀粉溶液，加入和一定量的NaCI和几滴亚甲基兰溶液作为水相。单位GMA:MAA 6:1和DVB (上述单位25%)，引发剂BPO(1%上述单位1%的质量分数)及0.3g磁性油酸改性Fe3O4纳米粒子作为油相。水相与油相的体积比为3:1。悬浮聚合在氮气保护下在100ml三口烧瓶中进行，烧瓶另两口连接冷凝回流和机械搅拌。三口烧瓶置于水浴中，搅拌速度为450rpm。悬浮聚合在55?反应0.5h，65?下反应4h，75?下反应3h，然后在85?下反应2h。最后用磁铁将产物分离，分别用热蒸馏水和异丙醇反复洗涤。最后将产物放在索氏提取器中以甲醇抽提24h并在室温下真空干燥。 2.3磁性复合的表征 微球红外光谱用分光光度计(Nicolet NEXUS 670，USA)记录。样品和KBr压成切片。用SEM扫描电镜 (JSM - 6701 – F，Japan)观察微球形态。用振动样品磁强计(LAKESHORE-7304, USA)在室温下测量干微球的磁滞回线。用XRD(Rigaku D/MAX-2400 X-ray diffractometer with Ni-filtered Cu Ka radiation)观察微球的晶体性质，用热重分析仪(STA 1090B)在氮气保护下检测微球的热稳定性。温度以10?/min的速率从30?升至800?。 2.4磁性复合微球固定化酶的制备 直接在容器中对脂肪酶的溶液进行脂肪酶的固定化。将50mg的磁性微球溶胀于2.0ml磷酸盐缓冲液(0.1 M, pH6.9)中24h后，分离出微球，将微 球加入到2.0ml PPL缓冲溶液中(pH 8.0，0.1 M磷酸缓冲液和10–15 mg PPL)。30?下磁力搅拌8h以固定化脂肪酶。用0.1M的磷酸缓冲液(pH=8)冲洗三次，收集淋洗液检测残留脂肪酶含量。制备的固定化脂肪酶在4?下冷藏备用。 2.5蛋白检测 脂肪酶溶液和固定化酶后上清液的蛋白质含量可以用Bradford 的方法检测，键合上载体的蛋白质含量可用以下公式计算:p = [(C i - C f)V] /W 其中，p为键合到载体的脂肪酶量(mg/g)，Ci 和Cf为反应溶液体系中反应前和反应后浓缩的脂肪酶量(mg/ml)。V是反应溶液体系的体积(ml)，W是载体质量(g)。公式中所有数据均为三组平行试验的平均值。 2.6 PPL活性及固定化酶效率的测定 通过对橄榄油的水解作用测定游离脂肪酶及固定化脂肪酶的活性。0.5ml (0.5%, w/v)游离脂肪酶或0.1g分散在磷酸盐缓冲液(0.1 M, pH 6.9)的固定化脂肪酶，加入2.5 ml 25% (v/v)乳化橄榄油的基底物，以此测定游离脂肪酶及固定化脂肪酶的活性。乳化橄榄油可通过将纯橄榄油分散于带有乙醇的水中(2%, w/v)。精确在37?下保温半小时，以5.0ml 1:1的酒精丙酮混合液终止反应。之后加入5.0 ml 0.05 M的氢氧化钠溶液。最后，用0.05 M HCL滴定反应后溶液。反应中生成的脂肪酸的含量，将从所加入和滴加的标准酸碱溶液的平衡方程中计算得到。猪胰脂肪酶的一个活力单位被定义为，在一定条件下一分钟内水解橄榄油释放出一微摩尔 (l.0mmol)脂肪酸所需要的酶量。 固定化酶的效率可从活力回收中计算得到，如下式所示: 活力回收%=( B/A) x 100% A是初始溶液中脂肪酶总活力，B是固定化酶的活力。相对活力为每组中所测活力值与该组中最高活力值的比。所有的酶活力测定实验均进行三次以上，实验误差小于3%。 2.7提高酶活力的最佳条件 通过将游离脂肪酶及固定化脂肪酶在30?下保温，改变pH值(100 mmol/l pH 5.0–8.0的磷酸缓冲液，pH 8.0–9.0的 硼酸-氢氧化钠缓冲液)和温度(从 25 到80 ?)，来测定相对活力，并以此来决定最优的反应pH值、温度。 2.8固定化脂肪酶稳定性和重复使用性 热稳定性测定:游离酶和固定化酶于50ml的磷酸缓冲液中 (0.1M，pH 7.0)，保持在50?震荡6h，并每隔1h测定一次酶活力，计算相对活力用上述方法。 重复使用性测定::将固定化酶催化水解橄榄油乳化液后用永久磁铁分离，反复多次用于同样的催化反应，计算相对活力并与第一次反应(活力定为100%)比较。 2.9 己基醋酸盐的催化合成 短链脂肪酸的己基醋酸盐是一种重要的广泛应用于食品、饮料、化妆品和医药的香精香料。