RACE技术的原理和操作

RACE技术的原理和操作 RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。 cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。 完整的cDNA序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。 末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。 编辑本段优点 与筛库法相比较，有许多方面的优点 1)此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。 2)节约了实验所花费的经费和时间。 3)只要引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。 实验室现有的RACE试剂盒的简介 ?RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。 ?使用此方法的要求是必须知道至少23,28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物(GSPs)。 编辑本段引物的设计 基因特异性引物(GSPs)应该是: ?23,28nt ?50,70,GC ?Tm值?65度，Tm值?70度可以获得好的结果 需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物(GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。 编辑本段反应中涉及到的一些事项 ?cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。 ?RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。 ?在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。 ?表4中给出了所有引物的相互关系。重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。 ?引物GSP中的GC含量要在50,70,之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则 会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。 如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100,200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。 ?降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。 ? 编辑本段验证基因特异性引物的对照 ?单个引物的阴性对照:只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。 ?利用两个GSPS进行阳性对照:(只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。)为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。 ?制备和抽提polyA+RNA 不要使用DEPC处理过的水。 纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5,12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小 编辑本段具体的实验步骤 cDNA第一条链的合成 ?cDNA第一条链的合成:我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。 注意:在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。 将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。 直接进行第二链的合成。 cDNA第二链的合成 cDNA第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。 ?建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5,3kb之间。 ?通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。 接头的连接及连接产物的稀释 ?按照程序进行连接反应。 ?如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine,EDTAbuffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行以下的RACEPCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。 RACERACE,,PCRPCR扩增扩增 •进行5’和3’的RACE,PCR扩增。 •利用以下的程序进行降落PCR反应: 94度30秒 5个循环:94度5秒 72度4分 5个循环:94度5秒 70度4分钟 20,25个循环:94度5秒 68度4分钟 注意 我们建议使用降落PCR反应，这就要求GSP的Tm值?70度。 当循环结束时，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl，使用适当的分子量marker。 •可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带，在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2,5kb的时候，经常使用4min，0.2-2kb的时候将延伸时间减到2,3min，对于5,10kb的条带，延伸时间增加到10min。 编辑本段RACE产物的验证 ?应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。 ?有3种验证RACE产物的方法: (1)比较由GSP和NGSP获得RACE产物。 (2)Southernblot (3)克隆并测序 ?我们建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。 比较由GSP和NGSP获得RACE产物。 ?对于5‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。 ?对于3‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。 ?如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于;,,,结构中GSP1和嵌套引物的位置。 RACE产物的克隆和测序: ?可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine,EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。 ?电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。 ?将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中 对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至少8,10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。