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论文资料-酶的分离纯化 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 介绍-（word）可编辑 酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤:即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。 关键词:酶 抽提 纯化 结晶 制剂 细胞破碎cell disruption 盐析 亲和沉淀 有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类: 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到; 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤:即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍: 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎(cell disruption) 高压均质器法:此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破 碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。要达到90%以上的细胞破碎率，起码要将菌悬液通过均质器两次。最好是提高操作压力，减少操作次数。但有人报道，当操作压力达到175Mpa时，破碎率可达100%。当压力超过70Mpa时，细胞破碎率上升较为缓慢。高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。丝状菌会堵塞均质器的阀门，尤其高浓度菌体时更是如此。在丰富培养基上比在合成培养基上生长的大肠菌更难破碎。 容菌酶处理法:蛋清中含有丰富的溶菌酶，价格便宜，常用来裂解细胞。具体做法是:溶壁微球菌 (micrococcus lysodeikticus)43kg，置于0.5%的氯化钠溶液中，使细胞浓度为5%(干重)，在35?用0.68kg(干重)的蛋清处理20min，得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理，用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去，再将乙醇浓度提高到75%(体积分数)，可以得到纯度为5%的过氧化氢酶 1500g。 2.离心 离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3种类型，所使用的设备有过滤式离心机、沉降式离心机和离心机。过滤式离心机的转鼓壁上开有小孔，壁上有过滤介质，一般可用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场合。沉降式离心机用于分离固体浓度较低的固液分离，如发酵液中的菌体，用盐析法或有机溶剂处理过的蛋白质等。分离机用于分离两种互不相溶的、密度有微小差别的乳浊液或含微量固体微粒的乳浊液。 在生物领域采用的离心机系统，除了应具备离心机的一般要求外，还应满足生物生产的技术要求，这包括灭菌、冷却、密封，以保证产品不受污染并不污染环境。现代哦离心机装置包括以下三个步骤，并进行程序控制:离心、离心系统的灭菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司离心机产品的装置，具有双重轴向密封，密封由装在转筒主轴上下的碳化硅动环和固定环组成，密封由水连续冷却和润滑，可防止产品被污染，也可防止生产过程中排出的废物对环境的污染。该离心机又如一个密闭的压力容器，可在121?温度下进行蒸汽灭菌，该离心设备设有环绕离心机转筒的冷却夹套，对悬浮液和浓缩的固体都能进行充分的冷却，并能有效地控制温度，这对于生物制品是非常重要的。如BTPX205型离心机可用于细胞收集、培养液的净化和细胞碎片的分离，可用于疫苗、酶制剂等的提取。该机的其他辅助系统及控制系统也较为完善，如设有压力指示器、力量计、温度传感器和液面传感器。 3.膜分离技术 在蛋白质纯化过程中主要用到的膜分离技术多为超滤。