毒理学实验报告

久效磷毒性评价实验90906114李钦2013/05/08PKUHSC工业品久效磷的急性毒性与遗传毒性试验久效磷，英文通用名称为monocrotophos，学名O,O-二甲基-2-甲基氨基甲酰基-1-甲基乙烯基磷酸酯，分子式为C7H14NO5P，分子量为223.16。结构式为：对光较稳定，但热稳定性较差。对钢和铁有腐蚀性。纯品为无色结晶，熔点为54～55℃。工业品为红棕色稠状液体，熔点为25～30℃。沸点（0.399Pa）120～125℃，相对密度（20℃）1.33，折射率n25D1.4783；蒸气压（20℃）9.33×10－4Pa、30℃）1.867×10－4Pa。在正辛醇中的溶解度为z5％、（甲苯中为6％，稍溶于乙醚，微溶于四氯化碳，不溶于石油醚，正己烷中溶解度为0.05％。可溶于水、甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙二醇和苯等。在酸性、中性介质中较稳定。是一种高效内吸性有机磷杀虫剂，具有很强的触杀和胃毒作用。作用机制为抑制昆虫体内的乙酰胆碱酯酶。资料显示雄性大鼠、雌性大鼠经口LD5017mg/kg、20mg/kg。大鼠经皮LD50为122mg/kg；兔经皮LD50为354～709mg/kg。对鸟高毒，鹌鹑急性经口LC50约0.1mg/L（7d）。两年饲喂试验 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，大鼠无作用剂量为每天lmg/kg，狗为每天1．6mg/kg。对兔皮肤和眼睛有轻微刺激作用。第一部分40%久效磷的急性毒性试验本部分实验为急性毒性试验评价，包括霍恩氏法（horn’s）和简化寇氏法两部分，将受试物（40%工业品久效磷）以不同剂量经口给予试验动物，以实验动物死亡作为观测终点，依据剂量-反应关系，经过统计学方法处理求得受试物的致死剂量，并计算出引起实验动物群体半数动物死亡的剂量，即（LD50）。霍恩氏法（horn’s）一、实验动物健康的成年ICR小鼠，雌雄各半，体重18~26g，由北京大学医学部毒理学系实验室于实验前准备。自由摄食饮水。二、试剂与器材40%工业品久效磷、苦味酸酒精饱和溶液、蒸馏水、一次性注射器（1.0ml）、吸量管（1ml、2ml、5ml）、容量瓶（25ml、50ml）、烧杯（10ml、50ml）、吸管、小鼠、灌胃针头、动物称、洗耳球、滤纸。三、实验方法1.实验动物的分组：采用配伍组 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 法，即将小鼠按体重从小到大排序，分别将雌雄各10只小鼠编成2个配伍组，即1-5号为第一配伍组，6-10号为第二配伍组。由随机数码表，随机指定4行，每行只取随机数字1-5，其余舍去，依次标记于各配伍组的小鼠编号下，每只小鼠号下面的随机数字即为该小鼠应分入的实验组。详见表1-1。表.1-1♀体重（g）19.119.119.219.619.719.719.920.120.520.9编号13475106298随机数4531212453♂体重（g）18.620.520.521.021.121.721.821.821.922.2编号12142415162319181713随机数24131324552.剂量设计：利用组距为2.15的剂量系列进行试验，选择剂量为2.15、4.64、10.00、21.50、46.4mg/kg体重作为受试剂量。受试物浓度（mg/ml,c）由单位体重给药剂量（mg/kg,d）和单位体重给药体积（ml/kg,v）决定，即c=d/v。组1到组5给药浓度分别为0.215、0.464、1.00、2.15、4.64mg/ml。3.动物处理和观察：由组A→组E的顺序按从低到高剂量顺序采用灌胃法给药。