(反转 录并不总是进行到mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。另外，T4DNA聚合酶会移走5‘末端的0,20个碱基。) ?一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。 全长cDNA的获得 ?通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。 通过PCR的方法。 通过克隆的方法。 通过PCR的方法获得全长cDNA: ?扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。 ?根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端，应该是23,28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。 通过PCR的方法获得全长cDNA: ?进行如下的热循环: 94度30秒 25个循环94度5秒 72度2,15分钟 ?延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如:预期得到6kb的条带，用6，2,8分钟的延伸时间。 ?注意:如果没有条带或者条带弱，增加5个循环;或者优化PCR的条件。 通过PCR的方法获得全长cDNA: ?在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的cDNA。 ?制备1.2%的TAEbuffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBEbuffer，TBE的胶很难制备全长的cDNA。 ?将剩下的45μl反应物点样，选用适当的marker。 ?利用长波紫外观察cDNA(?300nm)切下全长的cDNA。注意:应该尽量减少紫外对cDNA的照射。 通过PCR的方法获得全长cDNA: ?利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine,EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。 ?将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。 通过克隆产生全长的cDNA: ?如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物，同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话，通过克隆技术可以获得全长的cDNA。 ?利用酶切获得的3‘和5’扩增产物，并且利用T4DNA连接酶将它们连接起来。利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。 ?在哺乳动物基因组中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大约106bp才出现一次，因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。 Appendix:cDNA接头和引物?接头在设计的时候可以使cDNA的扩增成功进行:?接头的5‘端在第一个循环中没有AP1引物的结合位点。AP1的结合位点只有通过GSP的扩增之后才能够产生。?这些特点中的每一个都可帮助减少cDNA片段扩增过程中出现的非特异性扩增。另外，它们允许从一个复杂的DNA片段的混合物中扩增出靶样品――所有的产物都有相同的末端结构，因为使用了单一的一套GSPs。 RACE技术的原理和操作 发布日期:2009-11-27 热门指数:21894 分享 | 收藏 近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。 经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5'和3'端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等，1995:Schaefer，l995: Chen，1998: Bespalova等，1998: Matz等11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA，即在oligo(dT)引物的3' 端引入两个 简并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16-30MN-3'，M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5' 端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A);改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温(60? -70?)有效地逆转录mRNA，从而消除了5'端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。 随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品 TMTM 推出，如CLONTECH的Maratho技术和SMARTRACE技术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进行RAC TME反应，结果发现使用Marathon所得到的片断总是比采用 TM SMARTRACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于Mar TMathon技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5' 末 TM端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMART RACE试 TM剂盒。以下就国内目前应用最广的SMART RACE试剂盒为例，简要概述RACE技术的原理和操作过程。 TMSMART 3'-RACE的原理 利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 第一链cDNA.然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer，GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer，UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。(见Figure 1) Figure 1. TMSMART 5'-RACE的原理 先利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5'末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(见Figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer，UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer，GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。 Figure 2. 实验中发现，做RACE反应实验实际操作中仍存在不少困难。因此，对RACE反应条件进行反复摸索是十分必要的。