尖吻蝮蛇毒中抗凝组分Acoagulatin的抗血栓活性研究（可编辑）

尖吻蝮蛇毒中抗凝组分Acoagulatin的抗血栓活性研究（可编辑） 第一军医大学 硕士学位论文 尖吻蝮蛇毒中抗凝组分Acoagulatin的抗血栓活性研究 姓名:李婷 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:吴曙光;朱正光 20040510蘩一军医夫学磺士学位论文 中英文对照词 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 羧甲基琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷墓巯酸镄一三羟基甲基氮基甲烷 ,,,一四甲基乙二胺 离散液楣色谱 竞密度 每分钟转速 二胺乙基 譬终维蛋囊嚣 嫩壤盐水 . 凝酶出巍时间 凝叙辩闻 凝皿酶时间 凝肌活酶时间 溪纯罄分凝矗游酶辩阗 强鼍二磷酸腺苷贫衄小板赛瓶小板 瀵尔镶分予爨肇往 蛋白 第一军医大学硕士学位论文 尖吻蝮蛇毒中抗凝组分的抗血栓活性研究 中文摘要: 蛇毒中富含各种作用于凝血系统诸多环节的蛋白酶和多肽,这些多 肽和蛋白质在抗凝、抗血栓和止血等方面都有广泛的应用。本研究从中 国产尖吻蝮蛇蛇毒中发现~分子量为, 的抗凝活性蛋白组 分,并对其理化性质和抗血栓活性作用进行了研究。 根据实验目的,本研究的实验分为两个部分: 、尖吻蝮蛇毒中抗凝组分的纯化鉴定及其理化性质 的研究两种离子 采用 和 交换柱层析对尖吻蝮蛇蛇毒进行了分离纯化。经. 分离后,收集一?号洗脱峰的各组分,分别将各组分通过小鼠静 脉注射给药。用剪尾法测定小鼠尾静脉出血时间,并将各个组分分别注 射小鼠背部皮肤观察是否有出血毒性。实验结果表明,所收集的号峰 组分可以显著延长小鼠静脉出血时间,同时无出血毒性,即对?峰做进 一步分离纯化。 层析柱中,进行梯度洗脱,收集 将峰加入. 分离纯化出的一?号蜂的各组分,分别将所收集的各组分小鼠静脉注 射,剪尾法测定出血时间,并分别注射小鼠背部皮肤观察有无出血毒性, 同时对收集各组分进行类凝血酶活性测定,另外将 加入到 抗凝全血中,对各组分进行抗凝活性测定,持续观察小时,通过观察 血液是否凝固而确定该组分是否具有抗凝作用,发现其中号峰既能延 长小鼠出血时间及,又无明显的出血毒性和类凝血酶活性,是一种安 全、有效的无类凝血酶活性的尖吻蝮蛇蛇毒抗凝组分,即收集号峰备 用。 两步分离 和. 经过。 纯化,成功地纯化出这一新的抗凝组分,并命名为。 为了进一步鉴定该组分的纯度,经高效液相色谱进行纯度 鉴定,结果显示其为一对称单峰,主成分相对百分含量为.%,具 第一军医大学硕士学位论文 有较高的纯度。同时采用.电泳对进行分子量测定 %浓缩胶,.,%分离胶,.,电极缓冲液为.的 一甘氨酸缓冲液,凝胶结果显示:测得该种物质的分子量为, 和, 。 ,由两个亚基组成,分子量分别为, 用法得到目的蛋白即的蛋白含量为./。 、尖吻蝮蛇毒中抗凝组分的抗血栓活性研究 在的抗血栓研究中,我们主要进行了体外实验和动物体 内实验。 一、体外实验 、体外抗凝实验:、、 将浓度为.肛/山、./皿、.腭/山的的溶液 在体外分别与抗凝兔血浆混匀,在型血凝仪进行抗凝 实验,结果表明对反映内、外源凝血活性的、均有 显著的延长作用,但对没有影响。 、纤溶活性测定:水解纤维蛋白原电泳、纤维蛋白平板实验 为了观察是否具有纤溶性,进行水解纤维蛋白原电泳和 纤维蛋白平板实验,结果表明不论是对小时后的纤维蛋白 平板还是水解纤维蛋白原电泳都无影响,说明该抗凝组分不 具有纤溶性,同时也不能在体外水解纤维蛋白原。 、体外血小板聚集实验 将浓度为.腿/肛、.陷/山、.嵋/斗的的溶液 在体外分别与或的或者胶原混匀,在一血小板凝 集仪上进行抗和胶原诱导的血小板聚集实验。结果表明 ’ 对血小板聚集没有显著的拮抗作用。 