山楂酿酒酵母的筛选及其发酵性能测定

山楂酿酒酵母的筛选及其发酵性能测定 高清山，邢继德，魏怀生，鲁梅，燕淑海 (山东潍坊 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 职业学院，山东 青州 26250)0 摘 要:以山楂为原料,利用平板划线分离法，得酵母 9 株。利用杜氏小管实验对酵母进行筛选，获得 4 株发酵力较强 酵母。将其进行酒精、酸度、糖度的耐受性试验，表明总体耐受性较好。将其与 1450 酿酒酵母共同进行发酵性能测定， 确定了?号酵母是优良菌株。在 60 mg/L SO和 28 ?的条件下，可酿造出 11.3(体积比)酒精度，3.0 g/L 还原糖，8.1 g/L 2 总酸度，0.21 澄清度，酒色鲜红、口感纯正、香味浓郁的山楂干红酒。 关键词:山楂;酿酒酵母;筛选;发酵特性 Screeningof Hawthorn Saccharomyces Cerevisiaeand Measurements of Their Fermentation Performance GAO Qing-shan,XI NG Ji-de, WEI Huai-shengL, U Mei, YANS hu-hai ,Weifang EngineeringV ocational College, Qingzhou 262500, Shandonhign,a C, Abstract:In this paper,9 strains of yeast were obtained by using hawthorn as raw material and plate using streak as separation method. Initially screenedwith Du -canaliculus experimentsfour strainsof yeastwith stronger fermentation capability were identified. Further tolerance testing on alcohol contents, acidity and sugar contents indicates thattheir overall performanceof fermentationis better. Appliedjointly with Saccharomycescer evisiae No.1450, the No.? strain of yeast is determined to have the fermentation perforofm excellentance yeast.Under the conditions of 60 mg/L andSO 28? , the yeast can produce a wine with the following characteristics: alcohol 2 11.3( V/ v), reduction sugar 3.0 totalg/L, acidity 8.1 g/L, clarity.2 10, bright-red in color, pure taste, andfr richagranc e . Key words:hawthorn;Saccharo myces cerevisiae; screening; fermentationcharacter istics 山楂，又称仙果，几乎含有水果的所有营养成分，强，适应范围广，全国各地慕名到青州引种及购买者18 种氨基酸，特别是 V的含量较高，达到 89 g，比苹果 很多。近年来，由于深加工能力不足，青州山楂出现了 C 高 17 倍，比梨高 30 倍。其主要成分有:山楂酸、黄酮、 相对的产大于销的状况，如何做好山楂果品的深加 V。主要功能:健胃消食、减肥、降血脂血压、防衰老、增 C工，增加农民收入，使山楂增产又增收，一直是果农十 强肌体免疫力等。据《本草纲目》记载:山楂可消化饮 分关注的问题。根据当前我国干红果酒走俏市场的有 食，消肉积症瘕及痰饮痞满吞酸、血瘀胀痛。