茯苓菌种质量标准和种质资源的研究

茯苓菌种质量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 和种质资源的研究 湖北中医药大学学位论文原创性声明 本人声明: 所呈交的学位论文是在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了论文中特别加以标注和致谢的地方外,本论文不包含其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得湖北中医药大学或其他单位 的学位或证 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 而使用过的材料.对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在论 文中作了明确的说明.本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名:抑滂 ?年岁月加日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解湖北中医药大学有关保留、使用学位论文的 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 ,即:学校有 权保留学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或 部份内容,可以采用复印、缩印或其他手段保留学位论文;学校可以根据国家或 湖北省有关部门的规定送交学位论文.同意《中国优秀博硕士论文全文数据库出 版章程》的内容.同意授权中国科学技术信息研究所将本人学位论文收录到 《中 国学位论文全文数据库》. 保密论文在解密后遵守此规定 为,年如日 做储麟夤涝别醛各/煳嬲 目 录 中文摘要??..:??。 ?......?.?...?...?.?...?.?..?....?.........?...?..?.....??.?.?... 缩略语表??..? 前 言??.. 第一部分茯苓的分级质量标准和检验规程研究菌种的分级? 菌种的收集 菌种培养基的制备..:.母种培养基??. .原种培养基?.. .栽培种培养基? 各级菌种的制备? .一级菌种的制作? .二级菌种的制作.三级菌种的制作. 菌种检验规程的研究??:?. .感官检验?. .微生物学检验?.. .菌丝生长速度测定及菌丝萌发定植能力.. .真实性鉴定..结论..... .感官检验?. .微生物检验.菌丝生长速度测定及菌丝萌发定植能力讨沦?. 第二部分茯苓菌株培养基的筛选研究? 材料??。?.. .菌株?.培养基方法?. .固体培养??.. .摇瓶液体培养 结沧?.. .茯苓在固体培养基的生长情况与固体培养基的选择? .液体培养基的培养基的生长情况与液体培养基的选择. 第三部分茯苓菌株的酯酶同工酶研究. 材料?.. .实验菌株为第一部分中的个菌株?. .主要试剂及其配制. .培养基?. .主要仪器?.:。 方法..二:??. .菌丝培养??. .样品处理??.. .凝胶制备??. .点样?一 .电泳?.. .取胶染色 .试样结果观察和统计分析一 结果与分析? .茯苓不同菌株的酯酶同工酶图谱分析?. .酯酶同工酶相对迁移率.聚类分析. 讨论?. 第四部分分子标记在茯苓菌株遗传多样性研究中的应用. 材料?.. .实验菌株?...主要试剂 .主要溶液配制??.一. .主要仪器 . 引物??. 方法?. .基因组提取?. . 的检测与浓度测定 . 引物筛选.反应条件的优化??. .退火温度筛选? . 分析?.. 结论。。, . 个茯苓菌株的检测与测定??。 .引物筛选?. .反应条件的优化.退火温度筛选:? ’. 分析?.... .