灌胃后即观察小鼠反应，并详细记录小鼠的各种中毒反应，反应出现的时间、强度、动物的死亡构成和死亡时间，死亡动物应解剖观察各个主要脏器有无异常变化。将观察结果整理成记录表格。急性毒性试验的观察期限一般为14天，但本实验由于时间限制，仅限课堂观察，于1小时后统计各组小鼠死亡情况。四、数据整理 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 1.E组实验情况如表1-1所示表1-1.E组染毒结果小鼠编号931317体重（g）20.519.122.221.9给药（ml）0.210.190.220.22给药时间15:0515:0715:0815:11症状出现时间15:1115:1515:1315:13死亡时间15:1415:2315:1615:342.各实验组小鼠死亡情况见表2-1所示表2-1.死亡结果组别第一组第二组第三组第四组第五组死亡00444结论：实验动物出现活动迟缓、管状尾、抽搐、瘫痪、流涎、肌肉震颤等毒性反应，多数致死。由于后三组小鼠均死亡，可知第五组的浓度完全高于最大致死剂量，可丢弃第五组的数据，利用前四组的数据查表知LD50为6.81mg/kg，表中未给出95%的置信区间。讨论：1.利用霍恩氏（horn’s）法用来进行对受试物的LD50的初步测定以及估算LD0和LD100，具有较为经济简便，耗费较少的小鼠，并且结果计算较为简单等优点。但由于实验过程较为简单以及结果计算是通过查表获得等原因，本实验设计有实验结果不够精确，以及有可能出现查表无法得到具体精确LD50值等缺点。2.本次试验结果并不理想，没有明显的剂量反应关系。由于是分组实验，实验过程中非处理因素差异较大，而且在实验过程中，由于部分操作者灌胃不太熟练，操作过程中对小鼠造成致命的损伤，以致出现后三组小鼠均全部死亡的结果。已知具体有第二组小鼠两只老鼠明确是灌胃不当致死，这里数据处理时并未将其放置死亡数内，而实际上那两只老鼠是有可能因为久效磷而致死，由于实验动物少，造成较大的偏倚。3.由于后三组全部实验动物死亡，考虑是否剂量设计的浓度梯度太大，而久效磷LD0与LD100差距很小，或者最高剂量走的太高，以致有效实验结果减少，因此可减小浓度低度和最大剂量再次试验进行验证。4.本实验基本得到久效磷的LD50初测值，以备下次简化寇氏法进一步实验。简化寇氏法一、实验动物健康的成年ICR小鼠，体重18~26g，雌雄各半，由北京大学医学部毒理学系实验室于实验前准备。自由摄食饮水。二、试剂与器材40%工业品久效磷、苦味酸酒精饱和溶液、蒸馏水、一次性注射器（1.0ml）、吸量管（1ml、2ml、5ml）、容量瓶（25ml、50ml）、烧杯（10ml、50ml）、吸管、小鼠灌胃针头、动物称、洗耳球、滤纸。三、实验方法1.实验动物的分组：采用配伍组设计法，分组结果详见下表♂体重21.021.221.221.221.922.022.122.422.523.0（g）编号1529146161917234随机数5143225143♂体重（g）23.023.323.324.324.725.025.926.326.327.0编号711012824513183随机数1543212453♀体重（g）19.920.120.421.221.321.421.621.621.721.8编号1716131814827101随机数5143225143♀体重（g）21.821.821.822.022.222.422.522.623.023.3编号623241291915345随机数15432124532.实验动物的处理：利用霍恩氏法得出的大致LD0、LD100及剂量组数n=5，选择合适的剂量组间的组距1.4，求得i=lg1.4=0.146。选择剂量为4.64、6.5、9.09、12.73、17.83mg/kg体重作为受试剂量。