据洪昭光 利形势，对山楂干红生产的工艺条件进行了探讨，必 《食物是最好的医药》介绍:山楂有很多的营养和医疗 将对当地的经济建设起到很好的推动作用，提供一条 价值，常吃山楂制品能开胃消食，预防动脉粥样硬化， “三农”问题的有效途径。 解决 使人延年益寿，故山楂被人们视为“长寿食品”。 山楂的品种很多，其中，以青州的敞口山楂最为 有名。据青州府志记载，距今已有 500 多年的栽培历 1 材料与方法 史。敞口山楂果实扁圆形，果皮涂红，果点黄白色，密 材料1,1 集，果皮较粗糙，无光泽，因萼筒大而深，萼片开张而成 青州山楂;白砂糖;麦芽;1450 酿酒酵母。 “敞口”。青州敞口山楂个大、质优，适于加工，抗逆性 仪器设备 1,2 SPX-250B-Z 型生化培养箱:上海将来实验设备有 限公司;手持糖度仪:上海晖创化学仪器有限公司;超基金项目:山东省高等学校科技 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目(J10LC77) 净工作台;发酵管GC;7890F 气相色谱仪:安捷伦科技 作者简介:高清山(1968—)，男(汉)，讲师，本科，硕士，主要从事应用 有限公司 ;722S分光光度计 :上海美谱达仪器有限公 微生物研究。 高清山，等:山楂酿酒酵母的筛选及其发酵性能测定 生物工程 155 司;全果榨汁机;杀菌设备;天平;显微镜等。酵母生理生化特性鉴定为酵母的共 9 株。 1,3 培养基 2.2 杜氏管发酵实验 富集培养基:葡萄糖 5 ,，(NH)SO0.2 ,，KHPO 分离得到的 9 株酵母分别编号，进行杜氏管产气 424 24 实验，培养 5 d 后结果如表 1。 0.25 ,，MgSO7HO 0.1 ,，FeSO7HO 0.01 ,，酵母 ??4242 膏 0.05 ,，上述材料灭菌后加亚硫酸钠至30 mg/L。 表 1 杜氏管实验 Table 1 Experiment of Du-canaliculus 分离培养基:酵母膏 3 g，蛋白胨 5 g，麦芽汁 3 g， 葡萄糖 8 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL，121 ?蒸汽灭 菌株 起酵时间/h 杜氏管充满气体的时间/h 菌 20 min，pH 自然。 ?号 16 42 麦芽汁发酵培养基:蔗糖 20 ,，酵母膏 1 ,，麦芽 ?号 41 76 汁 3 g，(NH)SO0.1 ,，KHPO0.1 ,，MgSO7HO 0.1 ,。 ?4 24 24 4 2?号 14 30 山楂汁发酵培养基:取山楂汁，稀释调整成分，加 ?号 35 70 ?号 入使发酵后生成 15 ,(体积比)酒的白砂糖，加亚硫酸 13 24 ?号 钠至 30 mg/L，调 pH3.5。37 63 ?号 1,4 方法 21 54 ?号 [1-3]?号 1.4.1 山楂酒酵母的富集培养以及初步分离纯化 16 45 50 85 将成熟山楂捣碎放于无菌的三角瓶中，暴露于空 气中自然发酵 ，当有气泡产生并闻之有酒味时，用无 由表 1 可知，发酵 24 h，有大量气泡产生的菌株有 菌纱布过滤 ，取过滤果汁 50 mL加入 富集培养基中， 1 株(酵母?号)，48 h 发酵有大量气泡产生的菌株有 28 ?恒温培养 2 d:3 d，得到增殖培养液。将富集培养 3 株(酵母?号、?号、?号)，这 4 株菌都有酒香生成， 好的菌种通过初步分离纯化得到单菌落。选取较大菌 保留这 4 株进行下一步筛选实验。 落，编号后分别接入富集培养基试管斜面上，28 ?培2.3 酵母耐受性实验 [13]养 2 d:3 d，置于 4 ?冰箱中保存待用。 2.3.1 酵母耐乙醇能力测定 [4-6]1.4.2 优良山楂酒酵母筛选试验 山楂酒在发酵过程，随酒度不断增加，在糖度还 1.4.2.1 山楂酒酵母的初筛 杜氏管发酵实验法:将活没有下降到足够低的时候，高浓度的酒精会抑制酵母 化传代的酵母接人带有 的发酵;或者由于外因的影响，发酵醪突然中止发酵 杜氏管的麦芽汁(10?Brix)培养基中，28 ?培养 48 h， 的情况下，必须添加处理好的山楂汁重新启动发酵。 7 接种量为 1.0×10cfu/mL。 