终稿牛源鹦鹉热衣原体MOMP基因的克隆

终稿牛源鹦鹉热衣原体MOMP基因的克隆 牛源鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白基因的克隆 Cloning of Bovine Chlamydia Psittaci Main Outer Membrane Protein Gene 牛源鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白基因的克隆 摘 要:鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白有属特异性、种特异性和血清型特异性的抗原决定簇,是衣原体在感染过程中的主要致病因子,具有潜在的诊断试剂开发价值,也是疫苗研究的主要位点。根据GenBank中收录的鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因序列 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 合成1对引物,以牛源鹦鹉热衣原体基因组为模板,应用PCR扩增MOMP基因,将其克隆到 pEASY-T1载体上,并进行序列分析,之后与流产衣原体的MOMP同源性进行分析对比, 结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明由我们分离的牛源鹦鹉热衣原体NY1株的MOMP基因序列与GenBank中收录的 流产衣原体OCLH 196株、BA1株(牛)、B577株(羊)、EBA株(牛)等都有很高的相似性,均 达到99%以上。 关键词:MOMP,基因,鹦鹉热衣原体,序列 Cloning of Bovine Chlamydia Psittaci Main Outer Membrane Protein Gene Abstract:Chlamydia psittaci main outer membrane protein(MOMP) has the specificity, the Species-specific and the blood serum specificity antigen decision bunch. It is the Chlamydia in course of infection main pathogenic factor and has the latent diagnosis reagent development value. It is also the main position spot of Vaccine research. According to the sequence of main outer membrane protein of Chlamydia psittaci gene recorded in the Genbank, we designed a pair of primers. With bovine Chlamydia psittaci genome as cyclostyle, using PCR to amplify MOMP gene, then cloning it to pEASY-T1 vector. Finally analyze its sequence and comparing their homology with abortigenic Chlamydiae’s MOMP. The results showed that the homology of MOMP gene were more than 99% between NY1 strain isolated from psittacosis Chlamydia and OCLH196(cattle) 、BA1(cattle)、B577(sheep)、EBA(cattle) e.g. that rescored in the Genbank. Keywords: MOMP; Gene; Chlamydia psittaci; sequence 目 录 前 言 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 3 1材料与方法 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 5 1 1.1实验材料 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 5 1.1.1试剂 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 5 1.1.2实验动物 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 5 1.1.3 主要仪器设备 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 5 1.1.4主要试剂的配制 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 5 1.2实验方法 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 5 1.2.1引物的设计 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 5 1.2.2模板DNA的提取 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 6 1.2.3 PCR反应体系的建立 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 6 1.2.4 PCR产物回收 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 6 1.2.5 回收的PCR产物与pEASY-T1载体的连接与转化 ??????????????????????????????????????????????????????? 