组A→组E给药浓度分别0.464、0.65、0.909、1.273、17.83mg/ml。3.灌胃观察：灌胃后即观察小鼠反应，并详细记录小鼠的各种中毒反应，反应出现的时间、强度、动物的死亡构成和死亡时间，死亡动物应解剖观察各个主要脏器有无异常变化。将观察结果整理记录表格。本次实验同样限于课堂观察，于1小时后统计各组小鼠死亡情况。四、实验结果及分析1.观察小鼠反应，于24小时后记录各组小鼠死亡情况，详细结果见下表1-1.表1-1.小鼠死亡情况组别剂量小鼠死亡数目死亡率第一组6.500第二组9.0970.875第三组12.7370.875第四组17.8370.875第五组4.65002.按照下述 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 计算受试物（久效磷）的LD50。lgLD50=Xm−i（Σp-0.5）Xm：最大剂量的对数值i：相邻两剂量比值的对数Σp：各剂量组动物死亡率总和SlgLD50=i√∑piqi/npi：各组动物死亡率qi=1-pin：各组动物数LD50的95%可信限区间：lg−1（lgLD50±1.96SlgLD50）代入数据得lgLD50=8.72mg/kg，95%置信区间为（7.64,9.97）。结论：1.实验过程中小鼠出现活动迟缓、管状尾、抽搐、瘫痪、流涎、肌肉震颤等毒性反应。2.lgLD50=8.72mg/kg，95%置信区间为（7.64,9.97）。3.根据简化寇氏法结果，参照《毒理学教程》（周宗灿主编，北大医学出版社，第三版）第739页全球化学品统一分类和标签制度（GHS）WHO/GHS·2005中急性毒性危害类别和急性毒性估计（ATE）值（表3）认为久效磷为第二类毒物。讨论:1.利用简化寇氏法进行工业品久效磷的急性毒性实验，其实验过程比霍恩氏法复杂，且消耗实验动物较多，但其实验结果通过统计学方法计算获得，结果准确度和可信度比较高。2.本次实验中，本组作为机动组，在参考其余组实验结果，改变原本高剂量设计，决定往低剂量方向走，对实验结果的计算准确性有一定贡献。3.本次实验剂量反应关系依旧不明显，这可能与操作者灌胃技术不到位，个别小鼠的特异性差别比较大有关。但较之前一次实验，结果较理想，基本得出了久效磷小鼠经口LD50极其置信区间。第二部分工业品（40%）久效磷的遗传毒性试验本部分试验主要包括AMES实验、小鼠骨髓多染红细胞微核实验和单细胞凝胶电泳三个遗传毒理学实验，并由此对工业品（40%）久效磷的遗传毒性进行评价。其中AMES实验由于条件限制，仅作了菌株鉴定部分。小鼠骨髓多染红细胞微核试验微核（Mironucleus）是由细胞分裂末期滞留的染色体片段或整条迟滞的染色体在分裂间期的子代细胞包浆内形成的游离团块物质。微核实验作为细胞遗传损伤的指标之一，可用于染色体断裂剂和纺锤体损伤剂的检测。当骨髓成红细胞发展成为红细胞时，主核排出，成为多染红细胞（polychromaticerythrocyte,PCE），这些细胞保持其碱性约24小时，然后成为正染红细胞（normochromaticerythrocyte,NCE），并进入外周血中，在主核排出时，已形成的微核可留在包浆中。因为在这些细胞中没有主核，便于观察微核。观察并计数多染红细胞中的微核，可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。本次试验的检测终点为染色体损伤。一、实验动物健康的成年ICR小鼠，体重30g左右，由北京大学医学部毒理学系实验室于实验前准备。二、试剂与器材工业品（40%）久效磷，环磷酰胺，pH6.8的小牛血清，甲醇，pH为6.8的磷酸缓冲液，Giemsa染液。一次性注射器（1.0ml）、小鼠灌胃针头、动物秤、滤纸、剪刀、镊子、0.25ml注射器、5号针头、纱布、载玻片、染色盘、染色架、固定用染色缸、显微镜等。