【doc】血液、脑脊液中尼可刹米的HPLC法分析

【doc】血液、脑脊液中尼可刹米的HPLC法分析 血液、脑脊液中尼可刹米的HPLC法分析 皇蕉生笠塑 血液,脑脊液中尼可刹米的HPLC法分析 陈礼莉,廖林川,颜有仪(四川大学华西基础医学与法医学院,成都610041) ? 技术交流? 摘要:目的建立血液,脑脊液中尼可刹米的HPLC检测方法.方法取空白血液或脑脊液添加不同量的尼 可刹米对照液,碱化后用二氯甲烷等有机溶剂提取,用I-IPLC方法检测.对方法的萃取回收率,线性,精密度等 萃取回收率大于60%.血液中尼进行考察.结果方法选用二氯甲烷作为萃取溶剂, 可刹米的在0.5, lOOt~g/ml范围内线性良好,R2为0.9993;脑脊液中尼可刹米的线性范围为0.1,lOOt~g/m1.R2为0.9996.最低 检出限是5ng(s/N?3).检测血液和脑脊液中的尼可刹米方法的精密度均小于6%.结论所建方法准确,简 便,灵敏度高,适用于法医毒物分析和临床药物分析. 关键词:法医毒物分析;尼克刹米;HPLC 中图分类号:DF795.1文献标识码:A文章编号:1008—3650(2005)05—0031—03 Determinationofnikethamideinbloodandcerebrospinalfluid CHENLi—li,LIAOLin—chuan,YANYou—yi(WestChinaPreclinicalandForensix"MedicineCollege,SichuanUniversity, Che.~u610041,China) AKgrRACr:ObjectiveTodevelopahigh—performanceliquidchromatographicmethodfordeterminationofnikethamideinhuman blc~dandcerebr~spinalfluid.MethodsThecompoundsWaSextractedfromblc~dorcerebro spinalfluidbyliquid—liquidextractionusing dichloromethaneafterblc~dorcerebr~spinalfluidwasadjustedpH.Theextractswereanalyz edbyHPLC.ResultsLinearlimitsof nikethamidedeterminationinblc~drangedfrom0.5mltO100/~g/ml(R2=0.9993).Linearlimitsofnikethamidedeterminationin cerebr~spinalfluidrangedfrom0.1"g/mlto100/~g/ml(R2=0.9996).LimitofdetectionWaS5ng(s/N?3).Theextractionrecovery wasover60%anditscoefficientsofvariationwerelessthan6%.ConclusionThemethodiSsensitive,simple,rapidandsuitablefor determinationofnikethamideinhumanbloodandcerebrospinalfluidfortoxicologicalandcl inicalpharmaceuticalanalysis. KEYWORDS:Forensictoxicologyanalysis;nikethamide;HPLC 尼可刹米是呼吸中枢兴奋剂,常用于治疗呼吸衰 竭.同时尼可刹米也是滥用药物之一,属运动员违禁 药物之一.故生物检材中尼可刹米的检测对于法医 毒物学和临床医学都很有意义.尼克刹米的分析方 法有GC[1.2],(MS[3],TLC[2],分光光度法[,磷光 分析5_5.用HPLC分析生物检材中的尼可刹米的方 法未见报道.本文建立了血液,脑脊液中尼可刹米的 HPLC分析方法,报道如下. 1仪器与试剂 仪器:高效液相色谱仪配以二极管阵列检测器 (美国惠普HPllO0);紫外可见分光光度计(日本岛津 UV一260). 作者简介:陈礼莉(1974一),女.四川资中人,硕士研究生. 主要从事法医毒物分析. 通讯作者:廖林川,Tel:(028)85501636,E-mail:linchuarliao@ 163.com 药品与试剂:尼克刹米注射液(0.375g/1.5ml,朝 晖制药厂生产),盐酸利多卡因注射液(100mg/5ml, 朝晖制药厂生产),甲醇(色谱纯,Fisher),超纯水(电 阻>18Ml2),其余试剂均为国产分析纯. 对照溶液的配制:尼可刹米用甲醇配制成2mg/ m1,盐酸利多卡因用甲醇配制成0.2mg/ml,4C贮存 备用. 2实验方法和结果 2.1样品的处理 精密吸取血液或脑脊液lml,置于10ml具塞离 心管中,滴加氨水使其pH值为10,加二氯甲烷3ml, 漩涡振摇3min,离心(4000r/min)15min,分取二氯甲 烷层;残液再加入二氯甲烷2ml,重复上述操作,合并 两次二氯甲烷提取液.于60?水浴上挥干,残渣用 甲醇溶解,定容至100t*l.HPLC进样20t*l. 2.2HPLC色谱条件 (150ram×4.6mm,5/,m), Diamonsil钻石C18柱 ? 3】? 同样填料短柱为预柱;流动相:甲醇:水(其中含二乙 胺2%,冰醋酸4.5%)=20:80;流速:lml/min;检测 波长:263nm;柱温:25?,进样量:20l. 