寸论?.. 结束语 参考文献?. 文献综述?.. 附表一:原种和栽培种感官要求??. 附图二:拮抗实验 附图三:不同培养基的茯苓生长状况. 附表四:茯苓酯酶同工酶及分子标记的菌株名称及来源??. 附表五:茯苓菌株酯酶同工酶谱带的值。 致 谢?.中 文摘要 优良纯化的菌种,是茯苓栽培成功的根本保证,其直接影响茯苓的产 品质量和栽培产量,继而影响栽培者的经济效益呤 近年来对菌种的研究投入不足,出现了滞后于生产的局面。由于育种 工作的滞后,国内各地以相互引种替代新品种,在产品名称上,商业名称、 学名和俗名上的混淆和张冠李戴现象时有发生,同种异名现象较多,随意 起名编号更为普遍,如从异地引进的菌种,随意编号,以掩盖真实来源和 编号造成菌种混乱。因此,迫切需要一种操作性强、能准确鉴定食药 用菌菌种的新方法。 同时,加快建立包括蛋白质和指纹在内的茯苓种质资源信息库具 有更加现实的意义. 本课题根据茯苓各级菌种的制备及生长条件来确定茯苓各级菌种的 质量标准。对茯苓菌株培养基的筛选确定茯苓最适宜生长的培养基。同时, 采用酯酶同工酶技术和分子标记技术,对我国茯苓栽培菌株及部分 野生菌株的种质特征和遗传多样性进行了分析.主要研究结果如下: 一、 茯苓菌种的质量标准和检验规程研究 通过拮抗实验表明:其中部分菌株之间表现出十分明显的拮抗现象, 例如麻城一一靖、。一一 等,说明其遗传系统存在差异;同 时部分菌株间拮抗现象不明显,例如:。一一靖等,说明其遗传差异 较小,可能属同物异名. 观察茯苓菌丝生长来确定茯苓的生长速度及萌发定植能力:在 培养基上,在适温??时,萌发定植时间为?,长满试管 斜面的时间为?.在松木屑 %,麦麸或米糠 %,糖%,石膏%组 ?. 成的培养基上,?温度下,茵丝长满菌袋一般为 二、 茯苓菌株培养基的筛选研究 对茯苓菌株培养基进行筛选,包括固体和液体培养基的比较,发现最 适合的固体培养基为普通培养基,液体培养基为麦芽糖培养基.三、 茯苓菌株的酯酶同工酶研究 取不同来源的茯苓菌株个作为供试菌株进行酯酶同工酶分析,共 检测到条酯酶同工酶谱带,每个菌株所具有的酶带数为?条不等, 多数为条。个供试菌株共有种酶谱类型,其中部分菌株谱带相同。 聚类分析表明:当遗传相似水平为%时,供试的个茯苓菌株可分为 、 八类。第一类:鄂、福建;第二类:麻城、、同仁堂、、 、 、大别山、、 、、靖、、 、;第三类:.;第四 类:茯苓;第五类:;第六类:、茯苓号、、、 、;第 七类:、 、;第八类:.部分菌株相似系数为,说明它们亲缘 关系近。 四、 分子标记在茯苓菌株遗传多样性研究中的应用 采用不同来源的个茯苓菌株对个引物进行筛选,选择扩增 稳定、多态性较好的个引物用于分析。在筛选退火温度的基础上, 用条引物对个茯苓菌株进行指纹图谱分析,个引物共扩增 出 条带,其中具有多态性带 条,占总带数的%,平均每个 引物扩增出条带。从聚类分析结果可以看出,在%水平上个供试 的菌株可以分为六个大类。第一类:、鄂、麻城、、茯苓、 同仁堂;第二类:、、、.、、、、、;第 三类:茯苓号;第四类:大别山、、、、福建、靖、、、 、、;第五类: ;第六类:、. 关键词茯苓;质量标准;酯酶同工酶; ?: . : :?. , , . , ,, ’二’’ . , , , ,, , , , , . , , . . .,: . : ,一 . , .,一,, , :? . , ,:。?, . %, , % , %, %, . . ?,:, . , :? . . . ,% : . , ; :、、、、、、、:.; ,,,,,,?;:? : :; ; :、 、、 、; 、、; 伍:., .: , , ., , ,% , % . , : , .、 、、、 、; :、。 : 、、、、、、、; ; 、、、‘ :、、、、 、:: :,.. 