三、实验方法1.实验动物分组：采用配伍组设计法，分组结果详见表1。2.剂量分组：设置阳性对照组、阴性对照组、高中低剂量组，阳性对照物采用环磷酰胺（120mg/kg），阴性对照物使用双蒸水。高中低剂量组的剂量分别为40%久效磷的1/2、1/4、1/8，即4.35、2.18、1.09mg/kg体重，详见表1。表1.小鼠骨髓多染红细胞微核试验剂量分组组别所给药物剂量（mg/kg体重）小鼠体重（g）阴性对照双蒸水--27.6；28.4；31.6；27.8；33.0低剂量组40%久效磷1.0932.2；34.4；31.6；28.3；31.6中剂量组40%久效磷2.1830.3；34.5；31.7；30.6；31.0高剂量组40%久效磷4.3536.1；33.8；27.5；28.6；34.2阳性对照环磷酰胺12028.3；30.6；32.0；28.0；24.53.染毒途径：经口灌胃途径染毒。4.染毒次数及骨髓采样时间：一次染毒，24小时后取样测定。5.取材：按照上面染毒24小时后，颈椎脱臼处死动物，仔细剥离并取下一侧后肢股骨。用纱布擦净碎肉，减去股骨两端，露出骨髓腔，用1ml的注射器吸取少量小牛血清（约0.02,ml）冲洗骨髓腔数次，冲洗物滴在玻片上。6.制片：蘸取骨髓液，推片3张，干燥后取其中较好的两张用甲醇固定2分钟。7.染色：用1:10的Giemsa-磷酸缓冲液（pH=6.8）染色约25分钟，自来水冲洗后，自然干燥。8.镜检：每只小鼠选择一张染色最成功的片子，低倍镜下观察染色及细胞分散情况，再在油镜下计数200个红细胞，计算多染红细胞（PCE）在总红细胞（PCE+NCE）中的比例，作为细胞毒性的指标。每例样本计数500个多染红细胞，记录有微核的细胞数。四、结果及分析1.实验结果详见表2表2.小鼠骨髓多染红细胞微核实验的结果组别动物数PCE/(PCE+NCE)多染红细胞数目有微核的多染红细胞数目有微核的占有比例阴性对照542.7%5000;0;0;0;00低剂量组524.87%5000;0;3;0;01.5‰中剂量组557.2%5000;0;0;0;00高剂量组573.25%5000;0;0;0;00阳性对照560.35%50028/500;45/500;8/397;1/8347.3‰分析：1.本次实验结果中未出现小鼠骨髓抑制的情况。2.利用Bonferroni法进行各组结果间差异的比较，结果：阳性对照组和其他各组的结果差异均有统计学意义，但是其余各组即阴性对照、低剂量组、中剂量组、高剂量组之间差异均无统计学意义。可见，初阳性对照，其余各剂量组没有表现出遗传毒性。阳性结果与其余各组的差异详见表3。表3.微核细胞率差异的显著性检验微核细胞率均值差标准误Sig.95%置信区间下限上限阳性-阴性0.04450.009580.0020.01410.0750阳性-低剂0.04330.009580.0020.01290.0738阳性-中剂0.04450.009580.0020.01410.0750阳性-高剂0.04450.009580.0020.01410.07593.利用SPSS对微核细胞率和灌胃剂量进行一元线性回归分析（α=0.05），得P=0.454，说明灌胃剂量和微核细胞率没有表现出明显的线性相关。结论：工业品（40%）久效磷微核试验结果阴性。讨论：1.微核实验通过微核细胞率来分析来评价受试物的遗传毒性，检测终点是染色体损伤，具有简单易行，经济高效的特点，有一定的信度和效度，广泛用于化学物遗传毒性检测。2.骨髓发生抑制时，外周血会发生反流，当PCE/(PCE+NCE)<20%时，即为此情况，应停止实验，本次实验结果中未出现小鼠骨髓抑制的情况。3.从本次实验所得结果上看，低中高三个剂量组均没有表现出遗传毒性。但是低剂量组发现有几个微核细胞，而中高剂量组并未发现微核细胞。