第七章 细胞培养及动力学1

第七章   细胞培养技术及动力学Operationofbioreactor反应器操作1.Batchoperation间歇反应Periodsofoperationforbatchoperation1.Batchoperation2.Semi-continuousorfed-batchoperation半连续操作3.Continuousoperation连续操作本章主要 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 讨论间歇培养和连续培养这两种基本 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ，然后对其它培养方法进行扩展讨论。7.1微生物反应过程的计量学化学计量学：是对化学反应的组成和化学反应转化程度的数量化研究。A+BC+D元素平衡法化学计量学反应 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 学反应热力学反应动力学根据化学计量学，可知有关反应过程中各种反应组分的数量关系。研究化学计量学的目的是对反应过程进行控制和优化，争取获得最大的经济收益。微生物反应过程的计量学：碳源（多种）+氮源（多种）+无机盐（多种）+有机生长因子（多种）+水+氧气细胞+主产物+副产物（多种）+二氧化碳对于微生物反应过程，由于参加反应的组分多，代谢途径错综复杂，同时微生物在生长，并且微生物菌体也不能用摩尔—摩尔的对应关系表示其计量关系。所以要用元素平衡的方法对微生物反应进行计量，将是十分复杂和困难的。工程上又不能回避这个问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，每一个工业化的微生物反应过程都需要计量。人们提出了一个相对简单的方法，就是引入得率系数（Yieldcoefficients）的概念，作为描述微生物反应中计量关系的宏观参数。得率系数有以下几种定义：1、对基质的细胞得率Yx/s(Monod提出的)Yx/s==生成细胞的质量消耗基质的质量△x-△s在分批培养时，培养基的组分在不断地变化，因此在培养过程中细胞得率系数不能视为常数，在某一瞬时的细胞得率称为微分细胞得率（或者称为瞬时细胞得率）。分批培养过程，总的细胞得率为：Yx/s＝x0、s0：反应开始时细胞和基质浓度xt、st：反应结束时细胞和基质浓度xt-x0s0-st2、对碳的细胞得率Yc考虑碳源基质时，无论是需氧还是厌氧培养，宏观上碳源的一部分被同化为细胞组成物质，其余部分分别被异化、分解为二氧化碳及其它代谢产物。为了表示由碳源同化为细胞组成物质过程的转化效益，采用对碳的细胞得率YcYc=Yc<1 一般在0.4~0.9左右的范围内。生成细胞量×细胞含碳量基质消耗量×基质含碳量3、对ATP生成的细胞得率YATP微生物通过基质的氧化而获得细胞合成、物质代谢、物质传递过程等生命活动所必需的能量。但是它并不是利用了基质氧化的全部能量，而只有在氧化反应中以生成ATP形式获得自由能，被微生物生命活动所利用，其余部分作为反应热释放到环境中。据此，ATP的生成量和细胞生长量有关联，以异化代谢过程中ATP的生成量作为细胞得率的基准。YATP表示为：YATP＝碳源对菌体的得率消耗1mol碳源由分解代谢产生ATP的摩尔数根据大量实验发现，在厌氧培养时，YATP值与微生物、基质的种类无关，基本上为常数，YATP=10YieldcoefficientsBiomass/substrate:Yx/s=-△x/△sProduct/substrate:Yp/s=-△p/△sProduct/biomass:Yp/x=-△p/△x7.2微生物反应动力学的描述方法细胞生长动力学微生物反应动力学反应基质消耗动力学代谢产物生成动力学1、模型的简化细胞的生长、繁殖代谢是一个复杂的生物化学过程。该过程既包括细胞内的生化反应，也包括胞内与胞外的物质交换，还包括胞外的物质传递及反应。该体系具有多相、多组分、非线性的特点。多相指的是体系内常含有气相、液相和固相；多组分是指在培养液中有多种营养成分，有多种代谢产物产生，在细胞内也具有不同生理功能的大、中、小分子化合物；非线性指的是细胞的代谢通常需用非线性方程来描述。FreshMediaFeedDissolveO2SensorThermocoupleInletAirFlowExitGasFlowAcid/baseAntifoampHSensorLevelSensorAgitatorSparserExitLiquidFlow同时，细胞的培养和代谢还是一个复杂的群体的生命活动，通常每1ml培养液中含有104~108个细胞，每个细胞都经历着生长、成熟直至衰老的过程，同时还伴有退化、变异。