因为通过从植物体提取或发酵来获得这种产品有很高的商业成本，所以传统上用化工合成的方法制造这种产品。人们开始关注酶催合成因为酶有着高效特异性，而且和化工合成比较起来，条件温和，压力不高。因为固定化酶可以回收重复利用，降低催化剂成本，所以固定化酶在该类工业生产中有很重要的地位。人们研究过用磁性微球固定化脂肪酶在有机溶剂中催化醋酸和己醇进行酯化反应合成己基醋酸盐及该反应的最佳条件。10ml正庚烷溶液中，0.2 M醋酸和 0.2 M己醇在60 mg固定化脂肪酶和一定量活化分子筛的催化下在具塞小瓶中反应。具塞小瓶置于恒温水浴中，并持续以120rpm的速度进行磁力搅拌。如无其他说明，本文沿用上述条件。 3.结果与讨论 3.1 磁性微球的制备及表征 3.1.1 载体的FT-IR 分析 用红外光谱证明微球表面环氧基的存在，结果如图1所示。 图1. 磁性微球的红外光谱图 从红外谱图看出，甲基丙烯酸缩水甘油酯在载体上形成的环氧基的特征 -1 吸收峰和伸缩振动峰分别在1270, 923 和839 cm，而3428，1724 和 1163 cm-1处的吸收峰则应分别为羧基的uO–H、uCQO 和uC–O键以及GMA 和 -1 MAA的酯基。同时，796、707 cm的吸收峰应为DVB中亚苯基的C–H的变形振动。因此，这表明了共聚物的生成。 3.1.2 载体的扫描电子显微镜分析 表2为磁性微球的表面形态及内部结构的电子显微图。 图2. 磁性微球电子显微图 (a)放大2000倍 (b)放大5000倍 可以看到，微球粒径范围是10 to 20 mm。我们可以清楚的看到，微球呈规则球型。微球表面粗糙，是因为聚合过程中有气泡产生。微球表面粗糙是提高微球比表面的因素。另外，气泡减小了传质阻力并因其很高的内部凹陷表面而促进了脂肪酶的扩散。这样使脂肪酶的可用共价键固定在环氧基表面。 3.1.3 载体的振动磁强分析 微球的磁性对其进一步应用很重要。用震动磁强计在室温下测定的微球(GMA-DVB-MAA)磁滞曲线如图3所示。当加入0.3g油酸改性的四氧化三铁纳米粒子时，磁性微球的饱和磁强度为12.18 emu/g。磁滞曲线显示磁性微球剩磁和矫顽力几乎为零。超顺磁性使微球能在有外加磁场时，快速响应而避免被永久磁化，当外加磁场撤销时，载体的磁性很快消失。 图3. 磁性微球磁滞曲线 3.1.4 载体的X射线衍射分析 用XRD分析载体的晶体结构。图4为磁性纳米微球和磁性微米微球的XRD谱图。据谱图所示，标准四氧化三铁尖晶石结构晶体有六个衍射峰，分别是{2 2 0}, {3 11}, {4 0 0}, {4 2 2}, {511} and {4 4 0}。可以推断经油酸改性的四氧化三铁粒子也是单相尖晶石结构。另外，根据XRD的数据，可以用雪莱方程计算磁粒的粒径。磁粒的平均粒径约为10.8nm。 图4. 磁性纳米微球(b)和复合磁性微米微球(a)的广谱X射线衍射图 3.1.5 载体的热重量分析 用热重量分析法衡量磁性复合微球的磁含量。如图5所示，磁性微球在700?下完全分解，剩下质量分数为17.32% 的磁。 图5. 磁性复合微球的TGA曲线 3.2固定化脂肪酶的参数 3.2.1 给酶量对脂肪酶活力的影响 制备固定化脂肪酶时给酶量对固定化酶的相对酶活的影响如图6所示。 脂肪酶结合量随初始酶浓度明显增加，相对酶活在初始酶量达2.0ml(0.1g脂肪酶/载体)时达到最大值。估计是更高的酶结合量会引起分子间的空间位阻，阻碍了基质和产物的传质。有文献也报道过类似情况。因此，在大于2.0的给酶量下，相对酶活缓慢降低。由此可推断，磁性微球上的结合位点有限，而酶需要足够的空间去催化基质反应。 图6. 固定化脂肪酶的相对酶活，反应条件:0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)、30?、8h 3.2.2 反应时间对脂肪酶活力的影响 为了有效促进共价耦合并避免脂肪酶因反应时间过长而钝化，选取一个最佳反应时间是非常重要的。图7阐明了不同制备时间对固定化脂肪酶的相对活性的影响。相对酶活随着反应时间的增长而上升，直至反应8小时时达到最大值。然而，时间继续增长，相对酶活反而下降。太长的偶联时间会降低固定化酶的相对酶活。 图7. 