具体分析如下：①由于是分组实验，在灌胃、取髓、制片的过程，因人而异，且操作的不熟练，可能造成一些细胞在制片过程中出现损伤，造成假阳性②微核试验结果为主观镜检，镜检过程标准不统一，第一次实验，各种细胞及微核的识别能力较差，可能产生误判情况③显微镜型号各异，视野清晰度因个人调教而异，也可能造成误判4.本实验得出了阴性结果，但是主要由于制片不够理想，阅片水平不高，影响了结果的判断。单细胞凝胶电泳实验单细胞凝胶电泳实验(SCGE)又称为彗星试验(cometassay)，是一个检测DNA断裂的基本方法。细胞核中，DNA呈环状附着在核基质上，细胞裂解过程中，核基质被溶解、抽提，DNA的结构则未发生变化。如果DNA链上存在缺口，则使DNA超螺旋变得松弛，DNA环向外展，同时由于暴露了阴电荷，在电场力的作用下，松动的DNA环向阳极迁移，但由于这种松动的DNA环一端仍附着于核DNA，其迁移距离受到限制，因此尾长并不总是真实反映链缺口的多少。实际依靠尾长与尾部的荧光强度同时来进行分析,可以对DNA损伤做出定性评价。一、试剂与器材1.试验细胞来源：成年健康的雄性ICR小鼠的脾细胞。2.试剂：①40%工业品久效磷②无钙、镁磷酸盐缓冲液：NaCl4.0g、KH2PO40.1g、KCl0.1g、Na2HPO40.58g、Na2HPO4·12H2O1.45g溶于500ml双蒸水中③琼脂糖：用无钙、镁磷酸盐缓冲液配制④细胞裂解液：NaCl2.5M73.05g、Na2EDTA·2H2O100mM18.6g、Tris10mM0.61g、肌氨酸钠1%5g、双蒸水400ml，先加入一些NaOH在磁力搅拌器上加热溶解。用NaOH调整PH值到10.0。加水定容至500ml。临用前加入TritonX-100至终浓度度1%⑤电泳缓冲液：Na2EDTA·2H2O1mM0.372g、NaOH300mM12g、双蒸水1000ml，临用时配制⑥中和液（0.4MTris-HCl）：Tris24.22g、双蒸水300ml、的浓HCl调整PH为7.5，加双蒸水至500ml⑦碘化丙啶（PI）5μg/ml，先配成储备液，然后稀释，用蒸馏水配制，4℃保存3.仪器：电泳仪、电泳槽、荧光显微镜、恒温水浴、剪刀、镊子、一次性注射器（1.0ml）、吸量管（1ml、2ml、5ml）、移液枪（100μl、250μl）、容量瓶（25ml、50ml）、烧杯（10ml、50ml）、吸管、小鼠灌胃针头、动物称重天平、洗洗耳球、滤纸。二、试验方法1.实验动物的分组：分组结果详见表1-1。表1-1.单细胞凝胶电泳实验小鼠编号、体重、剂量分组组别编号体重（g）受试物灌胃剂量阴性对照129.6双蒸水----低剂量232.1工业久效磷1.1mg/kg中剂量329.4工业久效磷2.2mg/kg高剂量432.4工业久效磷4.4mg/kg阳性对照529.6K2Cr2O740ｕmol/kg2.实验动物处理：根据表1-1对实验动物进行灌胃染毒3.胶板制备：①取大约35μl于56℃水浴中保温的0.5%普通熔点琼脂糖，铺于磨砂载玻片上形成底胶（为了增加胶板层与载玻片的粘性）②取大约150μl0.5%普通熔点琼脂糖加在底胶上，再于其上加盖玻片，4℃冷凝10分钟③处死动物：染毒后1小时颈椎脱臼处死小鼠。分别取1cm21/3脾脏置于盛有2.5mLHanks’液的小平皿中，在筛网中研磨，制备成单细胞悬液，取70μl悬液加入930μlHanks’液中待用，阳性对照组取1ml细胞悬液加入100μlK2Cr2O7，37℃孵育10分钟待用④取下盖片，取50μl于37℃水浴中保温的1.0%的低熔点琼脂糖与50μl细胞悬液（105个细胞/ml）混匀，立即铺片，加上盖玻片，4℃冷凝10分钟⑤去掉盖玻片，取70μl于37℃水浴中保温的0.5%的低熔点琼脂糖铺片，加盖玻片，4℃冷凝4.