因此，要对这样一个复杂的体系进行精确的描述几乎是不可能的。为了工程上的应用，首先要进行合理的简化，在简化的基础上建立过程的模型。要简化的内容有以下几点：①微生物反应动力学是对细胞群体的动力学行为进行描述。②不考虑细胞之间的差别(Treatedallcellsasequivalent)，而是取其性质上的平均值。（在此基础上建立的模型称为非确定论模型Unsegregated）。③在细胞的生长过程中，细胞内各种成分视为以相同的比例增加，而且忽略环境的变化对菌体组成的影响。两个概念：均衡生长和非结构模型。在细胞的生长过程中，如果细胞内各种成分均以相同的比例增加，则称为均衡生长；那么非均衡生长呢？细胞生长时胞内各组分增加的比例不同，称为非均衡生长。结构模型：细胞的组分是复杂的，有蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸、维生素等，这些成分的含量大小随环境条件的变化而变化。如果是在考虑细胞组成变化的基础上建立的模型，则称为结构模型，它能从机理描述细胞的动态行为。在结构模型中，一般选取RNA、DNA、糖类及蛋白质的含量作为过程的变量，将其表示为细胞组成的函数。但是，由于微生物反应过程极其复杂，加上检测手段的限制，缺乏可直接在线测量的传感器，给动力学研究带来了困难，致使结构模型的应用受到了限制。如果把菌体视为单组分，则环境的变化对菌体组成的影响可被忽略，在此基础上建立的模型称为非结构模型。它是在实验研究的基础上，通过物料衡算建立起经验或者半经验的关联式。Structured-“detailed”intracellulardescriptionUnstructured-“simple”intracellulardescription从模型的简化考虑一般采用：均衡生长的非结构模型2、反应速率的定义常采用两种速率概念：绝对速率和比速率①绝对速率（又简称为速率）细胞生长率rx=基质消耗速率：rs=产物生成速率：rp=dxdt-dsdtdtdp这些速率的单位：g/L·h②比速率Specificgrowthrate比生长速率μ=[h-1]基质消耗比速率：[h-1]产物生成比速率：[h-1]比速率和细胞量有关，比速率的大小反应了细胞活力的大小。dxdt1dxdtx1dxdtx1dsdtx1dsdtSection2.Batchcultureandkinetics分批培养：是指在灭菌后的培养基中，接种微生物（某种），开始在一定的条件下培养微生物，在培养过程中不再向培养基中加入或移去主辅物料（如果是需氧微生物，则需不断通风供氧）的培养方式。分批培养的最大特点是：反应体系的微生物浓度和生理状态随培养时间变化，反应体系中的营养成分和代谢产物亦随培养时间变化。2.1MicrobialgrowthkineticsMicrobialgrowthkineticsdescribedhowthemicrobegrowthinthefermenter.Thisinformationisimportanttodetermineoptimalbatchtime.MicrobialgrowthkineticsThegrowthofmicrobesinafermentercanbedisassembledintofourstages:-Lagphase-Logphase-Stationaryphase-DeathphaseMicrobialgrowthkineticsLagphase-Thisisthefirstphaseinthefermentationprocess.-Thecellshavejustbeeninjectedintoanewenvironmentandtheyneedsometimetoadjustaccordingly.-Cellgrowthisminimalinthisphase.MicrobialgrowthkineticsLogphase-Thesecondphaseinthefermentationprocess.-Thecellshaveadjustedtotheirenvironmentandarapidgrowthtakeplace.-Cellgrowthrateisthehighestinthisphase.MicrobialgrowthkineticsLogphase-Atsomepoint,thecellgrowthratewillleveloffandbecomeconstant.-Themostlikelycauseofthisleveloffissubstratelimitedinhibition.