因此，在这些情况下，酵母对较高酒精浓度发酵液的 1.4.2.2 酵母耐性实验 将菌种分别采用不同的乙醇浓度适应能力显得非常重要，表 2 为各种酵母在不同酒精 (4 ,、8 ,、12 ,、 浓度条件下的耐受情况。 16 ,、20 ,)、pH(1,5、2,5、3,5、4,5、5,5)以及糖浓度(10 ,、 20 ,、30 ,、40 ,、50 ,)的带有杜氏管的麦芽汁发酵培 养基中，28 ?培养 3 d，选择产气好的菌株。接种量为 7 1.0×10cfu/mL。表 2 不同酵母的耐乙醇性结果 [7-9]Table 2 Alcohol toleranceresult s of different strains of yeast 1.4.3 山楂酒酵母的复筛 将初筛得到的耐性较好的酵母株接人山楂汁发酵 不同酒精浓度(体积比)充盈用时/h 菌种 4 , 8 , 12 , 16 , 20 , 培养基，将活化 1450酿酒酵母后 ，作同条件对照试验。 ? 41 42 43 43 49 检测方法 :酒精度(以体积百分数计，,vol)采用 气? 30 30 31 31 33 象色谱法;残还原糖(g/L)采用斐林法;酸度采用酸 ? 24 25 24 24 25 碱滴定法;澄清度采用分光光度计测定。? 44 48 49 60 81 由表 2 可以看出:4 株酵母在 12 ,的酒精度环境 中，耐受性均较好，随着酒精度的提高，酵母?号对较 高浓度酒精的耐受性大大降低，其余 3 株耐受性较好。 [14] 2.3.2 酵母耐酸碱度测定 山楂汁的酸性比较大，一方面可抑制有害菌的生 2 结果和分析 长，避免发酵期间有害菌的感染，另一方面要求生产 [1012]- 酵母菌株的分离2.1 菌种必须具有较好的耐酸性能。因此在山楂酒酵母选 富集培养后，经稀释以及划线分离后挑出具有典 育中，进行酵母的耐酸性测试非常重要，表 3 为不同 型酵母菌落特征的菌株,用显微镜观察形态特征，并经 高清山，等:山楂酿酒酵母的筛选及其发酵性能测定 生物工程 156 表 5 不同酵母发酵性能测定情况 pH 下的酵母发酵情况。 Fermentation performance measurement results of Table 5 different strains of yeast 表 3 不同酵母的耐酸性的测试结果 Table 3 Acidity toleranceresult s of different strains of yeast 菌种 ? ? ? ? 145 0 不同 pH 充盈用时/h 酒精度/ V(v/) 10 7.0 10.2 11.3 5.5 菌种 还原糖/ g(/L) 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 3.4 5.9 4.1 3.0 6.8 总酸度/ g(/L) 澄? 55 47 41 42 40 9.1 10.5 9.8 8.1 10.2 清度(/ 38n0m 吸? 36 32 30 30 29 0.2 30.3 80.3 30.2 10.4 1光值) ? 30 26 25 24 25 感官 ? 70 56 45 43 45 酒体色泽鲜亮 酒体颜色稍淡 酒体颜色稍淡 酒体橙红 酒体颜色稍淡 口感适宜 口感好 涩味重 有涩味 口感较差 有香味香味浓酸度高 由表 3 中可以看出:4 株酵母在 pH 为 3.5 的环境 中，耐受酸性均较好，在较低的 pH 下， 酵母?号和酵 由表 5 可以看出:?和?号酵母产酒精量分别为 母?号菌的耐受性明显减弱，酵母 11.3和 10.2(28?、体积比)，说明此2 菌株产酒精能力 ?号菌尤为明显。 最好;1450 酿酒酵母和?号酵母对还原糖的利用能力 [1516]- 酵母耐糖度测定2.3.3 最好;各项指标综合显示:?号酵母酒体澄清度最好， 在酿造山楂酒过程中，为了得到较高的酒精度， 酸度最低，口感好，香味重，是一优良菌株，可以用于山 便于酒的保藏，需要调整加入更多的蔗糖，而糖浓度 楂酒生产，各项指标显示性能优于 1450酿酒 酵母，命 的增加对酵母渗透性可能产生影响，因此，要对筛选 名为山楂一号酵母。 菌株进行耐糖度测试，表 4 为不同糖度下的酵母发酵 情况。 