在静压作用下降溶液通过孔径非常小的滤膜，使溶液中分子量较小的溶质透过薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多数超滤膜是由一层非常薄的功能膜与较厚的支撑膜结合在一起而组成的。功能膜决定了膜的孔径，而支撑膜提供机械强度以抵抗静压力。超滤浓缩的优点是:操作条件温和，无相变化，对生物活性物质没有破坏。 超滤系统主要由料液贮罐、泵、超滤器、透过液收集罐组成，料液经泵打入超滤器，水及低分子量物质排出超滤器外，被浓缩的料液在料液贮罐、泵、及超滤器中循环。当料液浓缩至一定的倍数后即可作为进一步处理的浓缩料液。 超滤应用于蛋白质类物质的浓缩和脱盐过程中时应注意以下问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 :第一，在超滤循环过程中，由于泵和叶轮与料液的摩擦放热作用，料液的温度会逐渐升高，会造成蛋白质分子的损失。因此，料液贮罐应加冷却系统，并安装自动测温及控制系统。第二，某些酶的辅助因子散失为问题:一些酶含有辅助因子，其分子量小，超滤时易从透过液中排除掉，因而在超滤前或超滤后要添加一定浓度的的辅助因子。 还可将超滤与亲和层析相结合以提高分离纯度。其 工作原理 数字放映机工作原理变压器基本工作原理叉车的结构和工作原理袋收尘器工作原理主动脉球囊反搏护理 是:当溶液中欲被分离的蛋白质不受阻碍地通过超滤膜的孔隙时，如果在膜的一侧结合着亲和配基，该蛋白质就会与配基结 合因而结聚在膜的这一侧。不与配基结合的其他物质就将穿过孔而被带走。再用适宜的洗脱剂将该蛋白质洗脱下来，洗脱液用于进一步的分离纯化。 4.泡沫分离 原理:将气体通入含多种组分的溶液中，由于这些组分的表面活性由差异，因此在溶液的表面，某些组分将形成泡沫，泡沫的稳定性取决于操作条件及溶液的生物学特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的组分种类及其含量与溶液中的不相同。这样，溶液中的组分舅得以分离。蛋白质较易吸附与气液界面，这有利于其结构的稳定。泡沫分离过程是:蛋白质从主体溶液中扩散到气液界面，该过程可能是可逆的也可能是不可逆的;分子发生重排，一般认为在空气-水界面会形成两种类型的膜，一种是稀膜，另一种是浓膜，可能会发生由多个分子聚集在一起的现象。在气液界面形成的蛋白质膜可以是单层的也可以是多层的。膜的类型取决于主体溶液及气液界面上蛋白质的特性、结构和浓度。泡沫分离的目的，一方面提高酶蛋白的富集率(泡沫中蛋白质的浓度/最初溶液中蛋白质浓度)，另一方面提高酶蛋白的提取率(泡沫中蛋白质的提取率/最初的蛋白质质量)，或使多组分混合物中某一组分的分配系数最大。 二、抽提 沉淀 1. 盐析 常用的盐析剂是硫酸铵，其溶解度大、价格便宜。硫酸铵沉淀蛋白质的能力很强，其饱和溶液能使大多数的蛋白质沉淀下来。对酶没有破坏作用。 pH的控制:应从酶的溶解度与稳定性两个方面考虑，在酶等电点时其溶解度最小易沉淀，但有些酶再等电点时稳定性较差，因此要选择最佳pH值.一般要求在酶最稳定的pH值的前提下再考虑最适宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦确定最佳pH值后，在添加硫酸铵之前甲酸或碱调节好酶液的pH值，要尽量避免溶液pH值的波动以免破坏酶的稳定性。在添加硫酸铵时要注意搅拌，并注意硫酸铵的加入速度，一般是由少到多，缓慢加入，硫酸铵尽可能磨成细粉。 温度的控制:有些酶在较高温度下稳定性能较好，可在常温下进行盐析操作，而对于大多数酶，尽可能在低温下操作。 酶液的净置:加完硫酸铵后，酶液要静置一段时间，使酶蛋白完全沉淀下来，酶静置后，就不要再加以搅拌。 2(有机溶剂沉淀 有机溶剂选择:可用于酶蛋白沉淀的有机溶剂包括醇类物质等，如甲醇、乙醇、异丙醇。乙醇的亲水性能较好，可防止蛋白质的变性，酶蛋白在其中的溶解度也较低。 有机溶剂沉淀操作:有机溶剂一般都使蛋白质变性，当温度较高时变性蛋白质分子就会变成永久失活。因此用有机溶剂处理时最好在0?以下进行。用有机溶剂沉淀得到的酶蛋白不要放置过久，要尽快加水溶解。 3.聚合物絮凝剂沉淀 聚合物絮凝剂，如葡聚糖和聚乙二醇，与酶分子争夺水分子，具有脱水作用使酶沉淀。聚乙二醇作为一种沉淀剂的优点是在水溶液中，其浓度可达到 50%，浓度为 6%-12%的蛋白质大都可以沉淀下来。这种试剂不需要低温操作，而且对蛋白质的稳定还有一定的保护作用。聚乙二醇不会被吸附，故在离子交换吸附前不必去除。 4(用金属离子和络合物沉淀 酶和其他蛋白质都会形成金属盐，其溶解度较低。