在上述条件下,用尼可刹米对照品及血液和脑脊 液处理后样品进样检测,保留时间是16.981min,峰 形对称,且能与内源性杂质分开.尼可刹米对照品色 谱图见图1. 2.3线性关系与检测限 2.3.1测定血液中尼可刹米的线性关系与检测限 取空白血液1.0ml,6份,分别加入不同浓度的尼可刹 米,使血液中的尼可刹米浓度分别为0.5,1,5,10, /ml,混匀后按上述方法处理样品.50,100,ug在上述 的色谱条件下检测,以浓度与尼可刹米的峰面积作线 性回归,线性范围为0.5,100gg/ml,线性关系良好, R2=0. 9993,最低检出限为5ng(s/N?3). 2.3.2测定脑脊液中尼可刹米的线性关系与检测限 取空白脑脊液1.0ml,6份,分别加入不同浓度的尼 可刹米,使脑脊液中的尼可刹米浓度分别为0.1,1, 10,25,50,100gg/ml,混匀后按上述方法处理样品. 在上述色谱条件下检测,以浓度与尼可刹米的峰面积 进行线性回归,线性关系良好,R2=0.9996,线性范围 为0.1,100gg/ml. 2.4精密度实验 取高,中,低三种浓度尼可刹米的血液或脑脊液, 每种浓度取3次,在同Et内和在不同Et用同一条 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线及同一台HPLC仪检测,其结果见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1. 表1测定血液,脑脊液中尼可刹米的精密度实验(n=3) 2.5革取回收率实验 取空白血液或脑脊液9份,分别加入高,中,低三 种浓度尼可刹米对照液,每个浓度各三份,按照样品 处理方法萃取后用上述色谱条件检测.同时测定每 种浓度同量对照液,将萃取后样品的测定峰面积比对 照液峰面积,得到萃取回收率,结果见表2. ? 32? 皇蕉QQ生笠 表2测定血液,脑脊液中尼可刹米的回收率实验(n=3) 3讨论 (1)萃取pH的选择.尼可刹米的pKa是7.1,呈 弱碱性,笔者考察了用二氯甲烷为提取溶剂时,不同 pH值对萃取回收率的影响.结果显示在pH为8,9 时,萃取回收率低于55%,pH为9,10时,萃取回收 率高于60%.故选择了pH10作为萃取pH值. (2)提取溶剂的选择.据中国药典记载,尼可刹 米能与水,乙醚,乙醇,氯仿等任意混合.笔者考察了 乙醚,苯,氯仿,二氯甲烷等对生物检材中尼可刹米的 提取回收率情况.在pH值为10时,发现乙醚的萃取 回收率仅为35%左右,苯的萃取回收率也不到50%, 二氯甲烷的萃取回收率与氯仿相近,在60%以上,已 高于50%,已达到生物检材萃取回收率的 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 .因 二氯甲烷的挥发性较氯仿大,且毒性弱于氯仿,故选 择了二氯甲烷作为提取溶剂. (3)由于尼可刹米在体内代谢迅速[,所以对其 萃取的回收率不高.本方法的萃取回收率已高于 且因为临床 50%,达到生物检材萃取回收率的要求, 上用于抢救的尼可刹米的量较大,本方法的检测限达 到5ng,检测灵敏度较高,能达到分析血液,脑脊液中 尼可刹米原药的要求. (4)临床上常使用尼可刹米抢救利多卡因过量中 毒的情况,尼可刹米结构相似于麻醉药利多卡因,两 者保留行为接近.因此在分析尼可刹米的时候,须注 意利多卡因对它的干扰.当流动相为甲醇:水(其中 含二乙胺2%,冰醋酸4.5%)=55:45,流速为lml/ min时,尼克刹米与利多卡因的峰完全重合.随着流 动相中甲醇比例的减少,尼可刹米的保留时间延长, 尼可刹米和利多卡因峰逐渐分开.当流动相为甲醇: 水(其中含二乙胺2%,冰醋酸4.5%)=20:80,流速 为lml/min,尼克刹米和利多卡因以及血液,脑脊液 中的内源性杂质才得到较好的分离,尼可刹米和利多 卡因的分离度大于1.5(见图2,3). 型皇Q生笠 图1琶可刮米对照品的色谱图;图2血液提取舌的雹可剖_长和刊多卡因的色譬图; 图3脑脊液提取后的尼可剁米和利多卡因的色谱图 (5)在上述工作的基础上,考虑到临床上麻醉药 过量时常会用尼可刹米作为抢救药品,故分析尼可刹 米时除了须注意利多卡因对其检测的干扰,还需考察 其他常用的麻醉药如普鲁卡因,氯胺酮,罗哌卡因,布 比卡因等是否会对尼可刹米的检测造成干扰.在本 方法的色谱条件下,常用的麻醉药如利多卡因,普鲁 卡因,氯胺酮,罗哌卡因,布比卡因等均不会干扰可 刹米的检测.而且为了解决麻醉药过量而导致的医 疗纠纷中.要求检测血液,脑脊液中麻醉药量的问题, 笔者考察了上述分析条件对利多卡因的定量检测情 况.结果显示利多卡因在血液中线性范围是0.5, 20t~g/ml,R2为0.9992;脑脊液中利多卡因的线性范 围为1,200t~g/ml,R2为0.9994,最低检出限是 0.1g(S/N>~3).萃取回收率在血液和脑脊液中分 别是80%和85%.说明上述HPLC分析方法同样适 合于醉药利多卡因的检测. 参考文献: [1]NewtonJM.Gas—liquidchromatographicdeterminationof nikethamideininjectablepreparations[J].JAssocOff AnalChem,1976,59(1):93—79. 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