、; ; ; ; 缩略语表 中文名称 英文缩写 英文全称 脱氧核糖核酸 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚合酶链式反应 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 简单重复序列 .茯苓茵种质量标准和种质资源研究 前言 茯苓优良菌种的选育是茯苓生产的基础和关键。由于全国各地在菌种 分离、培育等具体方法存在一定差异,导致菌种质量不一.茯苓菌种的生 产技术影响菌种的质量,进而影响产品的质量。 为了实现食用菌菌种生产技术 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 化,确保菌种质量,维护生产者、 经营者和使用者的合法权益。所以,有必要对国内各产地茯苓的状况与品 质加以研究,进一步规范茯苓菌种分离、培育方法,制定茯苓菌种质量标 . 准。 然而,我国的茯苓种质资源存在一定的缺点:第一,仅仅停留在资源 调查阶段,鉴定、评估、利用、驯化栽培研究不足。第二.,缺乏知识产权 的保护意识,种质资源流失严重。这在一定程度上限制了菌种选育水平的 提高,给茯苓产业的发展带来不可估计的损失. 目前科研及生产中已应用的多个菌株是否为同种或同株还需要采取 分子生物学等方法进行研究确定。因此,应加快步伐对茯苓野生种质资源 进行调查收集、鉴定评价、保藏检索等工作;一方面观察记载其表型性状 特性,另一方面应涉及到有关生理、生化指标和细胞学、遗传学方面的鉴 定,建立茯苓种质资源库。对研究、保护、管理等体制的完善,知识产权 意识的增强,加深认识、充分利用及开发研究茯苓资源都具有重要的意义. 分子标记技术随着科学的不断进步和分子生物学实验技术的成 熟而不断创新.对于食用茵的质量标准方面,分子标记越来越受到医 药工作者的青睐。通过分子标记技术,食用茵的遗传多样性、基因定位和 分子克隆都得到应用. 本实验通过对母种、原种、栽培种的制备,确定茯苓菌种分级质量标 准及茯苓菌种质量标准检验规程,保证了茯苓菌种的质量。分析茯苓菌种 分子 的酯酶同工酶酶谱,为茯苓的菌株鉴定和育种提供依据.通过 标记技术,来构建茯苓基因组指纹图谱, 对不同来源的茯苓菌株进 行鉴别.湖北中医药大学届硕士学位论文 第一部分茯苓的分级质量标准和检验规程研究 菌种的分级 我国食用菌菌种分为母种、原种、栽培种三级,由种苓直接分离或经 其它方法选育得到的茯苓菌种为一级菌种,称茯苓母种;母种经扩大培育 成的菌种为二级菌种,称茯苓原种;由原种扩大培育成的菌种为三级菌种, 直接用于栽培种植,称栽培种。如图所示 图母种、原种和栽培种 菌种的收集如表 表茯苓菌株及其来源茯苓菌种质量标准和种质资源研究 同仁堂号 湖北英山湖北英山 加 湖北荚山陶河湖北英山陶河 :: 湖北英山石镇 ” 麻城 湖北麻城县科委食用菌研究所 ? 鄂苓号 华中农业大学菌种实验中心 ” 华中茯苓 湖北华中食用菌栽培研究所 ? 湖北华中食用菌栽培研究所 茯苓号 ?卜,? 蓉‖ 武汉华奉食用菌研究所 茯苓号 他 北京中国农业微生物菌种管理保藏中心 ” 北京中国农业微生物菌种管理保藏中心 群; 加 . 北京中国科学院微生物研究所 神苓号 陕西洋县天麻研究所 勉 靖州号 陕西省西方县古城菌研所 ” 光大 山东省济宁市光大食用菌科研中心 ? 金乡 山东省金乡县真菌研究所 ” 河南省西峡县菇源菌物研究所 茯苓号 拍 责州省习水县酒镇食用菌研究中心 ” 广东省广州市微生物研究所菌种供应站 勰 福建农业大学生命科学院 福建 ” 福建三明真菌研究所 如 浙江省云和县家山食用菌研究所黑龙江东北食药用真菌研究所 弛 华中农业大学真菌研究所 华中农业大学真菌研究所 号 湖北中医药大学届硕士学位论文 菌种培养基的制备 .