7 1.2.6质粒DNA的提取(质粒小提试剂盒) ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 7 1.2.7重组质粒酶切鉴定????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 8 1.2.8重组质粒PCR鉴定????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 8 1.2.9序列测定 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 8 2.结果 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 8 2.1 PCR产物的电泳结果????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 9 2.2重组质粒的双酶切鉴定 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 9 2.3重组质粒PCR鉴定 ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 10 2.4测序结果 ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 10 3.讨论 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 11 4.结论 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 12 参考文献????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 13 附录 ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 14 谢辞 ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 15 前 言 衣原体是一类具有滤过性、严格细胞内寄生，并经独特发育周期以二等分裂繁殖和形成 包涵体的革兰氏阴性原核细胞型微生物，直径0.2-1.5um，它只能在寄主细胞原生质内部以 2 一种发育史进行繁殖。此发育史是以小的原生小体(elementary body，EB)变成较大的网状体(reticular body，RB)为特征的，RB以分裂方式繁殖，发育成熟后破裂，释放出大量的EB。EB是一个小的，电子密度大的小球，直径 0.2-0.4um，含有一个核和许多核糖体，核和核糖体被包在一个多层壁中;RB是一个大的，具有薄壁的网状球形体，直径0.8-1.5um，含有核丝和核糖单位，还存在一种中间体，代表网状体和原体之间的过渡阶段。EB具有感染性，而网状体对新的宿主细胞未见有感染性。衣原体细胞壁的结构和成分与其他革兰氏阴性细菌的相似。细胞壁有属特异脂多糖抗原。衣原体具有广泛的宿主，但家畜中以羊、牛、猪较为易感。畜禽不分年龄均可感染，但不同年龄的畜禽其症状表现不一。幼羊(1-8)月龄多表现为关节炎、结膜炎，犊牛(6月龄以前)、仔猪多表现为肺肠炎，怀孕牛、羊、猪则多数发生流 [1]产(蔡宝祥，2001)。人类不是Cps的天然宿主，但宠物饲养者、养禽厂工人等与家禽家畜密切接触者可通过吸入具有感染性的分泌物而感染，引起肺炎和败血症，称为鹦鹉热或鸟疫。Cps不仅是一种人畜共患病原菌，又是一种经典的生物战剂。 衣原体产生一种衣原体属内保守的群特异性脂多糖(LPS)决定簇(BdareL,tal,1990)。所有的衣原体都编码一种丰富的表面蛋白，称之为主要外膜蛋白(MOMP或OmpA)，OmpA含有衣原体血清学分类的主要的决定簇。对6个衣原体基因组测序研究工作的完成、补充和扩大了衣原体前基因组学领域更多的信息(Rockye D D et al,2000)。在已知蛋白组中，有2组蛋白包涵体膜(Inc)蛋白和多形态膜蛋白(PmP)是衣原体独有的。其它2组蛋白，与肽聚糖(PG)的合成及衣原体?型分泌系统相关，别的细菌也具有。然而，这4组蛋白是截然不同并毫不相关，各自代表着衣原体独特性质的一个方面。 近年来，衣原体研究的焦点集中于外膜蛋白复合物(OMC)上。OMC是衣原体毒性的主要决定基因，在与宿主细胞吸附、进入和与吞噬性溶酶体结合过程中起作用。研究中发现OMC的主要成分为主要外膜蛋白。Herring等对衣原体外膜蛋白进行提纯，使其含有90%以上的40KD蛋白。用感染后处于恢复期的羊血清对该蛋白进行免疫印迹反应，证明此40KD蛋白具有很强的抗原性，经测定，40KD蛋白即为MOMP。 鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(main outer membrane protein, MOMP)是呈感染性的原体(EB)表面的主要膜蛋白，等电点在5.3-5.5之间。MOMP在EB的外膜中通过二硫键起维持细胞结构的作用，并且在感染过程中起重要作用。MOMP是Cps最主要的保护性抗原，可刺激机体产生中和抗体。氨基酸序列分析表明，MOMP有4个可变区(Variable domain ，VD)，分别镶嵌于5个高度保守的恒定区内。血清型特异抗原决定簇位于VD1或VD2，而种特异抗原决定簇位于VD4。研究发现，MOMP表面有B细胞和T细胞表位，针对这些表位的单 3 克隆抗体在体外可以有效预防衣原体的感染。 Zhang等对两株鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白进行了克隆和测序，开始从基因的水平去研 [16]究鹦鹉热衣原体(Zhang Y X et al, 1989 ) 。Herring A J对鹦鹉热衣原体羊流产株主要外膜蛋 [8]白进行了序列分析，发现与沙眼衣原体具有相同的结构(Herring A J et al, 1989)。鹦鹉热衣原体与沙眼衣原体免疫型1和2主要外膜复合体属特异性表位也被进行了确定。运用单克隆抗体和多克隆抗体研究发现，在外膜复合体上，主要外膜蛋白和由57kDa和62kDa蛋白形成 [10]的双联体组成(Mondesire R R et al, 1989 ) 。Yuan Y等对鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白基因 [15](Omp1)多串连启动子进行了研究(Yuan Y Zhang et al, 1990 ) 。Kikuta A等对禽鹦鹉热衣原 [9]体主要外膜蛋白的抗原性进行了分析(Kikuta A et al, 1991 )。Black C M等研究发现，衣原 [6]体种之间可以用限制性片断长度多态型分析( RFLP)进行区别(Black C M et al, 1992)。Zhao Q等对GPIC株的等位基因进行了研究，发现不像沙眼衣原体，鹦鹉热衣原体GPIC缺乏等 [17]位基因(Zhao Q et al, 1993 ) 。Westbay T D对鹦鹉热衣原体GPIC株外膜蛋白的免疫决定簇 [14]进行了研究(Westbay T D et al, 1994 ) 。 [13] Tanzer R J等(2001)结合表位定位研究，对衣原体种间和种内MOMP的氨基酸序列进行比较，发现衣原体的中和表位位于MOMP的4个不同的片段。用衣原体外膜复合物生产的疫苗制剂富含天然状态的MOMP，证明用该疫苗免疫可以保护绵羊、豚鼠和老鼠免受衣原体病危害。但是，用变性的或非天然的重组MOMP制剂免疫动物仅仅只能产生部分保护。 [11]Tan T W等(1990 )开始了亚单位疫苗的研究，认为在MOMP上存在重要的免疫保护抗原决 [11]定簇。Sandbulte J等(1996)用鹦鹉热衣原体的EB、外膜复合体(COMC), MOMP、脂多糖(LPS)以及脂多糖和主要外膜蛋白的混合物分别制成疫苗免疫小鼠，发现MOMP是刺激机体产生保护性抗体的主要抗原。 [2] 2000年(刘向伟等，2002 )，军事医学科学院微生物流行病研究所的刘向伟等对10株鹦鹉热衣原体(2株来自猪的肠道，2株来自绵羊的肠道，3株来自鸟，2株来自奶牛，1株来自鸭)的MOMP基因进行了测序和比较研究，发现它们之间有很高的同源性，是适合的疫苗研究位点。刘向伟等(2002年)对羊鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白基因序列进行了扩增，并对其进行克隆和原核表达，为进一步进行鹦鹉热衣原体的诊断试剂和疫苗研究创造了条件。糜祖 [3]煌等(2002年)对鹦鹉热衣原体套式PCR和DNA测序方法进行了研究，4株鹦鹉热衣原体均能扩增出214bp的条带，而沙眼衣原体、肺炎衣原体，肺炎支原体均不能扩出，用此方法来区别鹦鹉热衣原体和其他衣原体。邱昌庆等在2002年建立了猪的衣原体病PCR诊断技术，并对两株不同血清型猪衣原体MOMP基因进行了克隆和测序，比较了它们之间的同源性。 4 2003年张浩杰等对鹦鹉热衣原体B细胞表位进行了表达和抗原鉴定，验证了对所筛选表位的真实性。 尽管国内在动物衣原体病方面做了很多的研究工作，但是到目前为止，在预防奶牛衣原体病方面还没有基因工程疫苗和较好的诊断试剂。衣原体灭活疫苗曾在哺乳动物预防衣原体病方面取得了一定的效果，但由于牛源鹦鹉热衣原体属严格细胞内寄生的微生物培养比较困难，结构复杂，而传统疫苗存在发生毒力返强的可能(弱毒疫苗)，免疫力差(灭活疫苗)等缺点，限制了鹦鹉热衣原体灭活苗和弱毒疫苗的发展。所以进行牛源鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白克隆的研究，进而构建重组菌株，为衣原体基因工程疫苗的研制奠定基础。目前，关于牛源鹦鹉热衣原体MOMP克隆的研究尚未见到国内外的公开报道。 1材料与方法 1.1实验材料 牛源鹦鹉热衣原体NY1株，本室分离保存。 1.1.1试剂 pEASY-T克隆载体、蛋白Marker购自北京全式金生物技术有限公司;质粒小提试剂盒1 购于爱思进生物技术(杭州)有限公司;DNA Marker、2×EasyTaq PCR SuperrMix购自天根生化科技有限公司;胶回收试剂盒购自美国Promega公司;限制性内切酶Xba?和BamH?购自NEB公司;PCR试剂盒:dNTP、ExTaq酶购自大连宝生物公司。 