[doc] 尿嘧啶的相干反斯托克斯Raman散射光谱研究
尿嘧啶的相干反斯托克斯Raman散射光谱
研究
第lO卷第2期
北京理工大学
JournalofBeijingInstituteofTechnologyVo1.10No.21990
尿嘧啶的相干反斯托克斯Raman
散射光谱研究干
秦文红赵东郭础
(应用物理系)
摘要采用相干反斯托克斯Ranlall散射(CARS)技术研究在不同pa值的水溶液中核
糖核酸碱基一尿嚏啶结构,所得结果揭示出尿嘧啶环的伸缩,变形振动可在1000era附
近产生一些Raman谱线,并发现这些谱线对溶液的pa值很敏感.然而这些现象在采用
目前广泛应用的激光共振Raman光谱方法时是难发现的.因此,CARS测量是一种可
研究核酸残基振动结构及其和环境介质相互作用的有效方法.脒它对样品或杂质引起的荧
光干扰有明显抑制作用外,可以预期:这一方法也可用于获得在有关
分子过程中所出现
的瞬态粒于结构的信息.
关键词相干散射,喇曼谱,尿螬}啶,环境效应/相干反斯托克斯喇曼光谱.
随着遗传工程研究的发展,在分子水平上了解有关生命活动过程微观机理已成为迫
待解决的关键问题之一,其中,建立用于确定核酸碱基等生物分子基团在溶液中的结
构状态的方法,尤其受到人们的关注.在这方面,目前广泛应用的技术是激光Raman
散射光谱方法”1.这是因为:它和通常的电子吸收,荧光光谱方法相比较,Raman光谱
谱图可在分子振动,转动运动的水平上提供有关分子结构的资料:和测量分子振动
转动状态的红外吸收光谱相比较,Raman光谱方法的应用不受样品所用溶剂的限制.然
而影响gaman光谱应用的一个致命弱点是它受被测分子本身或样品杂质所发射的荧光的
干扰,特别是在用于测量核酸,蛋白质等生物分子结构时,其Ramatl散射信号往往为
荧光所”淹没.为克服这一局限,人们在近年来试图采用其波长处于这些生物分子电子吸
收谱带范围的高功率紫外激光作为激发光源,通过电子共振增强效应而提高Ramatl散射
信号强度.实践表明,利用紫外共振Raman光谱方法虽可成功地记录一些以前难以记
录的生物分Raman谱图,但是,被测分子往往可因吸收紫外激光而发生分解失去生理
功能,从而给实验结果的解释带来一系列不确定因素.基于振动共振增强四波混频过程
现象而建立的相干反斯托克斯Raman散射光谱(通常简称CARS)技术为记录分子的
Raman光谱谱图提供了新的方法,由于其信号处于激发光的短波侧,可有效地排除样品
荧光的干扰,而且其激发波长可处于可见光波段,从而可避免样品的光化学分解等麻烦
问题.因此早在70年代,人们已开始探索利用这一非线性激光光谱方法研究在生物学上
1989年9月29日收稿
十国家自然科学基金资助项目
第2期秦文红等尿嘧啶的相干反斯托克斯Ralnari散射光谱研究25
有重要意义的样品的可能性,并成功地记录了细胞色素,维生素B以及核黄素的
Raman谱图.但是,对于CARS用于研究生物分子的潜力及其问题,尚未充分揭示.
作为发展核酸,蛋白质等生物分了:结构测量方法的一个部分,本文报导了利用
CARS技术测量核糖核酸碱基一尿嘧啶的实验结果.所得结果表明:CARS方法不仅可以
在和所用激光脉冲宽度相比拟的短暂时间间隔内记录一定波长范围的尿嘧啶谱图,而且也
可以分辨环境介质对该分子结构的影响.从而表明CARS技术可作为测量生物分子结构
的一种有效方法..
