毛细管区带电泳检测磷霉素的杂质谱

毛细管区带电泳检测磷霉素的杂质谱 中国抗生素杂志2011年10月第36卷第10期765 文章编号:1001—8689(2011)10—0765—07 毛细管区带电泳检测磷霉素的杂质谱 刘浩刘畅 (上海市食品药品检验所,上海201203) 摘要:目的采用毛细管区带电泳(CZE)一间接紫外检测技术检测磷霉素的杂质谱. 方法在CZE系统中采用同时含阳离子 探针和阴离子探针的背景电解质,分别为无光吸收特征的阳离子组分和阴离子组 分提供背景吸收并同时检测和筛查,以便得到 磷霉素较为完整的杂质谱;为证实分离系统的专属性和有效性,分别采用杂质对照 品,半制备HPLC.~[1梯度洗脱HPLC.电喷雾 离子阱质谱对杂质谱中的主要杂质进行了确认.结果采用该方法可将国外药典的 HPLC系统难以分离的杂质与磷霉素分离, 可从磷霉素的粗品中可分离出7个己知杂质和至少19个未知杂质,可检测在 HPLC系统中难以检测的磷霉素的强保留杂质.结论 该方法可应用于磷霉素的杂质谱检测. 关键词:毛细管区带电泳;杂质谱;磷霉素 中图分类号:0657.7,R978.11文章标识码:A Impurityprofilingoffosfomycinbycapillaryzoneelectr0ph0resis LiuHaoandLiuChang (ShanghaiInstituteforFoodandDrugControl,Shanghai201203) Abstract0biectiveAcapillaryzoneelectroDhoresis(CZE)methodwasestablishedtodetectt heimpurity profileoflosfomycin.MethodsInordertoobtainfu11impurityprofile,abackgroundelectrol ytecontainingbothan anionicprobeandacationicprobeinaCZEsystemwasusedtosimultaneouslydetectanionici onsandcationicions possessingnochromophoreinfosfomycin.Impurityreferencestandards,semi-preparativeHPLC,andgradientHPLC elec~osprayiontrapmassspectrometrywereusedtoconfirmtheselectivityandvalidityoftheseparationsystem. ResultsUsingthenovelmethod.7knownimpuritiesandatleast19unknownimpuritiescouldbeseparatedfroma rawsample,whilethepharmacopeiaHPLCmethodmightbedifficulttoseparatemostoftheseimpurities,especially forthes~ongretainedimpurities.ConclusionThismethodcanbeusedfortheimpurityprofilingoffosfomycin. KevwordsCapillaryzoneelectrophoresis;Impurityprofile;Fosfomycin 磷霉素是中国卫生部发布的"产NDM.1泛耐药 肠杆菌科细菌感染诊疗指南(试行版)"建议的治疗 超级细菌感染的6种非B一内酰胺抗菌药物之一.