1.1.2实验动物 9-10日龄鸡胚:购自银川某鸡场健康鸡胚(无衣原体感染)。 1.1.3 主要仪器设备 电子天平(SARTORUS AG BP1215 )、凝胶成像系统(BIO-RAD公司)、冷冻台式离心机(Eppendorf产品)、高速离心机(Eppendorf 产品)等。 1.1.4主要试剂的配制 试验中所用溶液、缓冲液具体配方见附录。 1.2实验方法 1.2.1引物的设计 登录 Genbank，下载相关的基因序列，用DNAstar和OLIGO软件针对牛鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因设计合成了2套引物(表1)。由上海生工生物工程有限公司合成。 5 表1 MOMP扩增引物序列 编号 序列 长度(bp) 上游引物 5’-GCGTCGACATGAAAAAACTCTTG-3’ 23 下游引物 5’-CAGCGGCCGCTTAGAATCTGAATTGAG-3’ 27 1.2.2模板DNA的提取 取7日龄SPF鸡胚，接种0.5ml冷冻保藏的菌种于卵黄囊中，置于37?温箱中培养。弃去3日内死亡的鸡胚，3日后死亡的鸡胚为衣原体感染致死，取三个卵黄囊加玻璃砂研磨，加10ml生理盐水，1500r/min离心20min，取中间层液，小心铺在30%的泛影葡胺上，15000r/min离心30min，弃上清，沉淀用生理盐水溶解。然后用细菌基因组DNA提取试剂盒提模板DNA。测得OD值为78.6ng/μL。 1.2.3 PCR反应体系的建立 表2 MOMP基因扩增体系 扩增体系 总体积25μL 10*PCR缓冲液 2.5μL dNTP(2.5mmol/L) 2μL 上游引物:Mp1(50pmol/L) 0.5μL 下游引物:Mp2(50pmol/L) 0.5μL 模板DNA 1μL Taq酶(5U/μL) 0.5μL 灭菌无离子水 18μL 扩增体系:95?预变性5min后进行如下循环:94?变性1min，55?退火1min，72?延伸2min，共25个循环，最后72?延伸10min。扩增完后，取PCR产物25μL，用1%琼脂糖凝胶电泳并观察结果。 1.2.4 PCR产物回收 牛源鹦鹉热衣原体CPL株MOMP基因PCR产物的回收依照胶回收试剂盒进行。 l)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，装入事先准备好的1.5mL管中。 2)每10mg胶中加入10ul的DR-1缓冲液。 3)均匀混合后55?加热融化胶块(低熔点琼脂糖凝胶只需要在45?加热)，此间振荡混匀，使胶块充分融化。 4)装柱:将溶解好的溶液加入回收柱中，将回收柱套入2mL收集管中。 5)室温置1min，16,000×g离心1min,去除废液。 6)漂洗:将700μL洗脱液加入回收柱内，重新套入收集管中，16,000×g离心1min。 7)将500ul洗脱液加入回收柱内，重新套入收集管中，16,000×g离心5min，再空离1min. 6 8)弃去废液，将回收柱套入洁净无菌的1.5ml小指管中。 9)加入50μL Nuclease-Free water,室温放置1min，16,000×g离心1min. 10)1.5ml小指管底部的溶液即为回收的DNA。 1.2.5 回收的PCR产物与pEASY-T1载体的连接与转化 根据T载体的说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 进行 l)取回收的PCR产物2.5μL，pEASY-T1载体1μL，无菌水1μL于PCR反应管中轻轻混匀。 2)25?连接15min,然后置于冰上。 3)加连接产物于50μL Trans1-T1感受态中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴20-30min. 4)42?热激30s，立即置于冰上2min. 5)加250μL平衡至室温的BOC，200转，37?孵育1h. 6)取200μL菌液铺板，培养过夜(为得到较多克隆，4000rpm离心1min,弃掉部分上清，保留100-150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜)。 7)菌落PCR鉴定 在十个已标号的1.5ml EP管中分别加入800μL含Amp的LB液体培养基，在对应的10个EP管中加入分别20μL去离子无菌水，挑菌。将加有培养基的EP管在摇床内培养，另外10管做菌落PCR检测。 1.2.6质粒DNA的提取(质粒小提试剂盒) 1)柱平衡步骤:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm(,13,400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 2)取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机,12,000rpm(,13,400×g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。 3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL P1(先加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。 4)向离心管中加入250μL溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。 