-Substratelimitedinhibitionmeansthatthemicrobesdonothaveenoughnutrientsinthemediumtocontinuemultiplying.MicrobialgrowthkineticsStationaryphase-Thisisthethirdphaseinthefermentationprocess.-Thecellgrowthratehasleveledoffandbecomeconstant.-Thenumberofcellsmultiplyingequalstothenumberofcellsdying.MicrobialgrowthkineticsDeathphase-Thefourthphaseinthefermentationprocess.-Thenumberofcellsdyingisgreaterthanthenumberofcellsmultiplying.Thecauseofthedeathphaseisusuallythatthecellshaveconsumedmostofthenutrientsinthemedium,andthereisnotenoughnutrientsleftforsustainability.MediaforindustrialfermentationThemediaisthefeedsolution-Itmustcontaintheessentialnutrientsneededforthemicrobetogrow.Factorsneedforconsiderationwhenchoosingmedia:-Qualityuniformityandavailability.-Ensuretherearenoproblemswithmediaprepareorotheraspectsofproductionprocess.Ex.Canemolasses,beetmolasses,cerealgrains.ThedevelopmentofinoculaforindustrialfermentationTheinoculumisthestarterculturethatisinjectedintothefermenter.-Itmustbeofsufficientsizeforoptimalgrowthkinetics.Sincethefermenterforproductioninindustrialfermentationissolarge,theinoculumvolumhastobequitelarge.-Aseedfermenterisuauallyrequiredtoproducetheinoculum.-Theseedfermenter’spurposeisnottoproduceproduct,buttoproduceinoculum.Aboutlagphase在发酵工业生产中，为了提高生产效率，缩短生产的周期，希望延迟期缩短，要达到该目的，应一般遵循下列 规则 编码规则下载淘宝规则下载天猫规则下载麻将竞赛规则pdf麻将竞赛规则pdf ：(1)接种的微生物应尽可能是高活力的（要用处于指数期的微生物作种子）。(2)用于培养种子的介质和条件应尽可能接近生产上使用的发酵液组成和培养条件。(3)采用大接种量。因细胞内部的某些维生素和辅酶等生长素，向周围培养液发生过多的扩散，从而降低细胞的活性，延长延迟期。Aboutlogphase对数生长期的微生物生长速率正比于原有的微生物数，因此可以直接得出微生物的基本生长动力学方程：=μxμ=因为微生物以自我复制的方式增殖，所以微生物生长速率与现存的细胞量或菌体浓度x成正比，那么以对数生长方式生长也是必要的。dxdtx1dxdt=μxμ=μ为比生长速率为生长速率x为菌体浓度，t为培养时间虽然以上方程由对数生长期得出，但对其它生长期也同样适用。μ在对数期是常数，取得最大值，在其他生长期不是常数。分析各生长不同时期的μ数值。dxdtx1dxdtdxdtLagphasex无净生长μ=0加速生长期x增加μ2>μ1Logphasex对数增加μ=常数减速生长期x增加缓慢μ4<μ3Stationaryphasex无净生长μ=0Deathphasex减少μ<02.2微生物生长速率与底物浓度的关系微生物的生长速率受到许多因素的影响，T、pH、底物浓度都影响微生物的生长速率。这里需要提出来讨论的是底物浓度与微生物生长速率之间的关系。在一定条件下，微生物的生长速率是底物浓度s的函数 ＝f(s)这是怎样的函数关系呢？