异叶青兰总黄酮提取工艺的研究

异叶青兰总黄酮提取工艺的研究 异叶青兰总黄酮提取工艺的研究 第17卷第5期:79 2OO7年10月 生物技术 BI(yIECHN010GY V01.17,No.5:79 Oct.20D,7 从图2可以看出,这3种金属元素对拮抗链霉菌N0.24菌 株发酵产物活性的影响随着浓度的不同而不同,同图1一样, 不管其浓度如何,其发酵产物的活性都没有不加金属元素的 发酵产物的活性好,这可能是这3种金属元素本身对N0.24菌 株的细胞生长有阻碍作用,使得细胞生长缓慢,从而抑制了其 代谢和活性产物的合成. 2.3MS2,及两种离子的同时添加对西农N0.24茵株发 酵产物的生物量及生物活性的影响 Mg和ca2对拮抗链霉菌N0.24菌株发酵产物的活性具 有明显的促进效果,在培养基中同时添加这两种金属离子,发 酵产量是否会进一步提高?本节初步探讨了不同M和 配比对菌株发酵产物活性的影响.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明它们的作用 是互相叠加的.同时添加这两种金属离子比单独添加其中任 一 种的活性要好,且生物量增加,结果见表2. 表2Mg2,Ca2的添加对No.24菌株发酵产物生物活性的影响 Table2EffectsofMg2andOilthebioactivityoffermentationproducts 0fthestrain 从表2中可以看出,M和的单独添加对拮抗链霉 菌No.24菌株的生长及活性都有较大的促进作用,且在浓度 为0.003tool/埘,其生物量和抑菌圈直径都达到了最大值,分 别为l1.3g/L,10.67gJ,L平口35mm.而同时添加这两种金属离子 时,其生物量和活性提高更大,且在浓度为M0.002+ 0.003mol/L时,其生物量和抑菌圈直径分别为13.51g,L,40ram, 与对照相比,分别提高到了162.18%和181.82%. 3讨论 3.1金属离子作为微生物生长和代谢产物合成的重要影响 因子,在微生物生理研究,酶类性质研究及蛋白质,氨基酸,核 苷酸,维生素等发酵调控的研究中已有许多的报道,但有关其 对抗生素发酵的影响报导很少J,本文研究了13种金属元 素的添加对N0.24菌株的生长及其发酵产物杀菌活性的影 响,其中有1O种金属元素对其都有不同程度的促进作用,尤 其是Mg和ca『的添加对该菌株的促进作用最大,这说明金 属元素的添加能够刺激菌株的菌丝迅速生长并代谢更多代谢 产物. 3.2微生物抗生素的合成是多基因调控的数量性状,镁离子 和钙离子对西农N0.24菌株代谢产物的合成有强烈的刺激作 用,使其发酵的生物量和生物活性大大提高,这可能是这两种 离子能够作用于此抗生素合成的几个位点,同时M和ca2 还可能刺激了该菌的呼吸作用,加快了此菌的生长,降低了菌 株对自身所产抗生素的反馈抑制作用n].但其详细机理还 有待进一步的研究. 参考文献: [1]姜怡,杜冠华,孙秋.放线菌生物活性物质的高通量筛选[J].云南 大学,2OO4,26(4):364—366. 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Keywords:Dracocepha/amheterophyUwn;totalflavonoids;extractiontechnology 异叶青兰(ac.c神af帆hetewphyU~-n)系唇形科青兰属多中黄酮化合物含量. 年生草本植物,主要分布于辽宁,内蒙古,新疆,山西,西藏等 地.其主要用于治疗黄疸性发烧,肝热,热性病头痛,眼翳,口 腔溃疡,支气管炎,高血压等多种病症【】j.据文献报道该植 物所含黄酮类化合物有黄酮醇和二氢黄酮醇,但迄今有关异 叶青兰黄酮类化合物的含量及其提取工艺等方面的研究尚未 见报道.本文对异叶青兰所含黄酮类化合物的含量及最佳提 取工艺进行初步研究,为异叶青兰资源的开发提供依据. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1材料 1.1.1实验材料 异叶青兰花:采自新疆和田. I.I.2试剂 芦丁(中国药品生物制品检定所),无水乙醇,亚硝酸钠, 硝酸铝及氢氧化钠均为国产分析纯,天津市化学试剂三厂产. 1.1.3仪器 723一可见分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;电热 恒温水浴锅,京泰克仪器有限公司;UV一2450紫外分光光度 计,日本岛津公司;分析天平,北京赛多利天平有限公司. 1.2实验方法 I.2.I芦丁标准溶液的配制 准确称取芦丁标准样品20.3mg用70%乙醇溶解,并完全 移入100mL容量瓶中,用70%乙醇定容,配制成0,~3mg/mL 的标准液待用. 1.2.2最大吸收波长的选择 取上述芦丁标准溶液2.OraL于2OraL具塞试管,分别移取 70%乙醇至10mL,加入5%的NaNO~溶液0.6mL,摇匀放置 6min后加入10%的A1(N),溶液0.6mL,摇匀放置6min后再 加入4%的NaOH溶液5mL,混匀并用70%乙醇稀释至刻度, 15rain后在200,80Ohm波长范围内扫描,溶液在502nm有最大 吸收峰,故确定502nm为检测波长. 1.2.3工作曲线的建立 分别移取上述芦丁标准溶液0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0, 6.0,7.OraL于8只20mL具塞试管中,以下方法同1.2.2,在波 长502nm处比色测定,试剂为空白参比.