二、动物实验: 、抗大鼠静脉血栓实验: 体内给药.肛/,即可明显的减少大鼠腹腔静脉 血栓的湿重和干重,有效地抑制静脉血栓的形成。 、抗家兔动脉血栓实验: 抗凝组分 峙/、/两个剂量家兔耳缘静脉给 第一军医大学硕士学位论文 药,能显著地抑制家兔颈动脉血栓的形成。 、全血凝固时间实验】: .肛/、../、./三个剂量小鼠鼠 尾静脉给药,可以显著延长小鼠眼球后静脉的凝血时间。 ./、/、?/三个剂量家兔耳缘静 脉给药,可以在分钟到小时之间有效的延长家兔耳中央动脉的凝血 时间。 、出血毒性实验: 通过小鼠背部皮下注射./.,观察无明 显的出血毒性反应,说明是一种具有一定安全性的蛇毒抗凝 组分。 、小鼠鼠尾出血时间: /、. 分别按照./、. /剂量小 鼠尾静脉给药,剪尾法测定小鼠鼠尾静脉的出血时间,发现./、 ./两个剂量组可以有效的延长小鼠尾静脉的出血时间。 上述结果表明,湖南产尖吻蝮蛇毒冻干粉经过? 离子交换柱层析,获得的抗凝组分 和. 是一种单纯的、由两个亚基组成的的较大分子量的抗凝组分, 其分子量为,,它的蛋白含量为./。它不具有纤 溶性也不能在体外水解纤维蛋白原,但是它体内给药可以安全有效的延 长出血和凝血时间,并且具有明显的抗动静脉血栓的作用。同时体外给 药对反映内、外源凝血活性的、均有显著的延长作用,但是对 没有影响,因此可能是作用于凝血联级反应共同通路的早 期,对内源性凝血通路和外源性凝血通路都有作用的一种抗凝组分。 关键词:蛇毒尖吻蝮蛇分离纯化出血毒性出血时间凝血时间 凝血酶时间凝血酶原时间活化部分凝血活酶时间血栓第一军医大学硕士学 位论文 ,: , . ,缸 . , . .. .蛳 .. ., .. .第一军医大学硕士学像论文. ?疆:止 ,” . .. . ? ?... 谢.鹳钰 . , 婿% ,.,. ,., % ?避,., / , . ?. : .? ./,。/./鍪 第一军医大学硕士学位论文 . ? . ? . . :. . , ..蚓,./. . ./肛. . . 瑚 ../. . 嬲 /./ ./. . . 冀第一军医大学硕士学位论文./、./、./ . /、 /、/,. . ./. . ?.力 矿./、./、./. ./ ./ . ? .. . ? 诵 . , ./.. .,. , ? . 第一军医大学硕士学位论文 : ,, , , , 第一军医大学硕士学位论文 前 言 血栓拴塞性疾病是近年来严重危害人类健康,导致死亡率最高的原 因之一,如心肌梗死,脑血管形成,深静脉血栓形成,脑拴塞、肺拴塞 等“儿”嘲,这些疾病都已经成为危害人类生命和健康的重大疾病。据不完 全统计,在岁以上人群中,心急梗死的发生率每年为./万一 ./万,脑卒中发生率每年为./万。而且目前,在我国每年 约有万人需要溶栓治疗,血栓性疾病已经成为我国重点防治的疾病 之一?。 血栓形成是许多疾病发病机制中涉及的一种重要的病理过程,如: 肾小球肾炎,糖尿病小血管病变,严重烧伤中局部病变的恶化,妊娠高 血压综合症,视网膜静脉血栓形成,各种原因引起的弥散性血管内凝血 等。因此,预防血栓形成和将已形成的血栓溶解,已经成为当前临床上 对血栓性疾病的熏要的防治方法。目前抗血栓药主要包括抗凝血药、纤 维蛋白溶解药和抗血小板药三大类。目前在临床上广泛应用的抗栓治疗 药物多为尿激酶或者组织酶原激活剂,但是由于其价格昂贵,难以满足 治疗和预防血栓病的需要。同时由于血栓拴塞性疾病的高发病率、高致 残率和高死亡率,临床上迫切需要疗效高、毒副作用低的防治药物,而 现有的药物均有不同程度的缺点。 近年来,国外在研制新型抗血栓药物方面取得了显著的进展。这方 面的研究主要基于两种治疗思路,即抗血小板和抗凝药。抗血小板药的 研究近年来取得了令人瞻目的成就,即血小板纤维蛋白原受体拮抗剂成 功地运用于临床。