用金属离子沉淀的缺点是酶与金属离子相 互作用后，可逆变化较差，尤其是用巯基衍生物，它结合的]金属离子会催化酶变性而失活。 5(用特殊试剂沉淀法 用链霉素可选择性去除核酸，从而使胞内酶沉淀出来。链霉素盐(浓度为0.5-1.0mg/mg蛋白质)对于选择性沉淀核酸的效果比锰离子还要好，酶不易失活。 6(亲和沉淀 将亲和反应的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理量、地选择性有机结合形成了亲和沉淀技术。将配基与可溶性载体偶联后形成载体-配基复合物，该复合物与生物分子结合后在一定条件下可以沉淀出来。 配基-载体复合物可以选择性地与蛋白质结合，溶液中的pH值、离子强度及蛋白质浓度等条件对亲和结合的影响力并不大，只有竞争性的配基会降低产物与原配基的亲和结合力，甚至使亲和结合发生逆转。 引导产生沉淀的方法有:离子交联;加入带相反电荷的聚合物;加入带相反电荷的疏水基团;改变pH值，诱导产生疏水沉淀;温度诱导产生沉淀。 亲和结合:将亲和配基加入到含有目的物蛋白质的溶液中，调节好有关沉淀的条件，使之有利于亲和结合。 洗涤:为经过处理的粗制液中发生亲和沉淀可能会发生非特异性结合，尤其是使用带电的聚合物，离子交换的效应将使其他蛋白质共同沉淀，因此在分离目的物之前要洗涤沉淀物。其做法是:加入适当的清洗剂重新溶解沉淀，再沉淀;或在专一性洗脱之前，彻底清洗沉淀。在上述过程中要始终保持目的蛋白质与配基处于亲和结合状态。 配基-载体复合物与目的蛋白质的分离:分离结束之后，要确保回收目的蛋白质和配基-载体复合物，目的蛋白质要达到一定的纯度，回收率要高。 蛋白质分离纯化的一般程序 2010-04-08 13:18:15 来源:易生物实验 浏览次数:263 网友评论 0 条 (一)材料的预处理及细胞破碎 (二)蛋白质的抽提 (三)蛋白质粗制品的获得 (四)样品的进一步分离纯化 关键词:蛋白质分离纯化预处理细胞破碎蛋白质抽提 蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤: (一)材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有: 1.机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2.渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3.反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4.超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5.酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二)蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等)，使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 (三)蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法: 1.等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 (四)样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有:凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。 有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品 酶是生物催化剂， 酶制剂工业是生物技术产业化的重要工业部门。其应用领域遍及轻工、食品、化工、医药卫生、农业以及能源、环境保护等，对国民经济将起到重要作用。实践证明，酶制剂工业将成为轻工、食品工业支柱产业，它将是21世纪最有希望的新兴产业之一。 一、我国酶制剂发展现状 我国的酶制剂工业，自1965年在无锡建立我国第一个酶制剂厂以来，经过三十多年努力，已形成了一定生产规模: 1.生产产品与品种:有α-淀粉酶、糖化酶、β-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶等15个产品，50,60个品种。 2.