5)向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm(,13,400×g)离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。 6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀，12,000rpm(,13,400×g)离心30-60s,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 7 7)向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(PW中要加入无水乙醇)，12,000rpm(,13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 8)向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(PW中要加入无水乙醇)，12,000rpm(,13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液。 9)将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm(,13,400×g)离心2min.目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。CP3开盖室温放置数分钟。 将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加5μL-100μL洗脱缓10) 冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(,13,400×g)离心1min，将质粒收集到离心管中。 1.2.7重组质粒酶切鉴定 将提取的质粒按照表3体系进行酶切鉴定，检测是否插入了目的基因片断。 表3酶切鉴定体系 体系 总体积20μL 重组质粒DNA 5μL Buffer 6 2μL Sal I(101U/μL) 1μL Not I(101U/μL) 1μL 去离子无菌水 11μL 置37?水浴中2h。取出，电泳观察。 1.2.8重组质粒PCR鉴定 对提取的阳性质粒进行PCR鉴定，检测插入的片段是否为牛鹦鹉热衣原体MOMP基因，PCR反应体系按表4进行。 表4 PCR鉴定体系 DNA模板 上游引物 下游引物 Taq酶 Mix 去离子无菌水 1μL 0.5μL 0.5μL 0.2μL 12.5μL 10.3μL 扩增体系:95?预变性5min后进行如下循环:94?变性1min，55?退火1min，72?延伸2min，共30个循环，最后72?延伸10min，扩增完后，取PCR产物25μL，用1%琼脂糖凝胶电泳并观察结果。 1.2.9序列测定 经酶切鉴定和PCR鉴定的阳性重组质粒，取菌液20μL，送上海生工生物工程有限公司测序。 8 2.结果 2.1 PCR产物的电泳结果 电泳图谱见图1。图中扩增出了1100bp左右的特异带,与国内外报道的目的片段大小基本一致。 ? 图1 MOMP基因PCR产物电泳结果 1. DL 2000 Marker, 2.3. PCR产物 2.2重组质粒的双酶切鉴定 利用PCR技术从牛源鹦鹉热衣原体分离株的基因组中扩增出目的基因，利用PCR产物纯化试剂盒回收1100bp左右的PCR基因片段，将该片段与pEASY-T1进行连接转化至宿主细胞Trans1-T1中，提取质粒进行酶切鉴定，鉴于上游引物引入Sal?，下游引物引入Not?酶切位点，因此首先用Sal?、Not?对质粒进行酶切鉴定，电泳显示有1100bp左右的酶切片段出现;同时根据NCBI所报道的牛源鹦鹉热衣原体MOMP基因分析，其626位点分别具有EcoR?单一酶切位点，因此设计用Sal?及EcoR?双酶切质粒进一步分析，电泳结果在600bp左右出现酶切条带(图2)，以上酶切分析初步显示牛源鹦鹉热衣原体MOMP基因克隆正确，挑选阳性克隆菌落进行基因序列测定。 1 2 M 3 bp 2000 1108 1000 9 750 625 500 250 100 图2 重组质粒的酶切鉴定 双酶切结果,2.阴性对照,3.单酶切结果,M.DL 2000 1. 2.3重组质粒PCR鉴定 对重组质粒进行PCR扩增，电泳，结果如3所示: M 1 2 3 bp 2000 ?1108bp 1000 750 500 250 100 图3 重组质粒PCR鉴定 M. DL 2000 Marker,1.阴性对照,2. PCR扩增产物;3. PCR扩增产物 从图中可以看出，扩增出一条大小1100bp的条带，说明插入的片段为牛源鹦鹉热衣原体NY1株的MOMP基因片段。 2.4测序结果 为进一步确定所克隆的基因是否为牛源鹦鹉热衣原体MOMP基因，选酶切鉴定正确的阳性克隆经上海生工生物工程有限公司测定了其核苷酸序列(图4)，结果表明，该基因大小为1108bp，其核苷酸序列经BLAST与GenBank中收录的流产衣原体OCLH 196株、BA1株(牛)、B577株(羊)、EBA株(牛)等对比都有很高的相似性,均达到99%以上,这与邱昌庆等报道的基本一致,只在核苷酸序列第856位由A突变为G,由此而导致相应位点的氨基酸由Ser变为Glu。表明我们已成功地克隆了牛源鹦鹉热衣原体MOMP基因。 10 图4牛源鹦鹉热衣原体NY1株MOMP的基因序列 3.讨论 MOMP是呈感染性的原体(EB)表面的主要膜蛋白，等电点在5.3-5.5之间。