抗凝血药也是抗血栓治疗的重要内容之一,凝血酶作 为凝血过程中的最后一个酶,在凝血过程中发挥着多方面的作用:将纤 维蛋白原裂解为纤维蛋白;诱导血小板的聚集;激活因子, 稳定纤维蛋白凝块;激活因子和因子??,增加凝血酶自 身生成“。所以长期以来,人们一直把拮抗凝血酶作为抗凝药物研究的 主要靶点。肝素是依赖抗凝血酶的间接凝血酶抑制剂,在抗 凝治疗中已经应用了几十年了。但是肝素对与血凝块结合的凝血酶无作 用,因此消弱了其抗凝效果。直接凝血酶抑制剂可直接抑制游离的或与第一 军医大学硕士学位论文 血凝块结合的凝血酶,其抗凝效果优于肝素,但是这类药也较强地抑制 凝血酶诱导的血小板聚集,因而可能伴随出血并发症。这些药物的共同 之处是必须在医院进行每天几次的静脉滴注或者皮下注射。华法林是临 床应用的口服抗凝药,但是其缺点是:作用启动慢,治疗窗狭窄,量效 关系变异大,与其他药物和食物发生相互作用以及出血的不良反应。 凝血酶原是循环系统中含量最丰富的酶原,这提示了由凝血酶原生 成凝血酶是凝血过程中一个最重要的环节。直接凝血酶抑制剂虽然可以 抑制游离的和与血栓结合的凝血酶的活性,不能彻底地消除进行性血栓 生成的潜力。因此,如果能直接的阻止或减少凝血酶原生成凝血酶,将 会具有更好的抗血栓效果。 肝素、华法林和直接凝血酶抑制剂均有发生出血反应的倾向,其原 因可能是间接或者直接抑制凝血酶的同时也抑制了凝血酶的正常止血功 能。因此减少凝血酶的生成是目前最需要解决的问题之一,如果能在减 少凝血酶生成的同时,对己生成的凝血酶无影响,仍保持了低微的凝血 酶活性,这就可以减少出血危险的发生。凝血酶是诱导血小板聚集的主 要激动剂,对血小板的亲和力比对纤维蛋白原强倍。低水平的凝 血酶不足以把纤维蛋白原转变成纤维蛋白,但可以活化参与止血的血小 板,因此保持了基本的止血功能。 由此可以看出,治疗和预防血栓性疾病最理想的药物应该是在具有 强效的抗血栓作用的同时,抗血栓作用与出血反应相分离。 综上所述,血栓性疾病是一类严重危害人类健康和生命的常见病和 多发病,其发病率、致残率和死亡率都很高,因此寻找具有强效抗栓作 用和低出血危险性且可以口服的抗血栓药物无疑具有重要的临床意义 ?。在凝血过程中,如果可以作用于内、外源凝血途径的交汇处,即凝 皿级联反应共同通路的早期,通过同时阻断两条凝血途径而有效地抑制 凝血酶的生成,同时又保持了凝血酶诱导血小板聚集的活性。这样可以 具有更好的疗效和安全性,可能更适用于长期用药。 我国蛇类资源丰富,全世界已知的科多种蛇,我国就有 科种,目前国内外学者对蛇毒的研究主要集中在具有剧毒的余种 毒蛇的蛇毒,通过毒理学、药理学、生物化学和分子生物学的研究,蛇 第一军隧大学硕士学位论文 毒的许多组分得别分离纯化和序列测定:燕由蛇的毒腺分泌的天然繇蛋 爨,含骞多秘骚鑫震、多获、酶类菝及其窕夺分子耪震,其孛广泛谨在 抗凝皿的活性缎分,它们的擞化特性及作用机理不尽相同。 蛇毒作为天然的药用资源,其中含有许多的活性成分。它们都弼以 影旗凝盘及盘夺援聚集系统。翔:凝盘酶榉多赣雠,一绁维蛋白原酶, 巍小板聚集诱静剂潞,盘小板聚集掊抗剂,纤维蛋白漾酶受体菇抗剂瀚, 金.隅蛋白酶“”等。这些活性成分广泛影响赢液的凝固和赢小板的粘附、 聚煞与释放““。犟在六十年代,国外学者就已经从蝮蛇潦中分离出类凝 巍酶耱震,分麓璃予浚疗纛稔痉窝爨盘疫,翔:获马皋鞭亚霞墨蝮拣孛 提取的安克洛酶“”。我国的郝文学等从江浙蝮蛇中提取的蛇 霉揽栓酶“”,在临床上证明疗效良好。用于治疗血栓性疾病的 蠖炼挠拴酶懿幸筝月主要在予荚撬凝秘纾游瀵健,毽是多楚港盘的剽幸馨 溺。 本课题旨巍扶湖南产尖吻蝮蛇毒中分离纯纯出~种作用于凝盘缀联 反威共同通路早期,可以同时影响内源性凝血通路和外源性凝血通路的 尖吻蝮蛇毒的抗凝因子,并命名失辨,并对葵抗血栓活性及茭 终麓税裁遽嚣戮究。 、的分离纯化及其纯度撩定两种离子 和? 采用 交按睡层摄扶潮瓷产尖唆竣蛇毒孛分离缝傀壅,毫效液撩色 谱和.