该药 的不良反应发生率为10%,17%.近年来,随着临床 应用范围的扩大,其不良反应呈增多趋势,且有些 反应较为严重,以过敏性休克及过敏性休克而致死 亡的报道居多.在抗感染药致过敏性休克中,与磷 霉素有关的发生率居第4位[1-31.已知抗生素中存在的 高分子杂质(聚合物)可引发过敏反应【],其他杂质如 工艺杂质和降解产物等也有可能导致不良反应的发 生.因此,磷霉素的杂质谱检测在药品的质量控制 中是非常必要的. 磷霉素的亲水性较强且无光吸收特征,较难采 用一般的分离分析方法控制其质量.现行英国药典 收稿日期:2011-02—10 作者简介:刘浩,男,生~:1968年,博士,主任药师,主要从事药物分析研 究.E-mail:liuhao1968@hotmail.tom 刘畅,ecchangchang@hotmail.corn 毛细管区带电泳检测磷霉素的杂质谱刘浩等 采用氨基柱.HPLC.示差折光检测磷霉素氨丁三醇的 杂质包括4个已知杂质:杂质A(磷霉素二醇物1,杂 质B,杂质C和杂质D[.该系统所用流动相含有较高 浓度的无机盐,且该检测器的平衡所需时间较长, 导致稳定性较差的氨基柱可能在色谱系统完全平衡 前即已损坏并降低分离能力;该检测器的灵敏度较 低,因而样品溶液的浓度高达0.12g/mL,致使有关 物质之间的分离较差,且可能有杂质包括副产物, 降解产物,聚合物和中问体如顺丙烯磷酸(图1)等未 彼分离并检测;该方法未采用梯度洗脱,示差折光 检测器也不适用于梯度洗脱,故可能有强保留的杂 质未被检测出. 磷霉素的杂质检测也可采用离子对HPLC一蒸发 光散射检测(ELSD)技术[6].但采用梯度洗脱时基线 波动较大,强保留的杂质峰叠加在波动的基线上, 难以识别和检测.将流动相中乙腈的浓度增加至约 30%即可将强保留的杂质全部洗脱,唯杂质之间的 分离较差;注射用磷霉素钠中添加的枸橼酸与个别 未知杂质难以分离. 采用梯度洗脱离子对HPLC一电喷雾离子阱质谱 (ESI—MS)实验发现,无论怎样优化色谱系统,始终 有一未见报道的杂质与磷霉素同时洗脱,根据多级 质谱图推断其可能为磷霉素与磷霉素二醇物聚合物 (暂命名为杂质E,图1)[71.显然,如不能对该杂质进 行有效的控制可能会引发过敏反应. H CH30CH3 磷霉素的检测还可采用HPLC.间接紫外检测和 毛细管区带电泳(CZE)一间接紫外检测】.但未见有 采用该类方法检测磷霉素杂质的报道. 根据磷霉素的合成工艺和结构特征,本品中还 能含有其他杂质,优化后的HPLC—ELSD实验也证 实尚有一些难以分离的未知杂质,而上述HPLC.ESI— MS系统的检测灵敏度较低,故这些潜在的杂质未被 检测出.鉴于目前HPLC技术难以对磷霉素及其杂质 进行有效的分离分析,本课题采用新设计的CZE一间 接紫外检测系统分离磷霉素及其杂质;方法建立过 中为证实分离系统的专属性和有效性,分别采用 杂质对照品,半制备HPLC等技术和HPLC—ESI—MS对 杂质谱中的主要杂质进行了确认. 1仪器与试药 AgilentG1600AX型毛细管电泳仪,配置光电 二极管阵列检测器;Agilent1lO0型高效液相色普 仪;Agilent6330型质谱仪,配置电喷雾离子源和离 子阱质谱检测器;Agilent11O0型示差折光检测器; Alltech2000型蒸发光散射检测器.CZE计算机模拟 软件Peakmaster5.2(CharlesUniversity,布拉格,捷 克共和国). 