MOMP在EB的外膜中通过二硫键起维持细胞结构的作用，并且在感染过程中起重要作用。MOMP是Cps最主要的保护性抗原，可刺激机体产生中和抗体。氨基酸序列分析表明，MOMP有4个可变区(Variable domain ，VD)，分别镶嵌于5个高度保守的恒定区内。血清型特异抗原决定簇位于VD1或VD2，而种特异抗原决定簇位于VD4。研究发现，MOMP表面有B细胞和T细胞表位，针对这些表位的单克隆抗体在体外可以有效预防衣原体的感染。 MOMP在衣原体的外膜蛋白中占60%，它是在衣原体疫苗中最被关注的抗原，所以对它的研究也最详细。MOMP分子量为40kD。是一种多功能蛋白，在感染过程中起重要作用，在原体的外膜中通过二硫键起保持结构的作用。本研究证实，不同宿主来源的鹦鹉热衣原体的MOMP基因具有很高的相似性，是适合的疫苗研究的位点。 4.结论 经基因组提取试剂盒提取，PCR电泳图谱分析可知得到了与预期大小相符合的条带。进一步通过酶切鉴定和PCR鉴定，说明牛源鹦鹉热衣原体NYI株的MOMP基因片断正确插入到pEASY-T1载体之中，并通过上海生工生物工程有限公司进行了正确的测序。用DNAMAN软件分析，测序结果正确，将其与鹦鹉热衣原体其他分离株MOMP核苷酸序列和氨基酸序列分析 11 表明，本毒株的MOMP基因序列与GenBank中收录的流产衣原体OCLH 196株、BA1株(牛)、B577株(羊)、EBA株(牛)等都有很高的相似性，均达到99%以上，这与邱昌庆等报道的基本一致，只在核苷酸序列第856位由A突变为G，由此而导致相应位点的氨基酸由Ser变为Glu。针对这一点，将在以后的研究中进一步进行研究。 参考文献 [1] 蔡宝祥等主编,家畜传染病学,北京,中国农业出版社,2001. [2] 刘向伟,端青,张浩杰等.鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白基因序列的扩增、克隆和原核表达.微生物学免疫学进展,2002,30(2):32-34; [3] 糜祖煌,秦玲,鹦鹉热衣原体套式PCR和DNA测序方法研究.中国人兽共患病杂志,2002,18(3):68-70. [4] 邱昌庆,周继章,谷玉辉.猪源鹦鹉热衣原体外膜主要蛋白编码基因的克隆和序列测定.中国兽医科 12 技,2002,32(6):10-14; [5] 周继章,邱昌庆,程淑敏等，我国部分地区肉用牛群衣原体病的血清学调查,中国兽医科技， 2000,30(7):14-15. [6] Black C M, Tharpe J A, Russell H. Distinguishing Chlamydia species by restriction analysis of the major outer membrane protein gene. Molecular and Cellular Probes, 1992, 6(5):395-400. [7] Fukushi H, Hirai K, Immunochemical diversity of the major outer membrane protein of avian and mammalian Chlamydia psittaci. Journal of Clinical Microbiology, 1988, 26(4):675-680. [8] Herring A J.Tan T W. Baxter S. et al.Sequence analysis of the major outer membrane protein gene of an ovine abortion of Chlamydia psittaci. FEMS Microbiology Letters, 1989, 53(1-2):153-158. [9] Kikuta, A. Furukawa, N. Yoshida, T. et al. Antigentic analysis of aviar Chlamydia psittaci using monoclonal antibodies to the major outer membrane protein. The Journal of Veterianry Medical Science, 1991, 53(3):385-389. [10] Mondesire R R, Maclean I W, Shewen P E, et al. Identification of genus-specific epitopes on the outer membrane complexes of Chlamydia trachomatis and Chlamydia psittaci immunotypes 1and2,Infection and Immunity,1989,57(9):2914-2918. [11] Sandbulte J, TerWee J, Wigington K, et al. Evaluation of Chlamydia psittaci subfraction and subunit preparations for their protective capacities. Veterinary Microbiology,1996,48(3-4):269-282. [12] Tan T W, Herring A J, Anderson I E, et al. Protection of sheep against Chlamydia