产品产量较高速度增长: 年代产量(万吨) 年平均递增率(%) 1980 0.89 80-85年 36.18 1985 2.5 85-90年 48.00 1990 8.5 90-95年 31.76 1995 22.0 1996 24 1997 22 1998 22.1 3.生产水平:酶制剂生产水平成倍或十多倍的提高，特别是糖化酶生产水平提高15倍，达到国际水平。 4.产品质量稳定提高:特别是糖化酶产品质量已达到国际先进水平，在国际市场上有较高竞争能力。 30多年来，我国酶制剂工业取得了不小成绩，但与世界发达国家比，与诺和诺德、杰能科等世界著名公司比，还存在很大差距，主要表现是: 1.科研开发投入不足。国外一般开发费投入占总销售额的10%以上，高的达15%以上，而我国不到1%，因此无力增加科研装备，采用新技术，增强科研力量，造成产品开发不快，工业生产产品不多，生产水平较低。 2.提取工艺和装备虽进行改革，但总体上说我国提取手段落后，绝大多数工厂沿用硫酸铵(硫酸钠)盐析工艺或发酵液直接喷干燥工艺，造成产品粗糙、杂质多、质量差，不仅影响下游产业产品质量的提高，应用面扩大，也影响了自身的环境保护。 3.产品结构极不合理，影响酶制剂行业发展及应用领域开拓。1998年酶制剂总产量22.1万吨，其中α-淀粉酶占17.19%，糖化酶占60.18%，碱性蛋白酶18.10%。三个酶产量占总产量的 95.47%，其它的十几个酶制剂产品产量仅占4.53%。由于上述结构不平衡，使我国的酶制剂应用领域局限于淀粉加工工业、洗涤工业等，与国外应用领域有极大差距，影响了酶制剂工业健康发展。 4.酶制剂行业效益低下，无力进行开发和改造。我国的酶制剂建设，由于起点低、重复建设 严重，据不完全统计，年生产能力达40万吨，但40-50%生产力闲置，再加上粗放经营，无序价格竞争，使酶制剂行业生产成本与销售价70-80%，而国外仅占30-35%，造成效益低下，使行业停滞不前。 二、酶制剂发展及其对策 酶制剂工业是21世纪最有希望的新兴产业之一，为了适应这个发展趋势，笔者认为，我国酶制剂工业以后5-8年的发展，主要考虑在现有应用领域提高基础上，重点发展的应用领域是:动物饲料工业、低聚糖工业、棉纤维与纺织加工、洗涤剂、焙烤工业、防护用品、蛋白质水解、淀粉改良、纸浆、造纸用酶等。只有这样，才能赶上国际酶制剂发展步伐。 要现实酶制剂工业进一步发展，适应国民经济发展要求，并能参与国际市场竞争，笔者认为:根据我国国情、行情应该采取下列对策: 1.加快调整产品结构，努力提高产品水平。我国酶制剂销售额，在国际市场上所占比例很少。如1998年，约占5%不到。生产设备简陋，产品单一、粗糙、杂质多，不能满足市场需要和发展，竞争处于劣势，为此，加快产品结构调整，努力提高产品水平是当务之急。 (1)加快开发洗涤剂用酶、纺织用酶、饲料用酶、焙烤用酶、纸浆、造纸用酶、果汁用酶、低聚糖用酶、蛋白质水解用酶等配套产品，大力提高这些产品占有份额。 (2)根据市场要求，大力开发复合酶、专用酶，提高应用效果，简化应用途径，增强竞争能力。 (3)改革提取工艺，革除硫酸铵(硫酸钠)等盐析的粉状工艺产品，大力发展液剂型、颗粒剂型产品，重视固定化酶(细胞)产品发展。 (4)努力创新工艺，重点解决酶分离、纯化、配伍技术，大力提高产品质量。 (5)加强应用技术研究，扩大应用领域。 2.尽快推广应用先进技术，在消化吸收中创立中国酶制剂工业的核心技术。 我国酶制剂工业由于起点低，投入小，运用新技术较缓慢，直接影响到今日的市场竞争、企业生存。因此，尽快采用国内外行之有效的先进技术，在这个基础上，进行创新，建立中国酶制剂工业的核心技术是竞争需要。 (1)近年来，国际上酶制剂发展很快，与广泛采用基因工程、蛋白质工程及其它新技术有关，而我国到目前为止，工业生产的酶制剂仅α-乙酰乳酸脱羧酶等少数产品。笔者认为，我国酶制剂行业要具有竞争力，应尽快实施行之有效的新技术推广应用，推动行业的技术进步。 (2)尽快在消化吸收基础上，进行技术创新，建立我国酶制剂行业研究、开发、生产和应用核心技术。 (3)完善和发展固体发酵技术。实践证明，凡是丝状菌体生产的新酶制剂，发酵水平可比 液体深层发酵高3-10倍，有的甚至高达20倍。如何克服固体发酵现有缺点，完善和发展该项技术，将对我国酶制剂行业发展具有重大作用。 3.积极推行清洁生产和环境保护政策。我国酶制剂行业由于设备简陋、管理粗放，在生产过程中造成环境污染较为严重，影响水质和空气，要使酶制剂工业能持续发展，必须积极推行清洁生产和环境治理技术。 4.企业要改革，走联合、重组、规模经济道路。 我国酶制剂工业由于起点低、投资少，生产水平低，产品结构严重失调，加上近年来的市场竞争剧烈，大多数企业处于困境。要摆脱困境，企业必须进行改革，走联合、重组、规模经济道路。