这是因为: 第一，在5'-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤(反转录、同聚物加尾和PCR扩增)，每一步都可能导致失败; 第二，扩增DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品的不均一性，因而特异性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此，使用RACE技术扩增得到的特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测 序，以排除RACE实验结果中扩增产物假阳性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。 随着RACE的不断改进和完善，优化条件下PCR扩增效率和忠实性的提高及PCR产物克隆技术的迅速发展，RACE必将在基因克隆及基因表达研究中发挥越来越大的作用。 RACE的另一种代表方法-Self-Ligation法 1. 反转录(RT)反应。 2. Hybrid RNA的分解。 3. 单链cDNA的自身连接。 4. PCR扩增5'未知区域。 5. 目的DNA片段的切胶回收。 6. DNA序列测定。 原理见Figure 3。 Figure 3. 降落PCR(touchdown PCR)，一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化，但费时费力。降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。其原理大致是这样的。首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。这一PCR技术已经大量地进入医疗临床应用。现在，以高通量PCR为基础的检测方法、如人的 HLA分型 大多采用这一技术。 设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物—模板杂交事件发 生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后(非特异)PCR产物的地位。 编辑本段注意事项 由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中最好应用热启动技术。设计时，退火温度的范围应跨越15?左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10?。 例:一对没有简并的引物—模板的计算Tm值为62?。 则:从65?—>50?(每2cycles降退火温度1?)，再在50?退火温度下做15个循环。 实验中如持续出现假象带(杂带)，则是因为起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几，或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增，可把退火温度每降低1?所需的循环数增加到3或4。 . Absolutely.(用于答话)是这样;当然是;正是如此;绝对如此。 2. Absolutely impossible/not!绝对不可能～ 3. After you.您请～ 4. A little bird told me…有人告诉我…… 5. Are you free tomorrow?你明天有空吗? 6. Are you In the middle of something? 你正在忙吗, 7. Are you out of your mind?你疯了吗, 8. Are you used to the food here?你习惯吃这儿的饭菜吗, 9. Are you kidding?你在开玩笑吧, 10. As far as I am concerned/As far as I can see/From where I stand/In my point of view/In my opinion…我认为…… 11. As your wish/Suit yourself.如你所愿～/随你的便～ 12. Be a man!像个爷们好不, 13. Be a good sport!有点风度行不, 14. Beileve it or not.信不信由你～ 15. Beats me～我不知道～ 16. Behave/Control yourself!你注意点～ 17. Be careful.小心,注意。 18. Be my guest.请便,别客气。 19. Best is the cheapest.便宜没好货/便宜的才是最好的。(具体视语境而定) 20. Better late than never.迟到总比不到好。 21. Better luck next time.祝你下一次好运。 22. Better safe than sorry.小心驶得万年船。 23. Bottoms up!干杯～ 24. Can I have a day off?我能请一天假吗, 25. Can I be of any help?要我帮忙吗, 26. Can I take a message?要我传话吗, 27. Can I take a rain check?你能改天再请我吗, 28. Can I take your order now?您要点菜吗, 29. Can you give me some feedback?你能给我一些建议吗, 30. Can you make it,你能来吗, 31. Can I have a word with you?我能跟你谈一谈吗, 32. Catch me later.过会儿再来找我。 33. Cheer up!高兴起来/振作起来～ 34. Cloth make the man.人靠衣装。 35. Come in and make yourself at home.请进，别客气。 36. Could I have the bill,please?请把账单给我好吗, 37. Could you drop me off at the airport?你能载我到飞机场吗, 38. Couldn't be better worse.再好不过了/可能更糟糕。 39. Count me in/out.别忘了我/不要算我。 40. Did you enjoy your flight?你的旅途愉快吗, 41. Did you have a good /nice day today?你今天过得好吗? 42. Did you have fun,你玩得开心吗, 43. Dinner is on me.晚饭我请客。 44. Do you by any chance know…?你知道……吗, 45. Do you have a room available?你们有空房间吗, 46. Do you have any hobbies?你有什么爱好, 47. Do you have some change?你有零钱吗, 48. Do you mind my/me smoking( here)?你介意我抽烟吗, 49. Do you often work out,(often in a gyme)你经常锻炼身体吗, 50. Don't be so childish.别这么孩子气。 51. Don't be so modest.别这么谦虚。 52. Don't bother.不用麻烦了。 53. Don't count your chickens.不要高兴的太早。 54. Don't get me wrong.别误会我。 55. Don't give me any more of your lips!别跟我耍嘴皮子～ 56. Don't/Never give up.别/永不放弃。 57. Don't jump to conclusions.不要急于下结论。 58. Don't let me down.别让我失望。 59. Don't lose your head.不要惊慌失措。 60. Don't make any mistakes.别出差错。 61. Don't mention it.不必客气。 62. Don't miss the boat.不要坐失良机。 63. Don't take any chances.不要心存侥幸。 64. Don't take it for granted.不要想当然。 