1实验部分
所用实验装置如图1所示,其中是以在Q调制条件下工作的Nd:YAG激光振荡一
放大器作为激发光源,它以每秒5次的重复频率输出波长为1064rim,脉宽为18Ils和脉
冲能量为190mJ的激光脉冲.经倍频后,一部分波长为532nlrl,能量为2lrnJ的倍频光
脉冲用于抽运溶于乙醇(浓度为45×10mo1.L『)的Rhodamine6(3染料激光,后者所
图I实验装置意幽
D一倍频晶体,PR一部分反射镜:
M一反射镜;SF,空间滤波器:
S一分束器:sc,样品弛;Dc一染料弛
L,?L:,一会聚透镜;P,,P,P一反射棱镜
,t/am
l警I2小lujpH伉木溶液中球嘧啶的电产啦收谱
,.——pH=1
——
pH=7
pH=10 ——.————
北京理工大学第10卷
输出的激光波妊范围为560.5,564nln,脉宽为15l’lS,能量为2mJ左右,另一部分波
长为532nln的光脉冲作为样品的激发光脉冲,(能量为19.2m.I)和用作为探测光脉冲m
的染料激光,以适当的夹角同时作用于被铡的尿嘧啶水溶液样品.后者在激发光和探测
光共同作用下所产生的CARS信号,经空间滤波,多色仪分光后,采用以二维象增强硅靶
(vidicon)为探测器的光学多道分析器(OMA?PARC)记录.尿嘧啶为美国Baker公司商
品化学试剂,使用前未作进一步纯化处理,样品溶液用两次蒸溜水配
制,其中尿嘧啶浓度为
l×10I3moI.
L?溶液的pH值用滴加0-lN的HC1或NaOH标准溶液调制,在不同pH
值水溶液中的尿嘧啶的电子吸收谱图在图2中示出.
2实验结果及讨论
在pH值不同的尿嘧啶水溶液中进行实验所记录的谱图在图3中示出.由图可见,该
谱图由叠加在宽带背景上的一组尖峰所组成,但谱带位置随所用溶液的pH值增大而向低
2/nm
幽3不同pH值水藩渡中尿嘧啶的CARS谱豳
注:其中箭头所指峰的频率位置为方便探讨已列于附表中
1——相对强度(10趺记录平均结果)
频侧偏移,而且各尖峰结构的强度分布也因溶液pH值不同而有差异.
为对各尖峰的来源进行归属,我们在附表中列出各尖峰的峰值频率.用作参考的尿嘧啶
在固体状态及不同pH值水溶液中的已知Raman谱线位置’也在该表中同时列出.通过
和尿嘧啶的已知Raman频率相比较,可以将l000cnl_.附近的3条谱线归属为嘧啶环的伸
缩(V)和变形(6)平面振动模(图4).而在酸性(pH=l>和中性(pH=7)
溶液中观察列的
l062crfl和l059crfl谱线,参照氘化尿嘧啶的N—D变形振动频率可归属为N—H
变形振动模.宽带背景则可认为是双光子共振四波混频光信号所致(图2).在激发光频率
的2倍处于分子的电子吸收谱带范围内的条件下,出现这种双光子共振四波混频信号的可
能性已在找们研究甲基毗啶的四波混频实验中得到证实.但对在酸性和中性水溶液中尿嘧
第2斯秦文红等:屎嘧啶的相干反斯托克斯Raman散射光谱研究27
附表实验结果比较与归属
宴验结果前人实验所获Raman和红外谱’
实剥CARS信号/Jim(一?Vcm
505-8
50525054
5051
50485049
504.5
974
5062996990
1000
5o57101410o9
1024
504:3505.2
5048
504
504
791(5)788(7)788(6)798(10)781(W)
933(m
958987’I)995(1
034998
.
1014?
1027
1043
503.5503610621059
50245026503-71105109810561105(2)I105(】)
TPA
003(W)v,振动
TPA
009(W)v振动
TPA
TPA
TPA
TPA
N-H变形振动
振动
注:TPA为双光共振四渡混频:
括号中数据为相对强度,W为弱.m为中等.
