侵袭性真菌感染诊断新进展

侵袭性真菌感染诊断新进展 侵袭性真菌感染诊断进展 张 波 （中国人民解放军空军总医院呼吸内科 北京 100036） 近年来由于人口老龄化，免疫抑制剂及广谱抗生素的大量应用， 艾滋病、恶性肿瘤发病率的增加，器官、骨髓移植及介入治疗的广泛 开展，临床上侵袭性真菌感染（invasive fungal infections，IFI）的发病率呈逐年上升趋势。IFI临床 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现常无特异性，病情易被原发病掩 盖，造成漏诊、误诊而延误治疗。因此发展早期、快速且特异的IFI诊断学 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 成为临床上迫切需要解决的问题。 1 IFI常规诊断方法 1.1 组织病理学诊断方法 组织病理学检查是诊断IFI的重要方法及确诊依据。在组织 切片中找到病原真菌是确诊的“金 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ”，有真菌侵袭和相应的 炎症反应与组织损害，或组织标本真菌培养阳性即可确定真菌感 染的诊断。但组织病理学检查取材需要侵入性操作，重症患者难 以耐受，可行性差。其敏感性受到取材的影响，一次切片未必能 够找到真菌成分，且侵袭性真菌感染可引起各种各样的组织反 应，给诊断带来了较大困难。 尽管组织病理学诊断困难，但临床医生仍应尽可能努力获 得组织病理证据，这对患者的治疗和预后至关重要。因为一旦IFI 确诊，药物治疗疗程往往很长，过早停药可以导致真菌感染复发 和治疗失败。组织病理诊断需要一定的经验和技术。对具有真菌 感染高危因素者应加强无菌部位体液（如血液、脑脊液、胸腔积 液、腹腔引流液、鼻窦穿刺液等）真菌培养的检查频次，及早发 现念珠菌属感染、波散性曲霉菌属感染或其他少见真菌的波散性 感染。积极创造条件开展纤维支气管镜、超声或CT引导下经皮 穿刺检查获取组织标本进行组织培养和病理检查。纤维支气管镜 检查对曲霉菌性气管-支气管炎诊断非常有价值，支气管肺泡灌洗液中的病原微生物检查对肺部真菌病的诊断具有很强的提示 意义，对鉴别感染和非感染性疾病也有一定的参考价值，对确诊 困难的免疫功能低下者应积极开展此检查。对获取的组织标本除 常规的染色外，还应进行革兰氏染色、六胺银染色、抗酸染色等 特殊染色，以进一步显示真菌或其他少见病原感染。免疫功能低 下者组织病理检查时还应注意查找病毒包含体和原虫感染的证 据，要求病理医生和临床医生加强沟通和讨论，共同参与诊断。 1.2 直接镜检和培养 直接镜检是真菌学检查最经典的方法，具有简便、快速、实 用的优点，可以在显微镜下直接观察真菌形态，如果在无菌体液 中检测到酵母样细胞和假菌丝，则一般可诊断念珠菌感染，如果 在深部器官组织中见到具有分隔的呈锐角分支的菌丝成份，则可 首先考虑曲霉感染。但直接镜检阳性率较低，阴性结果不能排除 诊断，且同一菌属内的多种真菌镜下形态形似，对于菌种鉴定没 特别的帮助。 真菌培养可提高病原菌检出的阳性率，进一步确定菌种，还 可行体外药敏试验。对于致病性真菌，培养阳性就可确诊，如合 格痰液或支气管肺泡灌洗液直接镜检或培养新生隐球菌阳性，或 发现肺孢子菌包囊、滋养体或囊内小体即有临床意义，因为气道 内很少有隐球菌和肺孢子菌的定植。但对于条件致病菌，痰液培 养阳性不能区分污染、定植和感染，需培养多次以上阳性才有临 床意义。此外，培养检查需要结合菌落特征、生化试验等进行详 细观察，培养过程耗时长，有时需要数周的时间重复多次接种才 能得出正确结果，且敏感性和阳性率较低，不利于早期诊断。 正确 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 痰培养结果对指导临床医生诊断和治疗IFI非常重 要。痰液中念珠菌属分离率很高，而曲霉菌培养阳性率低。目前 认为痰液中念珠菌培养阳性不能作为确诊念珠菌肺炎的依据；对 痰标本中分离出曲霉菌等丝状真菌应结合患者的高危因素进行 综合判断，比如粒细胞缺乏的白血病化疗患者痰液中一旦培养出 曲霉菌则曲霉菌肺炎的可能性就非常大，而对一长期应用糖皮质 激素患者痰液中查到曲霉菌则该患者确诊为曲霉菌肺炎的几率 为20%-30%。