以芦丁浓度为横坐 标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,如图1. 根据图1所得结果用最小二乘法作线形回归,得到芦丁 浓度Y与吸光度x关系曲线的回归方程:Y=11.648X+ 0.023I,相关系数r=0.9993,所以本实验芦丁浓度与吸光度有 良好的相关性. I.2.4样品液的制备和测定 准确称取1g粉碎过目的异叶青兰花,用70%的乙醇浸泡 并进行回流提取,将提取液抽滤后所得滤液置于100riLL容量 瓶中,用70%乙醇定容至刻度,摇匀.取此样品液5mL于 20mL具塞试管中,以下方法同1.2.2测定吸光度,计算提取物 收稿日期:2o07—05—22;修回日期:20凹一07—10 作者简介:余江~(1977一),女,硕士生,从事天然药物化学研究;*通 讯作者(Correspondingauthor);艾来提?苏里坦(1959一),男,博士,副教 授,从事天然药物化学研究,E—mail:ayrat1959@yahoo.c0『n.ell. OO.O20.040.O6O.O8 浓度(mg/mL) 图1芦丁标准浓度一吸光度 Figure1Standardrufinconcentrationabsorbance 总黄酮含量的测定:以芦丁为标样,采用亚硝酸钠一硝酸 铝比色法,在可见光502nm处测定其吸光值,通过标准曲线方 程计算提取液中总黄酮含量. 2结果与分析 2.1单因素实验 2.1.1乙醇浓度对提取的影响 分别用浓度为50%,60%,70%,80%,90%的乙醇按物料 比1:40,提取温度为60?,提取时间为2h的条件下进行测定, 测定提取液的总黄酮含量,确定最佳提取浓度,结果见图2. 三 骚 406O8O1OO 乙醇浓度(%) 图2乙醇浓度对提取的影响 Figure2EffectofalcoholconcentrationOtqextraction 从图2可以看出:乙醇浓度增加到60%以后黄酮含量逐 渐降低,并在50%70%有一个拐点,在60%时的总黄酮含量 最高.可能是由于随着乙醇浓度增大,黄酮类化合物溶解度 减少,同时一些醇溶性杂质,色素,亲酯性强的成分溶出量增 加,这些成分与黄酮类化合物竞争同乙醇:水分子结合,从而 导致黄酮类化合物的提取量下降j.故选取乙醇浓度在60% 较好. 2.1.2提取时间对提取的影响 在乙醇浓度60%,料液比1:40,温度60?的条件下,每隔 0.5h计算一次提取液的总黄酮含量,结果见图3. 由图3可知,当回流时间为2.5h时,提取效果最好.但若 时间继续延长,总黄酮含量反而降低.这可能是回流时间太 长,部分乙醇挥发而导致沸点逐渐增大,从而破坏某些黄酮类 98765432lO OOOOOOOOO 重毯果 642O8642O 2007年1O月异叶青兰总黄酮提取工艺的研究8l 化合物. 01234 时问(h) 图3提取时间对提取的影响 Figure3EffectoftimeOll吐rac0n 2.1.3料液比对提取的影响 用60%乙醇溶液按回流温度60~C,提取时间2.5h,料液比 (g/n~)分别为1:20,1:30,1:40,1:50,1:60进行提取,结果见 图4. 18 16 概4 2 0 020406080 料液比(g/mL) 图4料液比对提取的影响 Figure4Effectofsolid—bquidratio口【七0n 从图4可知随着料液比的增加,提取量出现了2个波峰, 其中最大的是料液比在1:50时的值,因此选择料液比1:50较 合适. 2.1.4回流温度对提取的影响 将样品分别在40~C,50~C,60?,70~C,80~C下保温2.5h.乙 醇浓度为60%,料液比为1:50.结果见图5.从图5可知: 4o?到80?总黄酮出现了拐点,而60?时总黄酮含量较高. 305O7O9O 温度(?) 图5回流温度对提取的影响 Figure5EffectofteI珥目mmreGI1extractian 2.2正交性实验 通过单因素实验对上述不同提取工艺参数进行了初步的 筛选,为了分析参数影响主次因素,得到最佳的提取工艺,进 行正交实验.参照单因素实验结果,以影响黄酮化合物提取 率的乙醇浓度,回流时间,料液比,回流温度为四个影响因素, 三个水平(34)进行正交实验,优选最佳提取工艺.因素水 平(3)见表1,正交实验结果见表2. 通过数理统计的极差分析法进行分析可知,级差最大的 表1因素水平表(34) Table1Faet~standard 实验水平(skIndard)总黄酮含量 为B因素,其次为D因素,再其次是A因素和c因素,说明在 异叶青兰的乙醇回流提取中,对黄酮含量影响最大的为料液 比,其次分别是提取时间,乙醇浓度和回流温度.故B因素和 D因素选2,A因素选3,c因素选1.因此乙醇回流提取异叶 青兰的最佳的提取工艺为:乙醇浓度为70%左右,提取时间为 2.5h,料液比在1:40左右,回流温度为50~C,即A3c.D2. 3结论 通过以上的单因素实验及正交实验详细探讨了异叶青兰 花优化提取工艺,结果为:乙醇浓度70%,提取时间2.5h,料液 比1:40,回流温度50?.根据实验测得的异叶青兰化的总黄 酮含量为27.4110mg/g.为减少操作误差,在每次实验中应注 意其它因素如药材粉碎度,润湿程度,记时方法及其它操作应 在相同的条件下测定.本研究建立的分光光度法用于测定异 叶青兰黄酮,方法简便,实验结果可靠,最佳条件适合批量生 产中该药材的提取. 参考文献: [1]中国科学院西北高原生物研究所.青海经济植物志[M].西宁:青海 人民出版杜,1987:484. 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