dxdt1949年Monod发现，细菌的比生长速率与单一限制性底物之间存在这样的关系：μ=μmμ:比生长速率(h-1)μm:最大比生长速率(h-1)KS:微生物生长的饱和常数(g/L)S:限制性底物浓度SKS+SS=ConcentrationofratelimitingsubstrateKS=Saturationconstantμm=Maximumspecificgrowthrate(S>>KS)Monod模型是典型的均衡生长模型，其基本假设如下：（1）描述细胞生长的唯一变量是细胞浓度X；（2）培养基中只有一种基质是生长限制性基质，其他组分均过量；（3）细胞的生长视为单一反应，细胞得率为常数，当S<>KS时，μ=μm，μ与S是零级动力学关系；什么是限制性底物(Limitedsubstrate)？可以是培养基中任何一种与微生物生长有关的营养物，只要该营养物相对贫乏时，就可能成为限制微生物生长的因子，可以是C源、N源、无机或有机因子。那么营养物质相对贫乏指的是多少量呢？是指该物质的浓度低于比生长速率μ达μm时对应的最低底物浓度Scrit时的情形。Scrit称为临界底物浓度，任一营养物质的浓度若高于Scrit则为非限制性底物，低于Scrit即为限制性底物。μSScrit所以限制性底物就是在培养微生物的营养物质中，对微生物的生长起到限制作用的营养物。μ=μm莫诺方程表面上与米氏方程同型。但是Monod方程来自于对实验现象的总结，而米氏方程是根据酶促反应机理推导出的。前者是经验方程，后者是机理方程。SKS+S莫诺方程中的动力学常数μm和KS可以用倒数作图法得出。Hanes作图用前一方程图解时，可得到相当精确的μm值，但在低S值时，的偏差较大，影响KS值的精度。第二方程好用一些，在低S值时精度高。也可用线性回归方法。1μ=1μm+KSμm·1SSμ=1μm+KSμm·S一些典型的μm和KS值可见，典型的ks值很小，实验时用的底物浓度很小，这样低的s值，又要快速测出它的变化量，那就要采用极为灵敏的、准确的测定底物和菌体浓度的方法，才能通过测定间歇培养的初速度反应来测定ks值。Monod方程适用于许多微生物生长过程，但是因该方程表述简单，不足以完整地说明复杂的生化反应过程，已发现它在某些情况下与实验结果不符，因此人们又提出了另外一些方程来描述微生物的生长。如Powell提出的：μ=μm考虑到细胞壁的渗透性和基质的扩散性，引入KD因子，称为扩散阻力常数。S（KS+KD）+S2.3有抑制的细胞生长动力学（1）Substrateinhibitionkinetics与酶促反应类似，有时当培养基中某种基质的浓度高到一定程度时后，细胞的比生长速率随该基质浓度的升高而下降，表现出基质的抑制，提出了一些描述基质抑制的生长动力学模型。μ(S)=KⅠ=inhibitionconstantμmSKS+S+S2/KⅠ（1）SubstrateinhibitionkineticsμμmKSKIS当S=细胞的生长速率达最大，其值为：√KSKIS√KS/KISμm1+2√KS/KIS举例：1乳酸和酒精的双边发酵2流加培养(2)Productioninhibitionkinetic细胞的一些代谢产物有时会影响细胞的生长，如酵母在厌氧条件下产生的乙醇会抑制酵母的生长，乳酸菌产生的乳酸会抑制乳酸菌的生长。μ(S,P)=-P=productconcentration-Pm=productconcentrationwhereμ=0μmSKS+S1-PPm1-PPm(2)Productioninhibitionkinetic几种产物抑制类型1.线性；1a.一级下降；2和2a.先不影响后下降；3.突然终止；2.4基质消耗动力学在分批培养中，培养基质的减少是由于细胞和产物的生成。可以用细胞得率系数Yx/s把基质消耗速率和细胞生长速率相关联。如果限制性基质是碳源，消耗的碳源的一部分形成细胞质，一部分形成产物，一部分产生能量供细胞维持生命活动之用。即：其中YG—细胞的生长得率系数g/molm—细胞的维持系数mol/g·s；YP—产物得速率系数mol/g·s2.5产物生成动力学Productformationrates微生物反应生成的代谢产物多种多样，其产物生成动力学远比菌体生长动力学复杂。发酵产物的生成速率与菌体生长速率之间大致存在三种不同类型的关联。(1)生长偶联型Growthassociatedproducts(2)部分生长偶联型Mixedgrowthassociatedproducts(3)非生长偶联型Nongrowthassociatedproducts以上我们讨论了细胞生长、基质消耗和产物生成的动力学方程，由这些方程构成的（微分）方程组，反应了分批培养中细胞、基质和产物浓度的变化。如果通过实验摸清细胞生长、基质消耗和产物生成的规律，建立适当的微分方程组，并确定其中动力学参数的值，就可以对分批培养过程进行模拟，从而有可能对分批培养进行优化控制，使产物的生产速率大大提高。