因此，痰培养结果应结合患者的高危因素和其他 临床特征综合判断其意义。 1.3 影像学检查 尽管IFI影像学表现无特异性，但动态影像学检查对提示诊 断具有重要作用。胸部CT扫描，特别是高分辨率CT的临床应 用对早期诊断价值较高。念珠菌肺炎影像学表现与细菌性肺炎很 难区别，但血行波散性念珠菌感染肺脏的表现往往为多发性、近 胸膜下结节样影，类似菌栓形成，对诊断有一定参考价值。侵袭 性肺曲霉菌感染的影像学表现相对有特点，结节影（多为大于 1cm的大结节）伴或不伴晕征（halo sign）、楔形实变影、空洞影是早期有特征的胸部CT表现，不同基础疾病影像学表现有差 异，如血液系统恶性肿瘤化疗后粒细胞缺乏者“晕征”发生率在 80%以上，而非血液系统疾病者该征的发生率就比较低，晕征见 于约40%~69%的早期病例。但该特征性表现在曲霉菌感染患者中 很难及时发现，75%的晕征会在发病1周内消失。且接合菌、镰孢菌、放线菌、奴卡氏菌、金黄色葡萄球菌等血管侵袭性感染在 影像学上可能与侵袭性曲霉相似，所以影像学检查通常只能作为 辅助诊断手段。IFI影像学上重点应与分支杆菌/非典型分支杆菌、奴卡氏菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌等感染相鉴别，还应注 意与药物相关性肺损伤、恶性肿瘤肺转移或浸润、移植后淋巴结 增殖性疾病等非感染性疾病相鉴别。 2 IFI新的诊断方法 2.1 血清学检查 血清学诊断方法是应用免疫和生化的方法检测血清或其它 体液中的真菌细胞壁和胞质成分，主要分为抗原和抗体检查两 类。特异性抗体检测可用于诊断地方性真菌病，例如芽生菌病、 球孢子菌病、副球孢子菌病、组织胞浆菌病和青霉病。但由于IFI 多继发于严重免疫受损患者，往往缺乏可检测到的抗体，或者抗 [1]体的产生变化较大，所以检测真菌抗原成为目前的发展方向。 目前临床上最有价值者为半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）和 [2]。 （1,3）-β-D葡聚糖[（1,3）-β-D glucan, BG] 2.1.1半乳甘露聚糖的检测 半乳甘露聚糖（GM）是曲霉菌细胞壁的成分，最初是从感 染动物模型和侵袭性曲霉病患者血清中发现。当曲霉感染时，血 液及体液（尿液、脑脊液、腹水、胸水等）中的GM会显著增高。 [3]Hope WW等研究发现血清中GM在感染早期能被检测，常常 在临床症状和影像学特征出现之前，有2/3的患者在其它方法诊断侵袭性曲霉病前6~14天即可检测到GM，对高危患者连续动态监测（每周2次）具有早期诊断价值。 ELISA法是目前临床上GM检查中最敏感的方法，试剂盒 通常采用法国Bio-Rad公司的Platelia Aspergillus。大量研究发现在曲霉菌感染早期用ELISA法测定GM的敏感性和特异性存在 波动，这主要是因为观察群体及设定的阳性界值有所不同。目前 国际上对cut-off值的界定还没有统一的标准，较低的界值意味 着较高的敏感性及较低的特异性。欧洲以cut-off 1.5为阳性界值，美国FDA采用同样的试剂与方法，以cut-off 0.5为阳性界值，完成对该试验的临床评价，其特异性为89.2%，敏感性为80.7%， 批准GM实验用于临床侵袭性曲霉病的辅助诊断。同时为了防止 试验敏感性和特异性波动过大，美国FDA严格限定其目标人群 [4]为非儿童的免疫缺陷患者，标本仅为血清。最近资料表明以一份标本cut-off>0.8或者两份相关标本均cut-off>0.5为阳性界值， 所得的分析结果相近，敏感性均为96.5%，特异性分别为97.3%和98.6%，阳性预测值为93.3%和98.6%，阴性预测值为98.6%和98.4%，诊断效率为97%和98%。 GM检测取 0.5为阳性界值时敏感性增高，有利于早期诊断， 但特异性相对较差，有可能出现假阳性，主要是一些抗原物质与 单克隆抗体产生交叉反应所致。哌拉西林他唑巴坦及阿莫西林克 [5]，胃肠黏膜损伤时食物中的GM渗透进入血液，拉维酸钾的应用 胃肠外营养时营养液中的某些成分均会和单克隆抗体产生交叉 反应。此外，一些真菌，如酵母菌、青霉菌、组织胞浆菌也能与 单克隆抗体产生交叉反应。GM检测假阴性见于曲霉菌感染局限 未侵入血管、侵袭性曲霉病患者产生高滴度抗体及曲霉释放出微 量GM，也有研究证明预防性应用两性霉素B和伊曲康唑会抑制 菌丝生长，也会造成假阴性的产生。 