顺丙烯磷酸和磷霉素氨丁三醇粗品:东北制药 总厂;磷霉素氨丁三醇市售品:山西博康制药有限 公司;注射用磷霉素钠市售品:哈药集团三精药业 有限公司;磷霉素二醇物对照品,磷霉素氨丁三醇 对照品;欧洲药典委员会.正辛胺(99%1:Aldrich, 分析纯;乙腈:Merck,梯度级;邻苯:二甲酸 f?99.5%,T),山梨酸:(?99%,T),十六烷基? 甲基溴化铵(CTAB),苄胺(?99.5%,GC):Fluka; 双(2.羟乙基)氨基.三羟甲基甲烷(Bis—Tris,>98%, T1:SIGMA;氨丁三醇(Tris),二甲亚砜,尤水甲 酸,冰醋酸:分析纯;水:MilliporeMilliQGradient A10纯水仪制备. 2实验条件 2.1CZE条件 对磷霉素中可解离的有关物质的筛查:非涂层弹 性石英毛细管(50gmi.d.,柱长为48.5cm,有效柱长 为40cm,河北永年锐沣色谱器件有限公司);背景电 解质(BGE):10mmol/L山梨酸溶液(用lmol/L苄胺溶 液调节pH值分别为4.6,5.4,5.7,6.2~[16.7);操作电 压:30kV;分析过程中于进样端持续加压25mbar; 毛细管温度:20?;检测波长:225nm(参比波长: off);进样方法:进样端加压,25mbar,3s.样品溶 液:磷霉素氨丁三醇粗品的水溶液(2mg/mL). 磷霉素杂质谱的检测:非涂层弹性石英毛细管 75gmi.d.,柱长为96.5或112.5cm,相应的有效柱长 ( 分别为88和104cm,河北永年锐沣色谱器件有限公 司);背景电解质(BGE):用于检测淌度大于磷霉素 的杂质:含0.2mmol/LCTAB的10mmol/L~苯二甲 酸溶液(用Bis—Tris调节pH值为5.6);用于检测淌度小 于磷霉素的杂质:含0.2mmol/LCTAB的l0mmol/Lj 梨酸溶液(用Bis.Tris调节pH值为5.6);操作电:. 30kV;毛细管温度:20?;检测波长:225nm(参 比波长:oft);杂质定量时检测波长:320nm(参比 波长:225nm,可使检测到的峰形为正峰以便于积 中国抗生素杂志2011年10月第36卷第10期 分1;进样方法:进样端加压,25mbar,6s(检测淌 度大于磷霉素的杂质),或25mbar,3s(检测淌度小 于磷霉素的杂质].两次进样中间用BGE冲洗毛细管 3min.样品溶液:含供试品约5mg/mL的水溶液. 2.2半制备HPLC条件 色谱柱:Synergi4gFusion-RP80A(250rnm× 4.6mm,4gm);流动相:用于检测保留值小于磷霉 素的杂质:5mmol/L~辛胺溶液(用无水甲酸调节pH 值至5.2)一乙腈(90:10);用于检测保留值大于磷霉素的 杂质:5mmol/L~辛胺溶液(用无水甲酸调节pH值至 5.2)一乙腈(72:28);流速:1.5mL/min;柱温:35?; 进样体积:20;采用分流模式;雾化气:空气;蒸 发温度:5O?;雾化气流速:0.9L/min.半制备时,断 开色谱柱与检测器之间的连接,根据此前分析所得 色谱图中各组分的保留时间,在各组分的保留时间 点前约0.5min时开始收集洗脱液约1.5mL至收集小瓶 并再次进样分析(进样体积为50~tL)以确认杂质溶液制 备的成功.再将含杂质的洗脱液用HPLC—ESI—MS分 析确认杂质的结构[7].样品溶液:磷霉素氨丁三醇粗 品的水溶液(20mg/mL). 3结果与讨论 3.1半制备HPLC的结果 如采用HPLC—ELSD系统[61分析磷霉素氨丁三 醇粗品并收集含目标杂质的洗脱液进行CZE分析, 则因醋酸根与磷霉素的淌度接近而与磷霉素难以分 离,且洗脱液中醋酸根的浓度较高可在该CZE系统 中可产生去堆积效应,致使目标杂质在CZE过程中 展宽而难以检测.