棘泳检铡潮豹纯发和分子量,劳对 该抗凝组分进彳于礞白定量测怒。 、盼抗血栓机制研究 毽括撬盘羧佟露渡及抗歉夺板聚集、巯凝活经、终溶经、蹬盘辩阕 测定、凝血时间测定以及出胀毒性实验等研究。 观察对家斑的凝血酶原时间、凝血酶时间、活化部分 凝藏活酶对润秘窳瓣绥维蛋爨戆影响。 制作大鼠腹腔静脉血栓横型、家兔颈动脉血栓模黧评估 在体内对静脉及动脉血栓形成的影响,并分别测定对 和胶原诱导的兔斑小板聚集的作用。 溅定傣肉绘爨癀,、鬣熬密巍露阗,著瓣察体 第一军医大学硕士学位论文 内给戮对小鼠眼球殿静脉和家兔群中央动脉的凝血时间的影响。第一军鼷大 学硬士学位论文 第一部分尖晓蝮蛇毒巾抗凝组分的纯化鉴 定及其理化性质的研究 实验材料及仪器设备 一、样品 广州医学院蛇毒研究所掇供 湖南产尖吻竣赡毒冻千粉 二、试钢 、低子量标准蛋白 珠江东风生化试剂厂 型分子筛鼷析柱. 、 公霹 、 荧国公司 冈本进口,广州医药站化学 、十:烷基硫酸钠 试剡公司分装 、牛纤维蛋臼原 荚雷公司 自制 、过硫酸铵溶液 融制 、%一巯旗乙醇 三、分褰缝纯毒季瓣瑞典公司 、瑞典公司 、. 蹬、实验仪器与髅糖 瑞典公司 、核黢蛋自纯纯系统 公司 、型系统 、.自动部分收集器 上海新波无线电厂 茨蓬公司 、紫熟分竞竞凌诗 、.电泳系统 燕国公司 、?凝胶图像光密度分析系统 荚匿公霹第一军医大学硕士学位论文 日本公司 、荧光显微镜 哈尔滨东联电子有限公司 、恒温水浴摇床 日本公司 、微量加样器 上海复日生物技术试验研究所 、电泳仪 第一军医大学磺圭学位论文 实验方法 一、静分离和纯偬 层析楗..用 、将. ./ 埘缓冲液.充分平衡。 、将。溺泰产尖窃羧蛇蛇海冻于耪港予缓滓滚 中,以转/分钟离心分钟后,取上清液上柱。 、猩处检测洗脱液,洗脱速度为/,收集。 、滏强缓串液洗脱至吸收蜂趋于平熄时,再用含蠢~。 《%.缓冲液遴行线往梯度洗麟,牧集。 、备组分经小鼠鼠尾出血时间测定和出血毒性检测后,收集既能延 长出血时间,又具有良好安全性的纯活性组分。 、蒸镶窳透辑貔籁,冻手搽孝。 、将.朦析柱.×经.磷酸 赫缓冲液.充分平衡。 层折柱 、磷酸盐缓冲滚溶勰经 .×.分离并其裔抗凝活性鞠菠好安全往酶活性维务, 巍分溶解后上柱。 、.磷酸般缓冲液洗脱,控制流速为/,擞处 缎瓣洗篪滚。 的磷酸盐缓冲液进行线性 、收峰趋于平蜒时,用含~. 梯度洗脱。收集各组分。 、重掰收集组分分别进程出敷辩阉溅定、熬瞧毒蛙测定期检测 瓣标维分,并收集安全有效瀚活往缰分。 、法测该种组分的蛋臼质含量。 、蒸馏水透析脱盐,冻干备用。 二、分离纯住所褥活性缀势的活性鎏定 、嗽血时间测定:取分离纯化得到的各个组分,分别取.小鼠 尾静脉注射,后剪随鼹法测定出搬时间。 第一军医夭学霹士学位论文 、出毒性测定:取分离纯化得到的各个组分。分别取.皮 下注射小鼠背部皮肤,观察小时后,处戮动物,剪下背部皮 获,蕊察赉盎毒攥。 、活性测定: ?、兔耳中央动脉取血,与.%柠檬酸钠:,/ 混合,充分混匀嚣,褰心分镑戳螽,玻上港, 得兔血浆。 ?、取“洗脱组分,加入新鲜抗凝兔血浆内,孵 育詹,嬲入工孛液,农型愈凝仪上 溅定蠢浆凝阉衡器薅闻。 三、的纯度测定: 采瘸.型分子筛拄层析撩定纯度。 、瀛劝籀鸯,醚,磷酸盏缓串滚,。。 、进样,流速为/。 、检测波长为。 鬻、静分子量溅定: 采用还原性电泳进行的分子量测定。 、凝胶板为。,%浓缩胶,.,%分离胶, 。,撵晶缓渖滚孛会寿%、%露演,邀毅缓跨滚为 .的一髓氨酸缓冲液。 、恒压电泳。 、取下凝胶叛,雳‰考马鑫熹兰染色液愿水:掣麟;冰 醋酸以体积魄为::配铡的溶液溶解擦色约,、辩。 、将凝胶板放入含有%乙醇的%醋酸脱色液中脱色小时, 中间更换脱色波潮次,脱色至背景清晰。 拣猴分子量分爨楚:。溶蓥酶、。 、.碳酸酐酶 、 .卵白蛋白、.白蛋白、 .磷酸化憋。 