除了血液标本检测GM外，其它体液如支气管肺泡灌洗液、 [6]尿液、脑脊液等也可检测GM，但支气管肺泡灌洗液检测GM阳性不能排除真菌定植可能，由于存在判定折点和敏感性、特异 性等问题，尚未得到美国FDA批准认可。 近年来有研究将GM试验与胸部CT结合作为IA先发治疗的起点，不仅降低了IA的病死率，同时由于提高了诊断IA的准 [7]确性，减少了过度经验性用药的毒性和费用。GM还可用于IA治疗的监测，其浓度会随着IA的进展而增加，也会随着抗真菌 [8]治疗的有效而下降。 2.1.2 （1,3）-β-D葡聚糖的检测 （1,3）-β-D葡聚糖（BG）是酵母和丝状真菌细胞壁的多聚 糖成分，原核生物、病毒和人体细胞都不存在这种多聚糖，BG作为真菌抗原具有较高的特异性。当真菌进入人体血液或深部组 织后，经中性粒细胞及吞噬细胞的处理后，BG可从细胞壁释放出来进入血液及其它体液中，我们可以检测到其中的BG水平异常升高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫可迅速清除BG。在浅部真菌感染中，BG未被释放出来，故在体液中的量不增高。 因此，它在血液及无菌体液中的存在可以很大程度上视为IFI的标志。 BG能特异性激活鲎成分中的凝血因子—G因子，此过程也称 为G试验。目前市场上常用的试剂盒有2种，一种是日本 Seikagaku Kogyo公司研制的Fungitec-G glucan试剂，一种是美 国Cape Code协会研制的Glucatell试剂。2种试剂的主要区别在 于使用不同品种的马蹄鲎为原 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ，前者使用的是中华鲎，判定 标准为20pg/ml；而后者使用的是美洲鲎，其判断标准的争议较 [9]。 多，目前推荐使用的判断标准为60pg/ml 多项研究表明，BG在IFI临床表现出现之前就已经高于正 常值，被认为是早期诊断IFI无创检测手段之一。G实验阳性对诊断真菌感染并无特异性，仍应进行其它确证实验和真菌鉴定。 [10]但是不同的真菌感染其BG值不同。Alexander等发现念珠菌感染者血清平均BG值为755pg/ml；曲霉感染者血清平均BG值 为1103pg/ml；镰刀霉感染者平均BG值为1652pg/ml。对于定植 [8][8]。研究显示BG在体内的变化与病程呈的念珠菌BG显示阴性 平行关系，连续测定BG含量对判断病情和疗效有一定意义。 G试验在临床中的应用存在一定的局限性，某些物质中存在 BG类似物，可造成假阳性结果，如中空纤维滤膜及肾透析仪的 洗涤液，纱布或棉球的实验室污染，真菌为原料制成的抗生素， 抗肿瘤药物中蘑菇聚糖、K多聚糖成分，食物中的BG通过受损胃肠黏膜入血等情况。但需要注意的是，接合菌属细胞壁不含 BG成分，隐球菌细胞壁外有荚膜包裹，不易检测到细胞壁上的 抗原，G试验呈假阴性。因此这两类真菌感染的诊断必须依赖其 它实验室手段及临床表现进一步明确。 2.2 分子生物学检查 目前，分子生物学技术的发展已经渗透到真菌研究的各个 领域，已有聚合酶链反应（PCR）扩增、分子探针、限制性酶切 片段长度多态性分析（RFLP）、DNA指纹图谱、随机扩增DNA多态性（RAPD）等方法，用于深部真菌病的诊断和分型研究， [11]形成了以PCR技术为基础的一系列分子诊断方法。Cuenca 等采用实时定量PCR对血液中曲霉菌DNA进行测定，以评价它的诊 断价值，敏感性、特异性、阳性和阴性预测值分别为：91.6%、94.4%、73.3%、98.5%。联合应用实时定量PCR和GM试验可将敏感性提高至100%，阳性预告值升至75.1%。虽然有较高的敏感性 和特异性，但操作过程易受污染，且缺乏标准化，其临床价值还 有待进一步研究。 3 结 语 IFI的诊断技术正在不断提高和发展，G试验、GM试验的 出现和分子生物学方法的完善为早期诊断提供可能，但实际在临 床上的应用仍然有限。如何有效的提高诊断水平，仍是广大临床 工作者面临的巨大挑战。 [1] 王端礼.医学真菌学实验室检验指南，第1版，人民卫生出版社， 2005：202. 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