3 讨论 本试验结果表明，自然发酵山楂是分离筛选山楂 表 4 不同酵母在不同糖度下的充盈用时 酒酵母的良好材料，经过分离、初筛、复筛和发酵性能 Table 4 Results different yeastin different sugar degreeof filling time 测定，山楂一号酵母在相同条件下起酵时间为最短的 13 h，在 4 ,~20 ,酒精环境中有很好的耐受性，最佳 不同糖度充盈用时/h 菌种 耐受糖度为 30 ,左右，最适 pH 为 3.5 左右，在 60 mg/L 10 , 20 , 30 , 40 , 50 , SO和 28?的条件下，可酿造出11 .3(体积比)酒精度， ? 44 40 39 47 - 2 ? 37 30 32 55 -3.0 g/L还 原糖，8.1 g/L总酸度 ，口感纯正、香味浓郁的 ? 30 23 22 26 60 山楂干红酒，证明山楂一号酵母适合酿造山楂干红酒。 ? 50 45 44 60 71 本试验仅报道了山楂一号的分离筛选及初步测 定，但对其菌种的生理生化特性、培养特征、16SrDNA 由表 4 可以看出:4 株酵母在 20 ,左右的糖浓度 序列分析、以及形态特征、表面结构和生化测定、细胞 环境中，发酵性能较好。但是，糖浓度降低，杜氏小管 壁的成分分析尚未研究。另外，利用山楂一号酵母，对 充盈时间延长;糖浓度提高，对酵母的抑制作用增强; 山楂干红生产工艺进行优化研究，找出适合当地山楂 当糖浓度达到 50 ,时，?号和?号酵母明显受到抑 [1518]-干红生产的最佳工艺尚需进一步研究。 制，几乎丧失发酵功能;?号酵母的耐糖度性最好，? 号酵母次之。 [1113]-2.4 酵母发酵性能的测定 选取成熟无霉变的山楂，去梗洗净，称量后去核 参考文献:打浆，稀释后，加入一倍体积量的 4 ,的脱臭酒精软化 王慧,张立强,刘天明,等.产地葡萄酒优良酵母株的筛选及鉴定 [1] 水和 10 mg/L的亚硫酸钠 ，根据 17.5 g/L的糖可生 成 [J].酿酒科技,2007(9):29-32 1 度酒精的比例再加入使发酵后生成 12 ,(体积比) 李兰,许桂芳,张连苹.石榴酒酵母的筛选[J].酿酒科技,2010(11): [2] 酒精度的白砂糖，加亚硫酸钠至 30 mg/L，调 pH 3.5。将 197 穆立峰,屈慧鸽.山葡萄酒酵母的选育[J].特产研究,1996(1):12-23 初筛得到的 4 株酵母、活化 1450酿酒酵母分 别以 8 ,[3] 陈则华,李理,肖利民,等.分离菌株在荔枝果酒酿造中的应用[J]. 的接种量接人山楂汁发酵培养基，28 ?静止发酵 5 d [4] 酿酒科技,2007(4):154 王俊沪,杨丽娟,冯作山,等.优良香梨酒酵后，测定酒精度、还原糖、总酸度、澄清度，表 5 为测定 母的选育[J].酿酒,2003 情况。 [5] ,下转第 页,160 孙素华，等:响应面法优化樟芝真菌发酵培养条件研究 生物工程 160 该方程回归显著，模型的复相关系数的平方即的工具，Plackett-Burman试 验设计能对影响樟芝发酵 2R=99.27 %，说明回归方程的拟合程度良好，失拟较 的各因素进行评价并能有效地找出主要因，最陡爬坡 小，可以用该方程代替真实实验点进行分析。由表 6 法能充分接近最大响应面区域Bo，x-Behnken 实验设 中的 P 值可知道，方程中 X对 Y 值的影响达显著水 计能建立主要因素影响樟芝菌体的二次多项数学模 3 平，而方程中 X、XX、XX和 XX对 Y 值的影响达极 11122 33 型，并利用统计学方法对该模型进行了显著性检验， 显著水平，表明实验因子对响应值不是简单的线性关 优化了内在因素水平，找出最佳值。本研究经响应面 系，二次项对响应值也有很大的关系，这和模型回归 方法优化，得出樟芝真菌的最佳发酵条件为:接种量 中的线性和平方项影响显著相对应。交互项系数均不 15 %、培养温度 26.1 ?、葡萄糖添加量 3.9 %，优化条 显著，所以交互作用的影响相对较小。失拟项的 P= 件下经三批摇瓶培养实验验证，预测值与验证试验平 均值接近，此培养条件下樟芝菌体产量可达到 7.06g /L。 2.116，没有显著性影响，说明数据中没有异常点，不需 要引入更高次数的项，模型适当。 