捷第一军强大学硕圭学位论文 实验结果 一、的分离缝纯; 、将含有尖蚴蝮蛇粗毒.姆的蛇毒溶液经过离心后,去除旗 屡辑柱在爨 孛,、分子量杂囊。攘饕廷, 析系统上进行亲和爆析分离,结果如图一所示。收集各个洗脱蜂进行 活性和安全性测定厢,收集主峰峰,遄析脱盐后冷练干燥,以供避 一步缝住。 器?“蒋?嚣暴《 ? 爱辑蚕 霾?。?琊蔹’啦缀. 删层析髓洗脱分离得划的活性组分 、将经。 峰溶解于 磷酸盐缓冲液中,充分溶解瞄加入到 。.瑟轿柱中,梯发洗髓,纯能静绩票热强一鬟示, 经抗凝活性测定鞠潞血毒性鉴定届,收集疑熟有抗凝滔镶又有良好安垒 性的燕峰峰。将收集的活性部分经脱熊、冷冻干燥聪,保存备用。 簸粕把跌湖寝产尖吻竣蛇毒中分离髓纯得到浆欺组分愈然 为。 ,第一军医大学硕士学位论文 ? ? ? 立 《. .. 图?.经?..层析图 三、的纯度测定: 在高效液相色谱检测中呈一对称单峰,主成 分的相对百分含量为.%,结果如图所示。 自动标尺色谱图 色谱峰 ??. . 图. 高效液相层析图 第一军嚣夫学硕圭学位论文 四、的分子量测定 蠢还藤猛~蛋自邀泳绫聚羹霆~喜蹶示,蓬孛嚣 示 在还原条件下媲现两条区带,液明有两个驻 和, 基,分子量分别为, ,因此, 魏分子囊秀, 黧一。 峨孤啪 联 啪 .? 埘 .一 一氐鹋壤茂 图一.还原性电泳阁 . % ?。%. .:,溶茵酶、 、.碳酸辩酶 馥 骧蛋岛耩捧露?裁 、。卵自蛋自、.自鬣自、 .磷酸化瓣。第一军医大学硕士学位论文 讨 论 一、抗凝组分的分离与纯化 本实验成功地建立了一种简便、高效、快速的从湖南产尖吻蝮蛇毒 中分离纯化出抗凝组分的方法。由于蝮蛇科蛇毒种类凝血酶 的含量比较丰富,因此在以往的蝮蛇蛇毒的分离纯化实验中,所分离得 到各组分中总是难免会混杂有一定量的类凝血酶,结果常常导致在进行 活性成分的筛选实验时,抗凝组分的抗凝活性往往会被类凝血酶的血液 凝固效应掩盖而较少被发现“?。因此在本研究中,我们选择采用对等电 和 点接近的组分有较高分辨率的. 两种离子交换柱层析来对湖南产尖吻蝮蛇毒进行 了分离和纯化,通过这两步的分离纯化,有效地排除了类凝血酶的影响, 成功地从蝮蛇蛇毒中分离纯化出这一新的抗凝组分,并命名为 。 在分离纯化过程中,上样完毕后,先用含较高盐浓度./ / 的缓冲液进行洗脱,再用.. 的高盐溶液进行 线性洗脱,可以有效的避免了其他低亲和力组分的吸附,而将吸附容量 留给组分,提高了分离效果。经过两次分离纯化,纯度可以 进一步提高,得到所需要的单一的蝮蛇蛇毒抗凝组分。 本实验所建立的分离、纯化方法具有简便、高效的特点。 二、抗凝组分的理化性质 本实验采用高效液相色谱对分离纯化得到的蝮蛇蛇毒抗凝 组分进行纯度鉴定,结果显示其为一对称单峰,主成分的相对 百分含量为.%,说明抗凝组分具有较高的纯度,为单一 物质。 为了测定的分子量,在实验中我们采用了?电 泳,%浓缩胶,.,%分离胶,.,样品缓冲液中含有% 、%甘油,电极缓冲液为.的一甘氨酸缓冲液。实验结 ,并且从电泳图中 果显示:测得该种物质的分子量约为,第一军医大学硕士学位论文 可以看出,由两个亚基组成的较大分子量的尖吻蝮蛇蛇毒抗凝 。 和, 组分,分子量分别为,第一军瞧走学硕士攀位论文 第二豁分尖瓣蝮蟪毒审撬凝缰努耩?巍辨基懿蕊撬盘犍 、 活性研究 实验糟糕与获藉谶羲 一、样品 、潮蠢产尖燎蠛蛇毒拭凝娥焚毽融瓢撩千餐 产舞聪攀随凌毒雾燮瓣薅鬟 自行分璃饨化 二、撇验动物 ?、蘧饕枣鬃耀鳇?嚣冀撬巷一瑟。稼 第一攀辍大学毒方瓣虢安验动静巾 心提供 、大《拣蟓》傣堂溉?一。罐 冀一霉藩夫擎鬻骞鏊澈塞验囊爨审 心提供 、新珏兰家热雄性体熬。.