将流动相中的正辛胺浓度减为 5mmol/L,并改用无水甲酸调节流动相的pH值,进 样分析所得色谱图与原系统[6]所得色谱图类似, 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明分离选择性未发生改变,唯各组分的保留值稍 减少,且流动相的缓冲容量较低.在CZE系统中, 甲酸根的淌度显着低于磷霉素及其杂质的淌度且浓 度较低,可减少由甲酸根所引起的去堆积效应,增 加目标杂质的检测灵敏度.将含杂质的洗脱液用 HPLC—ESI—MS['】分析证实分离选择性并未因流动相 的微调而发生改变.强保留的未知杂质因含量较低 且在HPLC.ESI.MS系统中相互间的分离较差而未能 确证其结构. 3.2CZE系统的建立与优化 3.2.1对磷霉素中可解离的杂质的筛查 根据化合物的结构式,在酸性BGE中,磷霉素 氨丁三醇中可能存在的杂质如磷霉素二醇物与两分 子Tris聚合形成的磷酸酯以及Tris等均荷正电,在 CZE系统中向阴极(进样端)迁移,无法检测;而磷霉 素或磷霉素二醇物与Tris聚合形成的磷酸酯,杂质B 和杂质c等均呈近电中性,无法产生电迁移,虽可为 电渗流(EOF)所驱动但无法分离并检测. 为考察是否存在上述杂质,拟采用同时含阳离 子探针和阴离子探针的BGE,分别为无光吸收特征 的阳离子组分和阴离子组分提供背景吸收,调节两 种探针试剂的浓度比以得到不同pH值的BGE,使 在酸性BGE中呈电中性的杂质可在近中性的BGE中 解离并荷负电,从而产生电迁移并被检测.在该 CZE系统中,进样端为阳极,荷正电化合物向阴极 迁移,与EOF的迁移方向相同,最先出现在检测窗 中;而磷霉素及其杂质等荷负电化合物向阳极f进样 端)迁移,与EOF的迁移方向相反,但其迁移速率小 于EOF的迁移速率,故最终也会出现在检测窗中, 淌度小者最先被检测到;因淌度大的磷霉素杂质迁 移时间过长,为此,在分析过程中于进样端适当加 压(压力辅助一CZE),以驱动该类杂质加速迁移. 采用Peakmaster5.2软件设计CZE系统并经实验 优化,最终确立的BGE为:10mmol/L山梨酸溶液f用 lmol/L苄胺溶液调节pH值分别为4.6,5.4,5.7,6.2~H 6.7).山梨酸根(pKa4.77)~I苄铵(pKa9.33)分别为无光 吸收特征的阳离子组分和阴离子组分提供背景吸收. 结果(图2,3)显示,随着BGE的pH值增加,除 Tris外,并无其他荷正电杂质(迁移速度大于EOF)~ 现在电泳图中;pH值为5.4时,有一较大的杂质白 EOF中分离出来并在EOF之后迁移;随着pH值的增 加,该杂质与EOF的分离度增加,提示该杂质在酸 性溶液中呈电中性并随着pH值的增加而逐渐解离并 荷负电;该杂质与杂质B的迁移时间相同;随着pH 值的进一步增加,再无新的杂质出现在电泳图中; pH6.7时,磷霉素二醇物区带展宽,磷霉素区带发生 裂分,淌度大于磷霉素的杂质区带显着展宽;磷霉 素氨丁三醇粗品中含有大量杂质,这些杂质之间的 淌度差异较大,如选用与磷霉素和磷霉素二醇物淌 度接近的山梨酸根作探针离子,则淌度小于磷霉素 的杂质之间分离较好且峰形较佳,而淌度大于磷霉 素的杂质之间分离较差且区带展宽以致检测灵敏度 降低,提示不宜采用一套CZE系统同时分离所有杂 质,淌度大于磷霉素的杂质的测定宜另选用含高淌 度探针离子的BGE. 