细胞裂解与电泳①将制备好的胶板去掉盖玻片后，浸于4℃预冷的细胞裂解液中，4℃裂解1小时②取出胶板，放入电泳槽中，浸泡在电泳液中解旋20分钟。③4℃电泳20分钟（25V，300mA）5.中和与染色①电泳结束，将胶板浸泡于中和液中，每次15分钟，共中和两次，之间更换中和液②取出胶板，置于染色架上，滴加5μg/ml的PI，暗处染色20分钟③蒸馏水脱色15分钟6.镜检：在荧光显微镜下观察，绿光激发吸收滤片590nm，荧光发射波长630nm照相记录。三、结果和分析阴性对照低剂量中剂量高剂量损坏阳性对结论：工业品（40%）久效磷SCGE试验阳性，有一定剂量反应关系。分析：1.上图中缺失部分为实验小组的载玻片未能进行镜检，导致数据的缺失2.由于试验条件和课堂时间的限制，对于本次实验结果的未进行定性分析，对比观察各组所得的镜检照片结果对彗星试验结果有一定的定性认识。从各组照片上看，各组的细胞均有出现彗星拖尾的现象。而阴性对照中胸腺细胞中也出现了明显的彗星细胞，相比之下，阳性照组出现明显的彗星细胞。本次实验中亦未观察到各剂量组间的明显剂量效应关系。讨论：1．SCGE是一种遗传毒性实验，检测终点是DNA损伤，具有简单、灵敏、多功能、快速、经济适用的特点，广泛用于遗传毒性的评价，并为评价标准之一。2．本次实验由于操作和实验条件所限，未能得出满意结论，查阅相关文献得久效磷对小鼠有遗传毒性作用，且SCGE实验有剂量反应关系。本实验部分阴性对照组片子出现拖尾现象的假阳性结果；未发现明显的剂量反应关系，具体分析如下：①制备细胞悬液时，由于研磨过度或者研磨不充分，导致细胞在固定前已有一定损伤，但查阅相关文献以及咨询带教老师，认为该步骤细胞损伤不大，不是造成假阳性的主要因素。②由于熟练度和实验条件限制，制备好细胞悬液后，放置了过长的时间方进行铺片，细胞已经出现同层度的损伤，且铺细胞层时，水浴中的琼脂糖温度较高，与细胞悬液混合后也可造成一定的细胞损伤，实验时未能有效控制。③裂解细胞时，过度裂解可能导致DNA损伤，认为这是产生假阳性的主要因素，本实验裂解时由于片子较多，局部裂解液浓度可能有差异，而且裂解时间未完全一致，这可能是导致阴性组假阳性结果和剂量反应关系不明显的主要因素。④由于分组操作，实验条件并未完全一致，并存较大操作误差，未能得到明显剂量反应关系，但高剂量组总体上彗星现象出现频率较低剂量组高且拖尾的亮度较亮，可大致得出染毒浓度和DNA损伤有一定关系。3.PI为致癌物，使用PI染色时，应注意佩戴防护手套，并于污染区进行染色操作，染液用量适当，勿溢到玻片以外，须用专门镊子移动玻片，阅片后将玻片弃入指定容器内。4.制备细胞悬液、裂解是关键步骤，以后实验应注意快速、准确、一致。鼠伤寒沙门氏菌回复突变（AMES）实验鼠伤寒沙门石军回复突变实验，即Ames实验，是检测原核生物回复突变的遗传毒理学体外实验，遗传学终点是基因突变。用于检测受试物是否能引起鼠伤寒沙门氏菌基因组碱基置换或移码突变。本实验的原理是利用鼠伤寒沙门氏菌的突变型即组氨酸缺陷型作为指示生物，这些菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。致突变物可使沙门氏菌突变为野生型（his+），恢复了合成组氨酸能力，因而在无组氨酸培养基上也能生长为可见菌落。故可根据在无组氨酸培养基菌落生成数量，检查受试物是否为致突变物。对于间接致突变物，可用经Aroclor1254（或多氯联苯）诱导的大鼠肝匀浆制备的S9混合液作为代谢活化系统。正向突变鼠伤寒沙门氏菌原养型（his+）组氨酸营养缺陷型突变株（his-）回复突变±S9代谢活化系统受试物1.试剂和器材1.器材37℃孵箱、恒温水浴、紫外线灯、酒精灯、接种针、灭菌试管和试管架、灭菌吸管（10ml和2ml）、微量取样器及灭菌吸液尖。2.