蛾 荬一摹蓥失拳囊骞粪撩寰验蘑鐾串 心蓰谈 三、试剂 踅索串然犍亲公遴 、鞭 纛乏蠢孛颡避案会嚣 鐾、耀 北京中勤懒帝公司 、 自制 、,%柠檬龄钠溶液 蠡鬟 巷、蒸菠基滋妥镳港滚 鑫稍 、蕊三氯穗铁承溶液 、 美国公司 基裁 、胶爨第一军医大学硕士学位论文 、 自制 、 自制 四、实验仪器 普利生公司 、型血凝仪 美国公司 、高速台式冷冻离心机 、加样枪单道 日本公司 公司 美国 、一型电子分析天平 上海科达测试仪器厂 、血小板凝集仪 国产 、手术用小型器材一批 日本 、数码相机第一军医大学硕士学位论文 实验方法 谯挠凝组分的挠斑栓话往研究中。主要滋杼了体井实验 和动物实验。 其中俸外实验包括:、摭凝活性实验;、、;、终 溶潘髅实验:隶瓣鲆维蛋鑫添恕泳、野壤蛋鑫平羲实验;、盘枣我聚 集实验:诱爵缸小板聚集、胶原诱导廊小板聚集。 动物实验包摄;、小鼠恳静脉出血时阀实验;、企凝固时间 溺宠:小鼠?曩蘧螽静辣凝盘对溺、家受耳中央漤躲凝盎对髑;《骛、豌物 盎检模型:丈簌曦腔静赫血栓模型、家兔颈动脉盎栓模羹;《、出血遴 性实验。 一、髂乡兔盘浆凝盎酶蘸时间篁、凝盘酶酵闽、瀵 化部分凝赢活酶时间卿的测定。 、兔耳中央动脉取血,与.%聍檬袋镶:,/混台, 充分湛勾嚣,/离心分静欧嚣,袋上漓,褥受益装 、用 .%注射用氅鼹盐水将冻予粉溶解,并用 .%注射用生理盐水将配制成高、中、低三个剂量, 其中亵黎爨拜/、孛裁爨/、低裁鬟 弘/。 狂 、凝血酶时间:抗黼血浆“,加入 下孵露三分钟后加入牡/凝血酶,测定对阅。 《、凝矗溪瓣辩闫《;撬凝囊浆?潞,燕天心 ,测定时间。 在?下孵育三分钟爵,加入 、活化部分凝活酶时间“”:抗凝血浆,加入 ,在下孵育三努钟器备魏入 ?舔翻黎鞋 . 。,测定凝豳辩褥。 以上各实验均用.%淀射用生理热水为对照,姆个实验重复测 定三次,缭暴以蝴寝示。第一军医大学硕士学位论文 二、在体外水解纤维蛋白原的作用 、将.人纤维蛋白原溶于双蒸水中,充分混 匀后,每山与 ./混和,在 ?孵育。 、分别在孵育、、、、、时取 出,立即加入山电泳样品缓冲液,并迅速置于仪? 加热变性约分钟。 、在还原条件下进行.电泳,电泳条件同在. 的纯度与分子量的测定。 标准分子量分别是:.溶菌酶、. .乳球蛋白、.限制性核酸内切酶、.卵自蛋白 、 、.牛血清白蛋白 . 一牛乳糖.。 三、纤维蛋白平板实验 /凝血酶静置分钟 、将 /纤维蛋白原与 后,形成凝胶平板。 、分别在平板上滴上扯生理盐水、山肛/、 山粗毒/,置纤维蛋白平板于’烤箱内孵育。 、分别于小时后和小时后取出观察实验结果、拍照。 四、诱导血小板聚集 、制备/的母液:称取.粉充分溶解 于生理盐水中,混匀后置于一?冰箱保存备用。 、制备富血小板血浆:新西兰家兔耳中央动脉取血,与.% 柠檬酸钠:,/混合,充分混匀后,抗凝全血在室温下 /离心分钟,取上清,即为富血小板血浆 ,。下层红细胞再经/离心分钟,取上 清液为贫衄小板血浆 ,。第一军医大学硕士学位论文 、.血小板凝集仪预热三十分钟后,调零。 、配制工作液:/。 工作液,测定诱导血小板聚集 、加入叫和 率。 、加入 和 预热五分钟后,加入. 工作液,测定在作用下诱导血小板聚集率。 五、胶原诱导血小板聚集 、制备鼠尾胶原:取大鼠鼠尾数条,浸泡于%酒精分钟以上; 在无菌条件下,用锋利剪刀剥下毛皮,抽出尾腱,以无菌 . 涮洗至遍;尽可能剪碎尾腱,浸入毫升醋酸溶液中,置 冰箱中,不时摇动;小时后,以离心分钟;取上 清液即为鼠尾胶原,可供实验用;离心后的残渣可再加过量醋酸、 冰箱过夜,次日打匀后再次离心,取上清即可。 、制备富血小板血浆:新西兰家兔耳中央动脉取血,与.% 柠檬酸钠:,/混合,充分混匀后,抗凝全血在室温下 /离心分钟,取上清,即为富血小板血浆甙 ,。下层红细胞再经/离心分钟,取上 清液为贫血小板血浆 ,。 、血小板凝集仪预热三十分钟后,调零。 冲和“胶原终浓度为?/,测定胶原诱 、加入 导血小板聚集率。 预热五分钟后,加入胶 和“ 、加入肛 原,测定在作用下胶原诱导的血小板聚集率。 六、出血时间的测定 、用 .%注射用生理盐水将冻干粉溶解,并用 .%生理盐水将砒配制成高、中、低的三个剂量,其 中高剂量?