反应时间对固定化脂肪酶的相对活性的影响。反应条件:0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)、30?、给酶量为2.0ml 0.5%PPL/100mg 载体 3.2.3 pH值对脂肪酶活力的影响 图8显示了恒温下pH值对脂肪酶活力的影响及固定化酶的最大酶活百分比。pH为8.0时相对酶活最大。正如其他蛋白质变性一样，脂肪酶的失活速率和溶液的pH值有很大关联。带点功能基团的质子化和去质子化作用取决于溶液的pH值。固定化脂肪酶的最佳条件是:固定化时间8h，pH8.0，给酶量0.1gPPL/g载体。在此条件下，固定化脂肪酶活力回收可达63% (72.3%)，此时蛋白质结合量是39 (70.5) mg/g载体。 图8. pH对固定化脂肪酶的相对活性的影响。反应条件: 30?、给酶量为2.0ml 0.5%PPL/100mg 载体 3.3 pH值对脂肪酶活力的影响 在不同的pH下比较游离酶和固定化酶的相对活力。图9显示了不同pH下固定化酶和游离酶的相对活力的变化，它们各自的最佳pH值为8.0和7.5。和游离酶相比，固定化酶显示出了更广的pH适应范围。固定化后，酶的最适宜pH值往碱性范围增大了0.5个单位。这个变化取决于相应的固定化方法和载体的结构与性能。这种现象可能归因于脂肪酶分子在磁性微球上的多点结合。 图9. pH对游离脂肪酶及固定化脂肪酶的相对活性的影响。在磷酸缓冲液(0.1M，pH5.0-9.0)、37?下反应30min 3.4 温度对脂肪酶活力的影响 如图10所示，用橄榄油作为基质来考察温度对游离酶和固定化酶的相对活力的影响。游离酶的最适宜温度是40?，而固定化酶是50?。固定化脂肪酶在40?以上尚不失活。温度上升，游离酶的相对酶活降低的速度比固定化酶快。固定化酶的最佳催化反应温度可达50?，比起溶液酶要高。数据显示出磁性微球在10?的温度上升后依然有良好的热稳定性。最近也有过与此类似的报道。这说明固定化酶有更好的耐热性。固定化酶对环境温度的适应能力提高，是由于固定化时，酶蛋白分子构象的完整性发生了改变的缘故。 图10. 温度对游离脂肪酶及固定化脂肪酶的相对活性的影响。在磷酸缓冲液(0.1M，pH7.0)、20-80?下反应30min 3.5 固定化脂肪酶的热稳定性 在应用上，固定化脂肪酶的热稳定性是一个很重要的标准之一。今测量游离脂肪酶和固定化脂肪酶的相对酶活来测试固定化脂肪酶的热稳定性。图11列出了在50?，pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，游离酶和固定化酶的热稳定性比较。两种酶都呈现了相似的趋势，但固定化酶的热稳定性比游离酶好。此结果与近期研究文献结果一致。这说明了当脂肪酶固定于载体上时会更加稳定。这可能是因为固定化后分子间较微弱的相互作用力和固定化阻止了脂肪酶的自动分解。 图11. 游离脂肪酶及固定化脂肪酶的热稳定性。在磷酸缓冲液(0.1M， pH7.0)、50?下反应不同时间 3.6 固定化脂肪酶的复用性 固定化酶的最显著优点就是其复用性。用催化复用性来衡量固定化脂肪酶的稳定性。如图12所示，固定化脂肪酶的活性在四轮催化反应过后有显著降低。然而，固定化脂肪酶具有很好的稳定性，在10轮催化反应过后的剩余酶活达80.23%。以此证明固定化脂肪酶在刚开始时，吸附能力和活性方面不会失活或变性。活性下降可能是因为最后的脂肪酶脱附，载体上只残余少量吸附很强的脂肪酶及脂肪酶的结构改变。 图12. 固定化脂肪酶水解橄榄油的复用性。 3.7 己基醋酸盐的合成 笔者研究过用磁性微球固定化脂肪酶在有机溶剂中催化醋酸和己醇进行酯化反应合成己基醋酸盐及该反应的最佳条件。酯化反应在65?下的正庚烷溶液中进行，底物浓度为0.2M，酸和乙醇的摩尔比为1:1。在0.10 g/ml 的溶液中加入4 Å的分子筛作为水相吸附剂。在此条件下反应12h，酯化率可达83% (72.5%)。该结果说明用固定化脂肪酶催化的酯化反应所需条件温和，酯化率高，并且产物容易分离。磁性微球的这种性质将会对己基醋酸盐的连续化合成加工的发展非常有用。 4.结论 本实验用温和的悬浮聚合法制备了修饰有环氧基的磁性复合微球 (GMA-DVB-MAA)。它们具有超顺磁性，饱和磁强度为12.18 emu/g。