培养基和试剂四种试验菌株的肉汤培养物、最低葡萄糖平皿、肉汤平皿、顶层琼脂、0.5mmol/L组氨酸/0.5mmol/L生物素、0.1mol/L组氨酸/0.5mmol/L生物素、0.1%结晶紫水溶液、氨苄青霉素1mg/ml(0.02mol/LNaOH)、四环素0.08mg/ml(0.02mol/LNHCl)、叠氮钠10mg/ml（灭菌水）。3.菌株TA97、TA98、TA100、TA1022.实验设计限于实验室条件，本次实验内容主要为试验菌株的鉴定和叠氮钠对TA100菌株直接致突变性的鉴定。1.四种试验菌株的鉴定①基因型鉴定：组氨酸需求试验、结晶紫敏感试验、紫外线敏感试验、氨苄青霉素抗性（R因子）试验和四环素抗性（pAQ1质粒）试验。②四种试验菌株自发回变数测定。2.叠氮钠对TA100菌株直接致突变性的证实试验①用TA100菌株的肉汤培养物，不加S9混合液，每皿叠氮钠剂量分别为1、2、4、8μg，以观察叠氮钠对TA100菌株直接致突变性的剂量-反应关系。②所有的试验平皿翻转后，置于37℃孵箱内培养48小时，观察结果。3.培养结束后，观察培养皿中各种细菌的生长情况，并对自发回变数测定的培养皿中菌落进行计数。参考《毒理学实习指导》第27页菌株生物学特性鉴定标准（表12）鉴定菌株。对叠氮钠致TA100突变性做定性描述。表1.菌株生物学特性鉴定标准菌株基因型自发回变菌落数（-S9）组氨酸缺陷脂多糖屏障缺失抗氨苄青霉素抗四环素ΔurvB修复缺TA97a+++-+90-180TA98+++-+30-50TA100+++-+120-200TA102++++-240-360注+表示需要组氨酸+表示有抑制带+表示具有R因子+表示具有pAQ1质粒+表示无修复能力3.结果和分析1.菌株鉴定表2.Ames试验菌株鉴定结果TA97TA98TA100TA102基因型鉴定修复缺陷+++-His需求++++（污染）Rfa突变++++R因子++++PaQi质粒---+自发回复菌落1821519232529523211337396污染211337平均值±SD91±819±6208±14342±192.叠氮钠对TA100菌株致突变性的鉴定表3.叠氮钠致突变性鉴定结果剂量（μg/皿）1248反应细菌密度增加细菌密度增加出现抑菌环，细菌密度明显增加出现抑菌环，细菌密度明显增加结论：1.TA97、TA98、TA100、TA102四中菌株基因型鉴定结果符合标准（TA100菌株自发回复突变菌株略多，但考虑置信区间依然处于合格范围）。2.叠氮钠对TA100菌株致突变实验可疑阳性。分析：1.由于菌落数过于密集，实验者技能所限，不好计数，故直接采用观察法，各剂量组平皿上的回变菌落数均远大于TA100的自发回变数，且随着剂量的增加，回变菌落数增多，即有明显的剂量-反应关系。故可判断叠氮钠对TA100有可疑致突变性，如需确证需要对回变菌落计数，分析时候超过自发回变数两倍。2.在高剂量组，即8μg/皿和4μg/皿的剂量组出现了比较明显的抑菌环，8μg/皿组较4μg/皿组的抑菌环直径要大，在各平皿滴加受试物的周围无菌株生长区域呈环形，即可看到明显的抑菌环，且随着剂量增加，抑菌环直径增大。说明叠氮钠具有细菌毒性。讨论：1.Ames实验敏感性强，操作简单，检测终点是基因突变，可用于化学物致突变性的大量筛查。2.本组所用菌株为TA102，在观察实验结果时发现，组氨酸需求的实验结果出现了异常大的菌斑，猜测是被污染，以致有霉菌生长。可能是在种植菌落的过程中烧灼不够，或者是其他操作的失误，使其被污染，造成实验结果的不准确。3.实验过程中，由于铺平皿不够迅速，导致有大量空白和阶梯状琼脂形成，对最后结果计数造成较大影响，未能对叠氮钠点试验做出定量分析。4.本实验由于死思君实验，应十分注意杂菌污染问题，我们在实验过程中由于熟练度不足，依然出现了较多霉菌污染情况，值得注意。5.平皿掺入法作自发回复突变鉴定时，需注意培养基温度，以温度太高免对细菌产生损伤而导致假阴性结果。