65. Don't worry about it.别担心。 66. Easy come,easy go.来得容易，去得快。 67. Enjoy your meal.请慢慢享用吧。 68. Easier said than done.说是容易做时难。 69. First come,first served.捷足先登。 70. For here or to go?再这儿吃还是带走, 71. Forget it.算了吧。 72. Forgive me.请原谅我。 73. Get out of the way!快让开～ 74. Give me a call.给我打电话。 75. Go ahead.可以，做吧～ 76. Guess what～猜猜看～ 77. Hang in there.坚持下去。 78. Have him return my call.让他给我回电话。 79. Have you ever been to…?你去过…吗, 80. Have you finished yet?你做完了吗, 81. Have you got that?你明白我的意思吗, 82. Have you heard from Mary?你收到玛丽的来信吗, 83. Help yourself,please.耐心点儿。 84. Here/There comes the bus.公交来了。 85. How can I get in touch with you?我怎样能跟你联络上, 86. How is it going?/How is everything (going)?情况怎么样, 87. How late are you open?你们营业到几点, 88. How long did it last?持续了多久, 89. How long will it take me to get there,到那儿要多长时间, 90. How often do you eat out?你多久在外面吃一次饭, 91. I appreciate your invitation.感谢你的邀请。 92. I'd appreciate it if+从句 感谢你的…… 93. I'd hate for you to…我不愿你…… 94. I'd like to propose a toast to...我提议为……而干杯。 95. I assure you.我向你保证。 96. I bet you can.我确信你能做到。 97. I can manage it myself.我自己可以应付。 98. I can't resist the temptation.我不能抵挡诱惑。 99. I can't stand it any more.我受不了。 100. I can't tell.我说不准。 101. I couldn't agree more.我完全同意。 102. I couldn't get through.我电话没打通。 103. I couldn't help it.我没有办法。 104. I don't see any point in arguing about this problem.我觉得没必要就这个问题继续争论 下去。 105. I didn't mean to (do sth).我不是故意的。 106. I don't know for sure.我不能肯定。 107. I enjoy your company.我喜欢有你做伴。 108. I feel like having some dumplings.我很想吃饺子。 109. I feel terrible/terribly sorry about it. 太对不起了。 110. I feel the same way.我也有同感。 111. I hate to bother you,but…抱歉，打扰一下…… 112. I have nothing to do with it.那与我无关。 113. I haven't the slightest idea of/about...我一点儿都不知道/明白。 114. I hope you'll forgive me.我希望你能原谅我。 115. I know the feeling.我知道那种感觉。 116. I mean what I say.我说话算数。 117. I quit!我不干了～ 118. I suppose so.我想是这样。 119. I understand completely.我完全明白。 120. I want to reserve a room.我想预定一个房间 121. I was just about to call you.我正准备打电话给你。 122. I was moved/touched.我很受感动。 123. I wasn't aware of that.我没有意识到。 124. I wasn't born yesterday我又不是三岁小孩。 125. I wouldn't worry about it, if I were you / in your shoes.如果我是你，我就不会担心。 126. I'd like a refund.我想要退款。 127. I'd like to deposit some money.我想存点儿钱。 128. I'd like to make a reservation.我想订票。 129. I'll be right with you.我马上就来。 130. I'll check it later.我去查一下。 131. I'll fix you up.(放心吧)我会帮你打理的。 132. I'll do my best.我将会尽我最大努力。 133. I'll get it( for you).我(替你)去接电话。 134. I'll have to see about that.这事儿我得想一想再定。 135. I'll keep my eyes open.我会留意的。 136. I'll keep that in mind.我会记住的。 137. I'll pick up the tab.我来付帐。 138. I'll play it by ear.我将随兴而定。 139. I'll see what I can do.我看一看能怎么办。 140. I'll show you.我指给你看。 141. I'll take care of it.我来办这件事。 142. I'll take it anyway.我要定了。 143. I'll take your advice.我接受你的忠告。 144. I'll think it over.我仔细考虑一下。 145. I'll treat you to diner.我想请你吃晚饭。 146. I'll walk you to the door.我送你到门口。 147. I'm broke.我身无分文。 148. I'm easy to please.我很随和。 149. I'm glad to hear that.听到这消息我很高兴。 150. I'm good at it.我做这个很在行。 151. I'm in a good mood/shape.我心情/身体很好。 152. I'm (just) in the/no mood for…我只是很想/很不愿…… 153. I'm just having a look.我只是随便看看。 154. I'm looking for a part-time job.我正在找兼职工作。 155. I'm looking forward to it.我盼望着这件事。 156. I'm (all) lost.我(完全)给搞糊涂了。 157. I'm not feeling well.我感觉不舒服。 158. I'm not myself today.我今天心神不宁。 159. I'm not really sure.我不太清楚。 160. I'm on a diet.我正在节食。 161. I'm on my way.我这就上路。 162. I'm out for lunch. 我出去吃午餐了。 163. I'm pressed for time.