3.2.2淌度小于磷霉素的杂质的分析 毛细管区带电泳检测磷霉素的杂质谱刘浩等 2' 一 . 5 ,一,一 2 ,一,,/ 13 4;一 Vnr~n A:pH4.6:B:pH5.4:C:pH5.7 j:Tris+:2:EOF;3:杂质B;4:磷霉素二醇物;5:磷霉索 图2磷霉素氨丁三醇粗品溶液的叠加电泳图 Fig.2Overlaidelectropherogramsofrawfosfomycin trometamolsolutions 一 ,一—— 05lOl520 t/min A:pH6.7:B:pH6.2 1:Tris;2:EOF;3:杂质B;4:磷霉素二醇物;5:磷霉素 图3瞵霉素氨三醇粗品溶液的叠加电泳图 Fig.3Overlaidelectropherogramsofrawfosfomycin trometamolsolutions 选择淌度与磷霉素?醇物接近的山梨酸根作探 针离子,磷霉素二醇物的峰形对称;与山梨酸根淌 度差异较大的磷霉素以及其他杂质则因电迁移扩散 (EMD)而带展宽,检测灵敏度降低;淌度差异越 人,组分区带的展宽越严重,检测灵敏度也越低. BGE的pH值在5.4,5.8范围内可使各组分之间得到 仃效的分离.用Bis—Tris(pKa6.4)调节BGE的pH值可 保证有足够的缓冲容量,可确保探针离子的浓度和 BGE的pH值在电泳过程中不会因电解反应的发生 改变…1,被测组分的迁移时间和峰面积均能得到 较好的蘑现.已有大量的实验证实,毛细管的表面 形态町随着CZE的运行而逐渐发生细微的变化并导 致EOF迁移速率的改变.尤其是采用微酸性至中性 (pH4,7)的BGE时,EOF迁移速率的不稳定可使组 分迁移时间的重现性较差ll2].为此,在BGE中添加 0.2mmol/L的CTAB,CTA动态吸附在毛细管表面使 毛细管表面荷正电,EOF的迁移方向发生逆转并向 阳极迁移,EOF的迁移速率较稳定且与荷负电的磷 索及其杂质的迁移方向相同,故磷霉素及其杂质 的迁移时间的重现性较好.取磷霉素氨丁三醇粗品 溶液连续进样分析,磷霉素,顺丙烯磷酸,磷霉素 二醇物,杂质E,杂质D和杂质B的迁移时间的相对 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 偏差(RSD)分别为0.7%,0.8%,0.6%,0.8%, 1.0%和1.1%(=6).选择225nm处检测,磷霉素及其 杂质的信噪比最高. 取磷霉素氨丁三醇粗品溶液进样分析(毛细管长 112.5cm),可分离出9个淌度小于磷霉素的杂质(图 4B),其中2个杂质分别为顺丙烯磷酸和磷霉素二醇 物.因HPLC~备的杂质溶液中含有较高浓度的正辛 铵,甲酸根和乙腈,CZE过程中会导致组分迁移时 间的改变和杂质的误认,而且相邻杂质也较多,故 采用在样品溶液中添加经HPLC—ESI—MS确认的杂质 溶液后再进样分析,并与样品溶液,杂质溶液和流 动相的电泳图进行比较,确认另Pb3个杂质分别为: 杂质E,杂质D,杂质B*U杂质C. 因顺丙烯磷酸紧邻磷霉素迁移,故可通过在样 品液中添加适量顺丙烯磷酸的方式来考察系统的适 用性.如无顺丙烯磷酸,也可以0.1mol/L盐酸溶液 为溶剂配制成5mg/mL的样品溶液,再于室温放置 10min,即可产生足量的磷霉素二醇物供系统适用性 考察(图4A). 在色谱和电泳等分离检测系统中应用紫外检测 器,组分的响应值如峰面积与组分的浓度(进样量) 和组分的转换因子(conversionfactor)l~P摩尔吸收值相 关并呈线性关系【.在CE系统中,组分的峰面积l还 与迁移时间相关.