psittaci infection with a subcellular vaccine containing the major outer membrane protein.Infection and Immunity, 1990, 58(9):3101-3108. [13] Tanzer R J, Longbottom D, Hatch T P, et al. Identification of polymorphic outer membrane proteins of Chlamydia psittaci 6BC.Infection and Immunity,2001,69(4):2428-2434. [14] Westbay T D Dascher C C,Hsia R C, et al. Dissociation of immune determinants of outer membrane protein of Chlamydia psittaci strain guinea pig inclusion conjunctivitis. Infection and Immunity, 1994, 62(12):5614-5623. [15] Yuan Y, Zhang Y X, Manning D S, et al. Multiple tandem promoters of the major outer membrane protein gene(ompI)of Chlamydia psittaci. Infection and Immunity, 1990, 58(9):2850-2855. [16] Zhang Y X, Morrison S G, Caldwell H D, et al. Cloning and sequence analysis of the major outer membrane protein genes of two Chlamydia psittaci strains. Infection and Immunity, 1989, 57(5):1621-1625. [17] Zhao Q, Schachter J, Stephens R S, Lack of allelic polymorphism for the major outer membrane protein gene of the agent of guinea pig inclusion conjunctivitis(Chlamydia psittaci).Infection and Immunity,1993,61(7):3078-3080. 附 录 1.TE 缓冲液的配制(PH=8.0) 200mL 10m mol/l Tris-Hcl(PH=8.0) 1m mol/l EDTA(PH=8.0) 称取0.242g Tris碱，加入150ml蒸馏水溶解，定容至200ml,调PH值至8.0. 13 称取0.058g EDTA,加入150ml蒸馏水溶解，定容至200ml,调PH值至8.0. 121?高压灭菌30min后，以10:1的比例将Tris碱和EDTA混匀，4?保存备用。 2.20%十二烷基硫酸钠(SDS)的配制 100mL 在80ml水中加入20g SDS，加热(68?)溶解，用浓盐酸调PH值至7.2，加水定容至100ml,121?高压灭菌30min后室温存放备用。 3.LB培养基的配制 1L 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 10g 称取以上药品至大烧杯内，加入蒸馏水溶解，用5mol/l 氢氧化钠调节PH至7.0，加入去离子水至总体积为1L,121?高压灭菌20min.固体培养基中在高压前加入琼脂粉15g/L即可。 4.SOB培养基的配制 1L 用电子分析天平分别称取一下药品到大烧杯内: 胰蛋白胨 20g 酵母提取物 5g 氯化钠 0.5g 先加入600ml去离子水，摇动容器使溶质完全溶解，加入10ML 250m mol/l KCl溶液。用5 mol/L NaOH调PH至7.0，用去离子水定容至1L，121?高压灭菌30min. 5.SOC培养基 SOC培养基除含有20m mol/l葡萄糖外，其它成分与SOB培养基相同。 SOB培养基经高压灭菌后冷却至60?或60?以下，加入20ml除菌的1mol/l 葡萄糖溶液即可。 6.1mol/l 葡萄糖溶液 用90ml去离子水溶解18g葡萄糖，完全溶解后，用去离子水定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，然后分装即可。 谢 辞 岁月如梭，大学四年学习生涯即将结束，回首往昔，点点滴滴都有无限的回忆。 感谢辛勤培育我的导师。 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 从选 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 到研究方法的确立以及文章的修改定稿都是在谢琴导师的悉心指导下完成的。导师严谨的治学态度、求真务实的工作作风都给我留下深刻印象，并令我终身受益。 14 感谢王盛老师，曾瑾老师在我的实验设计和论文写作过程中给予的大力支持，对我的疑惑给予的指点;感谢贾芳师姐，赵莉师姐以及赵栋师哥在整个实验过程中给予我的全力帮助，共同渡过了难忘的毕业时光。 和何玉春同学给予的支持，使我的实验能够快在我的具体实验过程中尤其感谢王杨师姐 速而准确的完成。 谢谢～ 15