啶在1034cm和998cm..处的强谱线以及一些其它的谱线我们目前还无法作出解释,
然而不能排除这种可能性:即一些强度较弱的毛刺是由于宽频带染料激光的尖峰结构
所引起.
图4嘧啶环的忡缩(v)和变形()平面振动模
由表中所列各CARS谱线可以看出一个有趣的事实,即所有和环伸缩,变形振动有关
的谱线,均随溶液的pH值增大而向低频方向移动,特别是pH值大于7的碱性溶液中这
一
偏移尤为显着.出现这种偏移的原因可能是由于尿嘧啶在pH值不同的水溶液中具有
不同形态所致.当嘧啶环上羰氧基的氧原子氮原子和氢结合时,环中的电于的定域
))27
911
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化趋势增强,从而环振动频率增高,在相反的情况下,当在碱性溶液中被去质子化时,
环上的电子的非定域化趋势增大,环的振动频率向低频方向移动.如果1062cln的
谱线可归属于N—H变形振动的话,尿嘧啶在碱性溶液中这一谱线消失的事实,也可作为
上述推论的一个支持.此外这些Raman谱线的偏移,也和尿嘧啶的一电子吸收谱带
随m{值增大而明显地红移的事实(图2)相一致.在用一般激光Raman光谱方法所得谱
线中,难以看到这一趋势的原因(参阅附表)很可能是由于这些谱线的强度很弱,难以
对其频率精确测量之故
3结论
基于上述实验结果和讨论可以认为:CARS技术不仅可以成功地记录核酸残基的
Rarnall谱线并揭示环境对其结构的影响,而且一些用一般激光Ranlan光谱方法难以准确
测量其频率的Raman谱线,可望用CARS方法(因其有较高灵敏度)
对它们进行精确地
测量如果注意到在我们的CARS方法中,是用宽带染料激光作为探测光束,故尿嘧啶
在一定波长范围内的RalTlan谱图是在单次脉冲作用下取得的,因此可望以和激光脉冲宽
度相比拟的时间分辨率方便地记录分子结构随时间的变化,这对于了解生物体遗传作用和
微观机理是很有吸引力的.不过应注意到,正象我们已在讨论中所看到的那样,虽然可
望通过双光子共振四波混频可能研究溶液中分子的双光子吸收过程,但由于它使CARS
谱图测量结果解释复杂化,所以在使用这一方法研究核酸残基的结构,构型和取向时,
正确地选择所用激发光的波长是十分必要的.
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,
第2期秦文红等:尿嘧啶的相干反斯托克斯Raman散射光谱研究29
StudyonCoherentAnti—-StokesRaman
Spec~aofUracil
QinWvnhongZhaoDongGuoChu
AbstractCurrentinterestinthemolecularmoehanismofneengineeringplaces
greatimportanceonthestructuralprongofnucleicacids.Inthispaperpreli—
minarystudyO11thestn埘
urofuracil,abaseresidueofRNA,inaq1JI~BSsolU—
tionsofdifferentpHvaluesbycoherentanti—StokesRamanscattering(CAR
S)is
reported.reSultsobtainedrevealRaman】
inesassociatedwiththestretchingand
bendingvibrationmodesoftheuracilringaround1O0ocm,.ItiSalSOfound
that
theseSan-lanlinesaresensitivetoDHofthesolutionsused.Al】thesefindings,
however,arediffaculttobeobse~dbylaserresonan~~Ralllanspectroscq~which
isusedwidelyinpracticeatpr~sent.Therefore,weconcludethatCARSmeasurc—
mentseemstobeapowerfifltoolcapableofO~’lngstructuralspecificityassociated
订
ithmolecularvibrational}equenciesofbaseresiduesofnucleicacidsandtheir
interactionwiththesurroundingmedia.Inadditiontoa啦面
?ntsuppressionof
interfereueefromfluorescenceeitherintrinsictothesampleorcau,~dby~purities,
thisapproimhisexpectedt0beabletoprovidestructuralinformationoftransient
speciesduringrelavantmolocularprocesses.
Keywoodscoherentscattering,Ramanspectra
anti—StokesRamanspectra.
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