迁移时间短的组分通过检测窗的 速率快,峰面积相对较小,故CE定量一般采用校正 峰面积,即峰面积/迁移时间.如在CZE系统中采用 间接紫外检测模式测定无光吸收特征的组分,则所 A - 2 一 l 3845 卜 l6 1 1012l416l8 t/min A:系统适用性试验溶液;B:磷霉索氨j'一醇粗品 1:磷霉素;2:磷霉素二醇物:3:杂质E;4:杂质D: 5:杂质C;6:杂质B;7:顺丙烯磷酸;8:未知杂质 图4样品溶液的叠加电泳图 Fig.4Overlaidelectropherogramsofsamplesolutions 一 , , , .5 . ,- }.3 rl—c 中国抗生素杂志2011年10月第36卷第10期 有组分的校正峰面积仅与具有紫外吸收的探针离子 f通常情况下也是同离子)和组分的浓度相关.因此, 组分的定量测定并不需要具备每一个组分的对照溶 液,只要样品溶液中含有一种已知浓度的标准物质 并已知该组分和标准物质的转换因子即可.而组分 的转换因子又与其替换LL(transferratio)相关.后者 系指CZE过程中一摩尔组分替代的具有紫外吸收的 探针离子的摩尔数『14.s】.组分的峰面积,浓度,转 换因子和替换比等之间关系的详细的推论过程见文 献[13].如标准物质和组分的淌度差异较小(如5%)并 接近反离子淌度的绝对值,则其替换比的差异约为 2%,可采用校正峰面积归一化法进行计算.如迁移 时间相差1.5倍以上,则采用校正峰面积归一化法测 得结果可能与对照品对照法的测定结果相差30%[16]. 在本文的系统中,磷霉素二醇物的峰形对称, 即EMD较小,表明探针离子(山梨酸根)与磷霉素二 醇物的淌度几乎相同.而且,磷霉素二醇物与邻近 组分包括磷霉素,顺丙烯磷酸和杂质E的淌度差异 较小.用Peakmaster5.2软件计算得山梨酸根与反 离子(Bis—Tris)的淌度分别为27×10—9m2V-1S.1和 20×10.9m2V-1s.1.因此,对磷霉素二醇物及其附近 迁移的杂质如顺丙烯磷酸和杂质E等的检测既可采用 磷霉素对照品作自身对照,也可采用校正峰面积归 一 化法.但对于与磷霉素二醇物迁移时间差异较大 的杂质如杂质D,杂质C和杂质B(迁移时间相差近1.5 倍)等的检测可能误差稍大. 取磷霉素氨丁三醇对照品配制浓度分别为5, 7.5,25,37.5,50,75和100~g/mL的系列溶液f相当 于样品中杂质的含量为0.1%,2.O%)进样分析,以磷 霉素的峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,进行线性 回归,线性相关系数为0.9990.取浓度为50~g/mL的 对照品溶液(相当于杂质含量为1.0%)连续进样分析6 次,磷霉素峰面积的RSD为3.1%(,2=6).本方法的定量 限按磷霉素峰信噪LLIO:l计为5~g/rnL(相当于杂质含量 为0.1%),检测限按信噪比3:1计为1.51xg/mL(~H当于杂 质含量为0.03%).增加进样体积可降低检测限,但磷 霉素可能与紧邻的顺丙烯磷酸难以分离而使后者无 法检测. 取磷霉素氨丁三醇市售品配制成6份溶液,分 别进样分析,按校正峰面积归一化法计算,磷霉素 氨丁三醇市售品中测得的顺丙烯磷酸,磷霉素二 醇物和杂质E的含量平均值依次为0.06%,0.29%和 0.49%,相应的RSD依次为4.1%,3.7%和3.1%=6) (图5A,毛细管长96.5cm). 