/、中剂量/、低剂量./。 、将实验用昆明种小鼠分为四组,每组只,称重.一.、 分别标记。 第一军医大学磺圭学位论文 、对照组用.%注射用生理盐水./由尾静脉注射入小 鼠体内。 、蓐褰戴鬻尖壤。嚣张楚,焉锋穰豹?蕤辩手禾赘赘鼗鬣蓬 麟,马上将鼠尾浸没到装有艇理盐水的试管中,让血自然流出。 记录出血时间。 、安验组分先三缌,分剩按亵、孛、纛三令翔塞《,嘲/奎蠹,、 鬣尾静脉给药。 、于给药厝离鼠尾尖端.厘米处,用锋利的眼科手术剪 剪凝鼠尾后,妈上将鼠尾没没到装有生联盐水的试管巾,让血 蠡然流出。 记泶出血时间。 七、静脉凝血时间的测定 采糟穗夺鬣?琵球凝盘毛细管法瓣凝盘辩翔。 、随机将实验用融明种小鼠分为四组,簿缎是只,称黧. .,分别标记。 、怒 .%注瓣溺生理蕊农将冻手羚交分溶释惹, 并用.盼窿射糟生理盐水将配制成商、巾、低三个 剂量。其中高剂量/、中剂墩/、低剂量 牲/。 、对照维褥.%注射瑁生联蕤零?./由蓬静躲注射久,、 鼠体内,后摘小鼠眼球,废弃头三滴血后,用蔼细管采血, 折毫细管测球膈静脉出血的凝血时间。 、蜜验篷分受三缀,势裂按照蠢、孛、羝三令麦蓦量《。/由 小鼠尾静脉给药,于给药后摘小鼠匿球,折毛 细管法测给药精小鼠球后静脉出血的凝胍时间。 、动稼凝盎辩阕篁瓣溯定 、随机挑选实验用新西兰家兔,称重.一.,分三组, 缚组五只,分别标记。 、燧 。%淀射弼生理热水将冻于粉游解,著用 第一军医大学硕士学位论文 .%注射用生理盐水将配制成高、中、低三个剂量。 其中高剂量/、中剂量./、低剂量/。 、用锋利手术刀片迅速割开家兔耳中央动脉,废弃头三滴血后, 用毛细管采血,折毛细管测家兔耳中央动脉的给药前的出血凝 血时间。 、分别给各实验组的家兔,按照高、中、低三个剂量/由 家兔耳缘静脉给药。 、分别于给药后的分钟、分钟、分钟、小时、和小 时,按照上述折毛细管法测给药后新西兰家兔耳中央动脉的出 血凝血时间。 九、大鼠腹腔静脉血栓模型的建立 、随机挑选实验用大鼠,称重,分四组五只/ 组,标记。 、用 .%生理盐水将冻干粉溶解,浓度为 ./。 、按.一./,用%的戊巴比妥腹腔注射麻醉动 物。 、待实验动物充分麻醉后,予以固定。 、切开腹部皮肤,暴露腹腔,游离腹腔静脉,手术线穿线备用。 、对照组:经大鼠舌静脉注射./.%生理盐水。 、实验组:分三组,分别按照高./、中./、 低./三个剂量经大鼠舌静脉注射。 、后结扎腹腔静脉。 、后剪开结扎静脉,取出静脉血栓,称湿重。 记录实验结果。 、置于?烤箱中过夜,后,称血栓干重。 记录实验结果。第一军医大学硕士学位论文 十、新西兰家兔颈动脉血栓的建立 、实验前一天制备%氯化铁水溶液,称取.三氯化铁, 加入少量的双蒸水充分溶解后,双蒸水定容至,广口瓶收集 备用。 、随机挑选实验用新西兰家兔,称重.?.,分四组五只 /组,标记。 、按.?./,用%的戊巴比妥腹腔注射麻醉动物。 、待实验动物充分麻醉后,予以固定。 、予以家兔颈部去毛,切开颈部皮肤,暴露颈部,钝性分离双侧颈 动脉,手术线穿线备用。 、用 .%注射用生理盐水将缅冻干粉溶解后,并用 .%注射用生理盐水将配制成高、中、低的三个剂量, 其中高剂量肛/、中剂量?/、低剂量/。 、对照组:经家兔耳缘静脉注射.洲/.%注射用生理盐水。 、实验组:分三组,分别按照高肛/、中斗/、低 肛/三个剂量经家兔耳缘静脉./注射给药 。 、各组分别于注射.%注射用生理盐水或。 、后开始制备动脉血栓模型: 准备长、宽的滤纸若干,分别浸泡于%三氯化铁 溶液和.%的生理盐水溶液中,待滤纸完全侵润。 充分暴露两侧颈动脉,分别用沾有%氯化铁溶液和. %的生理盐水溶液的滤纸包裹两侧动脉。 、后取下包裹双侧动脉的滤纸,并结扎两侧动脉。 、剪下与包裹滤纸等长的动脉血管段,称湿重。 记录实验结果。 、置于烤箱中过夜,后,称血栓干重。 记录实验结果。