通过软件分析，得出当樟芝菌体量最大时，X= 1 -0.026 7;X=0.062 6;X=-0.073 2 ，计算得到樟芝液体 23 参考文献: 发酵工艺最佳条件为:接种量 15 %、培养温度 26.1 ?、 贾薇,刘艳芳,张劲松,等.樟芝深层发酵培养条件的优化[J].食品 [1] 科学，2004，25(5):52-55 葡萄糖添加量 3.9 %。此条件下，樟芝菌体产量最大值 ILEE I H,LING R, CHEN C T.Antrodia campholysraatce- phoarides [2] 为 7.03g /L。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采 exhibit anti-epatitis B virus effects [J]. FEMSMi cro-iol Lett, 2002, 用上述优化发酵条件进行发酵培养，实际测得的樟芝 209 (1):63-67吴其威 ,黄瑞珊. 樟芝菌发酵产物中多糖组分的分菌体产量为 7.06 g/L，与理论预测值相比，其相对误差 离与性质研究 [J]. 上海交通大学学报,1994,28(2):8-289 [3] 约为 1 %，因此，基于响应曲面法所得的樟芝发酵条件 Ahuja SK, Ferreira GM, MoreiraA R. Application oPf lackett - Burman design and response surfeacthoed mology to achievee xpo) 参数准确可靠，具有实用价值。[4] nential growthf or aggregated shipworm bacteriumBi[J]. otec hnology and bioengineering, 2004, 86665(3):-67 5 3 结论 实验证明响应面方法是优化发酵条件非常有效 收稿日期:2011-12-15 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ,上接第 页,156 [13] 赵祥杰,涂国全.一株桑椹果酒酵母的分离筛选及耐性测定[J].酿 (6):26-28 [6] 单艺,张兰威,崔宏斌.酵母菌的筛选及发酵特性研究 [J].食品工 酒科技,2007(1):28-32 业科技,2007(6):88-90 [14] 顾国贤,酿造酒工艺学[M].北京:中国轻工业出版社,1996:245- [7] 苏畅,肖冬光,许葵,等.几种进口葡萄酒活性干酵母发酵性能比 270 较,酿酒科技[J].2004(1):3-032 [15] 诸葛键,王正祥.工业微生物实验技术手册[M].北京:中国轻工业 [8] 申彤,陈红征,杨洁,等.哈密瓜酒产香酵母的筛选及特性研究[J]. 出版社,1997:84-189 酿酒科技,2004(3):3-638 [16] 吴国峰,李国全,马永强,等.工业发酵分析[M].北京:化学工业, [9] 赵芳.安琪牌葡萄酒活性干酵母在草莓酒酿造中的应用[J].中国 2012:137-140 酿造,2008(13):190 [17] 罗富英,王宏,李再峰.荔枝全汁发酵果酒工艺研究[J].食品工业 [10] 陆琦,张穗生,吴仁志,等.三株甘蔗糖蜜酒精发酵高产酵母株的 科技,2006,24(6):14-7149 筛选[J].广西科学,2010,17(4):368-372,376 [18] ShayY S,Ephraim P L,Ishak N.Antioxidant ei caonsdan oidenzyme [11] 陈瑶,赖崇德,刘玄,等.橙汁酿酒酵母株的分离筛选和发酵性能 inhibition properties of pom egranateo ils eeandd fermentejdu ice 的测定[J].江西农业大学学报,2007(4):665-668 flavonoids[J].Journal of Ethnopharmacology,1999,6(67):11-17 [12] 冯作山,张维一.优良葡萄酒酵母的选育及发酵性能研究[D].乌 鲁木齐:新疆农业大学,2000:4-6 收稿日期:2011-11-26