按校正峰面积归一化法计算,磷霉素氨丁三醇 对照品中检出的顺丙烯磷酸和磷霉素二醇物的含量 依次为0.18%~H0.24%,但未检出杂质E(图5B);注 射用磷霉素钠市售品中检出的顺丙烯磷酸,磷霉素 二醇物和一个未知杂质的含量依次为0.44%,0.22% 和0.19%,但未检出杂质E(图5c),该未知杂质与来 源于顺丙烯磷酸的一个未知杂质的迁移时间相同. 显然,因HPLC法无法分离并控制顺丙烯磷酸,造成 磷霉素氨丁三醇对照品和注射用磷霉素钠市售品含 有较高含量的顺丙烯磷酸,使得对照品的含量标示 值偏高和注射用磷霉素钠市售品存在安全隐患. 取HPLC保留值大于磷霉素的杂质洗脱液进样分 析,确认这些杂质多在磷霉素之前迁移(图5D). 紧邻杂质D之前迁移的一较大的未知杂质(图4B 在HPLC.ELSD系统~HHPLC—ESI—MS系统中均未能检 出,HPLC~IJ备的杂质溶液的电泳图中也未出现该杂 质区带.该杂质的结构确认可能需采用CE—MS联用 技术. 910ll12 t/rain A:磷霉素氨丁三醇市售品;B:磷霉素氨丁三醇对照品 c:注射用磷霉素钠市售品;D:保留值大于磷霉素的杂质的洗脱液 1.磷霉素;2.顺丙烯磷酸;3.磷霉素二醇物;4.杂质E; 5.未知杂质;6.甲酸根 图5样品溶液的叠加电泳图 Fig.5Overlaidelectropherogramsofsamplesolutions 3.2_3淌度大于磷霉素的杂质的分析 采用与磷霉素和磷霉素二醇物淌度接近的山梨 酸根作探针离子时,淌度大于磷霉素的杂质之间分 离较差且区带展宽以致检测灵敏度降低,此外,磷 霉素氨丁三醇市售品中淌度大于磷霉素的杂质含量 较低较难检出.为此,拟采用瞬间等速电泳(t.ITP) 技术富集杂质以增加检测灵敏度.在t.ITP过程中, 微量的被测离子根据科尔劳施调节功~(Kohlrausch regulationfunction)以浓缩的区带的形式夹在高淌度 离子(前导离子)区带和低淌度离子(终止离子)区带之 间迁移,直至进入CZE分离模式[17-18】. 磷霉素样品溶液中含有可作为终止离子的低 770毛细管区带电泳检测磷霉素的杂质谱刘浩等 淌度离子——磷霉素,不含可作为前导离子的高淌 度离子.考虑到CZE一间接紫外检测系统宜简单化 以避免系统区带的产生,故拟选用一种高淌度的 探针离子同时兼作前导离子,在毛细管前端构建 终止型t—ITP体系.经研究,拟选用邻苯二甲酸根 (pKa5.41,2.95)为探针离子,用Bis.Tris调节BGE 的pH值在5.4-5.82_问,在BGE中添加0.2mmol/L CTAB,可使各组分之间得到有效的分离,磷霉素及 其杂质的迁移时间的重现性较好. 已知t—ITP体系中堆积效应会随着前导离子浓度 的增加而增强,故本文系统中探针离子浓度增加可 增强堆积效应并相应地使供试品溶液的进样体积增 加.但探针离子浓度的增加是有限的,因BGE的背 景吸收不能超出紫外检测器的线性范围.按文献方 法[19]进行试验,浓度为20mmol/L时,背景吸收开始 偏离检测线性范围.浓度为15mmol/L时,基线噪 声会显着增加,故最终选择为10mmol/L.检测波长 越低,吸收值越大,但基线噪声也相应增加,选择 225nm处检测,磷霉素及其杂质的信噪比最高. 进样端加压(25mbar)8s时,因进样量较大,无法 分离出磷霉素之前迁移的一个未知杂质,进样时间 降为6s时可将该杂质分离出.与采用山梨酸作探针离 子相比,进样体积增加了1倍.取磷霉素氨丁三醇粗 品溶液进样分析,可分离出至少15个淌度大于磷霉素 的杂质(图6C,毛细管长112.5cm),其中一个杂质为 H,PO一.