第一军医大学硕士学位论文 十一、出血毒瞧实验 、随机挑选甄只昆磷静小鼠,称重,分剐标记。 、用 .%注射用嫩理盐水将冻于粉溶解,并用 。%注射用生理盐水憋配臻成离、巾、低的三个剂 量,箕牵菇裁量./、巾裁量./、低裁激 / 、准备阳性对照用粗毒,用.%浊射用生理盐水勇己制高剂爨 瑟/,低蓑黧/。 、分别抽取三个剂量的和两个帮量的阳性对照备 .打入小鼠背部皮下。 、每时溉察一次小甄的生命状态。 、,、辩黼,处死动物,剪下营部凌黢。 、拍照。 十篡、统计处理 实验结采均激用两样本筠数检验避纷统计分析。第一军医大学硬圭擎霞论文 实验结果 一、蒋辨绘菱盘浆凝盎酶藤对闻鞭、凝盘蘸对澜疆、 活化部分凝血潴酶时间肿的测定。 将簿,%生理盐水配裁为转/,蛳触羁 /./三个浓度缀,体终俸矮予新鲜兔盎浆。 结果如表.所泳,与生理熊水阴性对照棚比,对、 和影响豹测定。 获察骏绝暴孛可骥着蹬: 、不同浓度的对了均没有影响。 、不同浓度的对和都有明显的延长作用, 劳显照善浓瘦的邂’襄,挠凝粒誊彝夯薅之延长。 神. 注: , 蕊蠡?. 檄 表~.的抗凝活健 二、襁体外水解纤维蛋白原的作用 人野维蛋鑫纂/,经瑟/稼趱莲,袁 %一巯基乙醇存在的还原条件下进行电泳,绩果辩圈一. 所示。在作用、、、、、 嚣,对野缍蛋塞骧静醢、?、 三蕊链均无影响,诞爨甭貔 求瓣纾绦鬻自原。一 整二至墨奎鲎蹩圭兰堡垫塞 ?繇 ; 朽” 瑟 拇? , . . . . .. 圈一。零解纾维蛋纛骧电泳整 标猴分子量分剐怒:.溶谪酶、。 乳球蛋 白?、.限制性核酸内切酶 、。卵自强自、.牛血清白蛋囱 、.争孛巍瓣 三、纤维蛋白平板实验 个小时后取出纤维蛋自乎板残察,肉跟可嫩糨毒阳性对照处示直径 为。豹瑟形鬻影溱嚣,生理盐承簸及整纾维蛋囊乎板未觅 异常。 拍照届将纤维蛋白平板置于?烤箱内继续孵育。 ,、霹嚣取出纾壤蛋鑫平板,魄瑟鼹察,褪毒毅经怼照戆懑迩蹩热明 显,拍照结果如图?.所示。第一军医大学硕士学位论文 粗毒阳性对照处可见 两个.的圆形压迹 图 .水解纤维蛋白平板 四、血小板聚集率的测定 与空白对照相比,高、中、低三个剂量的对 /和胶原/所诱导的兔血小板聚集均无明显的 拮抗作用,结果如表 .所示。纂一军医大学壤士学毽凳文 口空白 丑? 瓣 墨? ? 蚰 摹 零孬蒜繇罐?目 加 挎 。 浓麋“/越 肢最 。,币. 疆.不同浓度翡对盎小蔽聚集静器穗 五、出呶时间的测定 癸裂将蠢蘩量/、孛潮蟹弘/、撬赛羹/ 兰令剂量,稚对照雨生璩薤农,按,/逶遗,、鬣慝静 脉注射给辅。 结果如图?.所零,与阴性对照组相比,其中高、巾剂量豹 琵激显著延长戆臻稚枣鬣熊出盘对溺莰。第一军医大学硕士学位论文 屋 留 鲁 丑 咖咖咖栅枷 .浓度 .岬. . 图?.不同浓度的对小鼠出血时间影响 六、静脉凝血时间的测定 分别将高剂量/、中剂量肛/、低剂量/ 三个剂量,和对照用生理盐水,按./通过小鼠尾静 脉注射给药。 结果如图.所示,与阴性对照组相比,其中高、中、低三个剂量 均可显著延长昆明种小鼠眼球后静脉的凝血时间.。第一军医大学硕士学位 论文 厘 曾 鲁 诺 ?蚰肿?印?蚰? 浓度/.?. . 图?.不同浓度的对小鼠凝血时间影响 七、动脉凝血时间的测定 分别将高剂量/、中剂量./、低剂景/ 三个剂量,按./通过家兔耳缘静脉注射给药。 结果如表?.所示,我们可以看出与给药前相比,其中高、中、低 三个剂量均可在不同的时间分钟到小时显著地延长家 兔耳中央动脉的凝血时间.。第一军医大学硕士学位论文 注:岬. 空白 表?.不同时间对动脉凝血时间的影响 八、抗凝组分对静脉血栓的作用 分别将高剂量./、中剂量./、低剂量 ./三个剂量,和阴性对照用生理盐水,通过大 鼠舌静脉注射给药。 结果如图.所示,与阴性对照组相比,其中高剂量./ 的可以抑制大鼠静脉血栓的形成.。 ?嘲恻营鸶楹. . . ./ . .神. 图.抗凝组分对大鼠静脉血栓的作用