我赶时间。 164. I'm totally exhausted/not a little tired/ dog tired.我累坏了。(若把little换成bit则表达 一点也不累了) 165. I'm sorry I'm late.对不起，我迟到了。 166. I'm sorry to hear that.听到这个消息我感到很遗憾。 167. I'm sort of disappoint in+sth/从句.我对……有点失望。 168. I'm under a lot of pressure.我的压力很大。 169. I'm under the weather today.我有点不舒服。 170. I'm working on it.我正在努力。 171. I've changed my mind.我已经改变主意。 172. I've got a headache/terrible flu.我头痛/患重感了。 173. I've got my hands full.我忙着呢。 174. I've got news for you.我要告诉你一个好消息。 175. I've got no idea.我不知道。 176. Is that OK with you?你觉得这样可以吗, 177. Is this seat taken?这位子有人坐吗, 178. It all depends.看情况。 179. It can happen to anyone at any time.这事可能随时发生在我们每个人身上。 180. It cann't be helped.那是没办法的。 181. It makes no/doesn't make any difference/sense.都一样。 182. It doesn't work.(机器等)出故障了。 183. It drives me crazy.他使我快要发疯了。 184. It isn't much.这是微不足道的。 185. It really comes in handy.有了它真是方便。 186. It slipped my mind.我不留神忘了。 187. It takes time.这需要时间。 188. It will come to me.我会想起来的。 189. It won't happen again.下不为例。 190. It won't take much time.不会发很多时间的。 191. It won't work.行不通。 192. It's nice meeting you.很高兴认识你。 193. It's a deal.一言为定。 194. It's a long story.真是一言难尽。 195. It's a nice day today.今天天气很好。 196. It's a once in a lifetime chance.这是一生难得的机会。 197. It's a pain in the neck.这真是苦不堪言。 198. It's a piece of cake.这很容易。 199. It's a small world.这世界真小。 200. It's a waste of time.这是浪费时间。 201. It's all Greek to me.我完全不懂…… 202. It's about time.时间差不多了/是时候了。 203. It's all my fault.都是我的错。 204. It's awesome.棒极了。 205. It's awful.真糟糕。 206. It's better than nothing.总比没有好。 207. It's essential.这是必要的。 208. It's hard to say.很难说。 209. It's incredible.令人难以置信,不可思议。 210. It's just what I had in mind.这正是我想要的。 211. It's kind of…这有点…… 212. It's my pleasure.这是我的荣幸。 213. It's not the end of the world.又不是世界末日。 214. It's only a matter of time.这只是时间问题。 215. It's out of the question. 这是不可能的。 216. It's rainning cats ang dogs/heavily.下着倾盆大雨。 217. It's time to have/ for dinner.该吃晚饭了。 218. It's still up in the air.尚未决定。 219. It's up to date.……很时髦。 220. It's up to you.一切由你决定。 221. It's worth seeing.它绝对值得一看。 222. It's really an eye-opener.真是让人大开眼界啊。 223. It's very thoughtful of you to…你(做)……真是想得太周到了。 224. Just between you and me…我只告诉你…… 225. Just let it be.就这样吧。 226. Just right place, right time. 只不过是天时地利而已。 227. Just to be on the safe side.为安全起见。 228. Keep the change.不用找了。 229. Keep up the good work.再接再厉。 230. Keep your fingers crossed.为成功祈祷吧。 231. Kill two birds with one stone.一举两得。 232. Lay off!住嘴～/别说了～ 233. Let bygones be bygones.过去的就让它过去吧。 234. Let me get back to you.我过一会儿打给你吧。 235. Let me put it this way.让我这么说吧。 236. Let's call it a day.今天就到这儿吧。 237. Let's get to the point.让我们言归正传。 238. Let's get together sometime.有时间我们聚一下吧。 239. Let's make up.让我们言归于好吧。 240. Let's talk over dinner.我们边吃边谈吧。 241. Long time no see.好久不见。 242. Look before you leap.三思而后行。 243. Look who is talking.看看你自己吧。 244. May I have a receipt?我可以要一张收据吗, 245. May I have your name,please?请问你叫什么名字, 246. May I pay by credit card?我可以用信用卡付款吗, 247. May I try it on?我能试穿一下吗, 248. Maybe it will work.也许这个办法会有效。 249. Maybe some other time.也许下一次吧。 250. Mind your own bussiness/None of your bussiness.与你无关。 251. My mouth is watering.我在流口水了。 252. My phone was out of order.我的电话坏了。 253. Never mind.不要紧。 254. No big deal/great shakes.没什么大不了的。 255. No pains,no gains.不劳则无获。 256. Nothing is impossible to a willing heart.心之所愿，无事不成。 257. Not really.并不完全是这样的。 258. Now you're talking.这才对嘛。 259. Pain past is pleasure.痛苦逝去即是快乐。 260. Please accept my apology.请接受我的道歉。 