样品溶液中高浓度的磷霉素产生的去堆积效 应,可使淌度小于磷霉素的磷霉素二醇物等杂质峰展 宽甚至变形,检测灵敏度降低并难以检测. 取磷霉素氨丁三醇对照品配制浓度分别为5, 7.5,25,37.5,50,75和100pg/mL的系列溶液f相当 于杂质的含量为0.1%,2.0%)进样分析,以磷霉素的 峰面积比为纵坐标,磷霉素浓度为横坐标,进行线性 回归,线性相关系数为0.9991.取浓度为50pg/mL的 对照品溶液(相当于杂质的含量为1.0%)连续进样分析6 次,磷霉素峰面积的RSD为3.3%:6).本方法的定量 限按磷霉素峰信噪比10:l计为5pg/mL(相当于杂质含 量为0.1%),检测限按信噪Lg3:1计为1.5g/mL(相当 于杂质含量为0.03%).因磷霉素与探针离子的淌度 差异较大,使得磷霉素峰因EMD而展宽,如以磷霉 素作自身对照会低估本方法的检测灵敏度,但实际 上淌度大于磷霉素的杂质与探针离子的淌度差异较 小,杂质峰形尖锐,故实际检测灵敏度更高. 取注射用磷霉素钠市售品溶液连续进样分析, H,PO4-的迁移时间的RSD为0.5%(,z=6).取磷霉素氨 丁三醇市售品配制成6份溶液,分别进样分析,按校 正峰面积归一化法计算,注射用磷霉素钠市售品中 淌度大于磷霉素的杂质总量的平均值为0.98%,RSD 为3.1%(=6)(图6A). 按校正峰面积归一化法计算,磷霉素氨丁二三 醇市售品中淌度大于磷霉素的杂质总量为0.52%(图 6B);磷霉素氨丁三醇对照品中淌度大于磷霉素的杂 -2倍可检出微量 质总量为0.35%,将进样体积增加1 H,PO..注射用磷霉素钠市售品和磷霉素氨丁三醇市 售品中也均含磷酸根(图6A,图6B). 郴t—— /一一 ,——-——/ 99.5l0l0.5ll11.5I2 t/min A:注射用磷霉素钠市售品;B:磷霉素氨丁三醇市售品 C:磷霉素氨丁三醇粗品 1:磷霉素;2:磷霉素二醇物;3:H2P0d 图6样品溶液的电泳图 Fig.6Overlaidelectropherogramsofsamplesolutions 取HPLC保留值大于磷霉素的杂质洗脱液进样分 析并与磷霉素氨丁三醇粗品溶液和流动相的电泳图 进行比较,进一步确认HPLC保留值大于磷霉素的杂 质多在磷霉素之前迁移.英国药典方法缺乏对这些 强保留杂质的认知和控制可能会造成临床的安全隐 患和对照品含量标示值的偏高. 取HPLC保留值小于磷霉素的杂质的洗脱液进样 分析并与磷霉素氨丁三醇粗品溶液的电泳图进行比 较,确认HPLC保留值小于磷霉素的杂质均在磷霉素 之后迁移. 取注射用磷霉素钠市售品的水溶液进样分析并 与磷霉素氨丁三醇粗品溶液的电泳图进行比较,确 认注射用磷霉素钠中添加的枸橼酸根在所有有关物 质之前迁移,不影响有关物质的检查. 参考文献 『1]凌静,冯友根,赵莉丽.磷霉素钠不良反应分析[J].中国现 代应用药学杂志,2005,22(7):604—606. 『2]王艳宁,钟慧.1994年.2004年磷霉素致过敏性休克文献 分析[J].中国药房2006,17(6):452—453. 『31杨丽杰,李晓盟,郭美华.磷霉素钠注射液148例不良反 中国抗生素杂志2011年10月第36卷第10期771 【4] [5] 【6] [7】 [8】 [9] [10] 应文献分析[J].中国临床药理学与治疗学,2008,13(3): 320—322. 胡昌勤.抗菌药中高分子杂质的特性及抗菌药过敏反应 (上)[J].中国药师,2006,9(3):238—240. 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