261. Please leave me alone.请别打扰我。 262. Please let me know.请告诉我一声。 263. Please make yourself at home.请别客气。 264. Please show me the menu.请把菜单给我。 265. Same here. 我也是。 266. Seeing is believeing.耳听为虚，眼见为实。 267. So far ,so good.到目前为止还好。 268. Something must be done about it.必须得想个办法。 269. Something's come up.发生了一些事。 270. Sorry to bother/haved bothered you,but…抱歉，打扰一下…… 271. Stay out of this matter please.别管这事。 272. Storms make trees grow deeper roots.暴风雨使树木深深扎根。 273. Suit yourself.随你便。 274. Take care. 请多保重。 275. Take it easy.别紧张，放松点。 276. Take it or leave it.要不要由你。 277. Take my word for it.相信我的话。 278. Take your time.慢慢来。 279. Thank you for everything (youve' done for me).感谢你做的一切。 280. Thanks a million.非常感谢。 281. Thanks for the warning.谢谢你的提醒。 282. Thanks for your cooperation.多谢合作。 283. That couldn't be better.那再好不过了。 284. That depends.看情况。 285. That makes sense.那可以理解。 286. That reminds me.那可提醒我了。 287. That rings a bell.我总算想起来了。 288. That sounds like a good idea.那听上去是个好主意。 289. That's disgusting.真讨厌。 290. That's fair.那样公平。 291. That's for sure.那是肯定的。 292. That's good to know.幸好知道了这件事。 293. That's more like it.那样才像话。 294. That's neat.这很好。 295. That's not like him.那不是他的风格。 296. That's not a problem.那没问题。 297. That's ridiculous.那太荒唐了。 298. That's the way I look at it.我也是这么想。 299. That's the way it is.就是这么回事。 300. That's my boy/girl.这才像话(对下级、晚辈)。 301. The sooner,the better.愈快愈好。 302. There is no doubt about it.那是毫无疑问的。 303. There is nothing I can do.我无能为力。 304. These things happen all the time.这是常有的事。 305. This soup tastes great.这个汤非常美味。 306. Time is money/everything.时间就是金钱/一切。 307. Tomorrow never comes.时不我待。 308. We are running out of time.我们的时间不多了。 309. We are in the same boat.我们的处境相同。 310. We can get it by.我们过得去。 311. We can work it out.我们可以解决这个问题。 312. We'll see.再说吧。 313. Wake me up at five,please.请在五点的时候叫醒我。 314. What a coincidence!真是太巧了～ 315. What a shame!真是遗憾～ 316. What a terrific idea!多好的一个主意啊～ 317. What are you up to do?你要做什么, 318. What are you doing up there? 你在忙什么呢, 319. What are you waiting for/talking about?你在等/说什么? 320. What do you think of it?你觉得怎么样, 321. What is it about?这是关于什么的, 322. What is it like there?那儿怎么样, 323. What makes you say so?你怎么这么说, 324. What's going on here?这里发生什么, 325. What's on your mind?你在想什么呢, 326. What's the deadline?截止到什么时候, 327. Whatever you do/think is fine with me.我随你。 328. When is the most convenient time for you?你什么时候最方便, 329. When will it be ready?什么时候能准备好, 330. Where can I check in?在那儿办理登记手续? 331. Where can I go for help?我该怎么办, 332. Where have you been?你去哪儿了, 333. Where is the rest room/john,please?请问洗手间在哪儿, 334. Where were we then?刚才我们说到哪儿了, 335. Who is in charge here?这里谁负责, 336. Who knows～鬼知道呢～ 337. Would you care (for+n/名词性从句)…?你觉得……怎么样,/你要不要……, 338. Would you do me a favor?你能帮我一个忙吗, 339. Would it be possible for me to do…我做……可以吗, 340. You are just saying that.你只是说说而已。 341. You are so considerate.你真有心。 342. You asked for/named it.你自找的～ 343. You can count on me.你可以指望我。 344. You can say that again.我同意。 345. You can't complain.你该知足了。 346. You deserve it.这是你应得的。 347. You get what you pay for.一分钱一分货。 348. You never know.世事难料。 349. You really did a great job.你干得很好。 350. You're going too far!你太过分了～ 351. You're in the pink !气色不错～ 352. You're killing me.真是笑死我了。 353. You said it.你算说对了。 354. You should give it a try.你应该试一试。 355. You've got a good deal.你买得真便宜。 356. You've got a point there.你说的有道理。 357. You've got it.你明白了。 358. You've got me there.你考到我了。 359. You've made a good choice.你的眼力不错。 360. You can count on me.你可以指望我。