母种培养基培养基 原料:马铃薯去皮 ,葡萄糖 ,琼脂 ,水 配制步骤:将马铃薯去皮挖去发芽薯块芽眼,洗净,切成薄片, 用水冲洗干净,称取,加水 ,煮沸至软而不烂为度,用纱布 用水浸湿后拧干过滤,取滤液。称取琼脂,加入马铃薯滤液中,煮 至全部溶化.溶液中加入葡萄糖,搅拌溶化,并加水补足,分装于试 管中;培养基斜面长度为试管总长度的三分之一,加塞、用报纸包扎.将茯苓 茼种质量标准和种质资源研究 配制的母种培养基置高压灭菌锅内,用./压力温度.?灭 菌 ;试管趁热摆放斜面,冷却备用。培养基经灭菌后,必须放在 ?温箱培养,检查灭菌效果,无菌生长者方可使用。 .原种培养基 % 白糖%石膏% 原料:松木屑%麦麸或米糠 配制步骤:按 配方 学校职工宿舍分配方案某公司股权分配方案中药治疗痤疮学校教师宿舍分配方案医生绩效二次分配方案 称好料,松木屑加水混匀,再将白糖和石膏也用适 量的水混匀配成浓的溶液,然后把浓溶液加入松木屑中充分拌匀,含水量 在%左右以手捏后指缝有溢水为度,堆置分钟使其充分吸收后装 入聚丙烯塑料袋中,边装料边振摇,并用扁形铁钩或木棒稍压实,使之均匀 装至瓶肩处.将另%松木屑用营养液润湿,盖在瓶内培养基料表面,厚 约. .用锥形木棒在瓶中扎一直洞约至瓶底,擦净瓶内壁、外壁沾 有的物料,塞紧棉塞或具海绵塞的瓶盖。瓶盖外部用二层报纸包裹,用棉索 或橡筋进行包扎;将配制的原种培养基置高压灭菌锅内,用. /压 力温度?灭菌,灭菌后慢慢冷却,备用。 .栽培种培养基 % 白糖%石膏% 原料:松木屑%麦麸或米糠 配制步骤:按配方称好料,松木屑加水混匀,再将白糖和石膏也用适 量的水混匀配成浓的溶液,然后把浓溶液加入松木屑中充分拌匀,含水量 在%左右以手捏后指缝有溢水为度,堆置分钟使其充分吸收后装 入聚丙烯塑料袋中,边装料边振摇,并用扁形铁钩或木棒稍压实,使之均匀 装至瓶肩处.将另%松木屑用营养液润湿,盖在瓶内培养基料表面,厚 约. .用锥形木棒在瓶中扎一直洞约至瓶底,擦净瓶内壁、外壁沾 有的物料,塞紧棉塞或具海绵塞的瓶盖。瓶盖外部用二层报纸包裹,用棉索 或橡筋进行包扎;将配制的原种培养基置高压灭菌锅内,用. /压 力温度?灭菌,灭菌后慢慢冷却,备用湖北中医药大学届硕士学位论文 各级菌种的制备 .一级菌种的制作 一级菌种是菌种生产的基础,一级菌种质量的优劣,直接关系到二级 菌种和三级菌种的质量。 ..配制母种培养基培养基,灭菌备用。 ..母种培养 从无菌箱或无菌室内将分离、接种后的试管或培养皿拿出,贴上标签, 注明菌种编号、种苓来源、分离接种时间等,然后移入?恒温箱内 培养;分离出的鲜苓块经培养,可看到接种块周围长出白色绒毛状的茯 苓菌丝。随着培养时间的延长,可见茯苓菌丝在培养基上伸延,在培养过程 中若发现有杂菌污染,要及时剔除。,茯苓菌丝长满培养基表面,即得 到一级母种。 ..菌种分离纯化、转管扩大培养 用无菌操作的方法将所需要的食用菌从混杂的微生物群体中单独分 离出来,通过菌种分离得到的纯菌丝体即为一级菌种。取直径?的 母种块移入新斜面中部,进行转管扩大繁殖每支母种转管支,扎成一 把,增加母种数量,以满足需要。 ..菌种保藏 利用创造不利于菌种生长的一切条件,使其代谢处于休眠状态来保藏 一级菌种。菌种的保藏常用斜面低温法,即把斜面菌种置?冰箱中 ?个月,用时再活化,为了防止棉塞受潮,要用报纸包好。 .二级菌种的制作 ..配制茯苓二级种培养基,灭菌冷却。 随机取几袋置于?温度下空白培养?天,检验灭菌效果。 ..接种 挑选待接的菌种,勿接入老菌丝老菌块以及褐化的菌块,按照“茯苓 茯苓茵种质量标准和种质资源研究 母种质量标准选择优质母种,将预先准备的优质母种置接种箱内,无菌 操作法用接种耙取四分之一母种迅速接种移入原种培养基袋内中央孔边, 随即盖严瓶口,用记号笔在袋壁上写上菌名,接种人名以及接种时间。 ..培养 将接种后的原种置?恒温箱或培养室内培养,培养?,可 见母种菌块上的菌丝恢复生长并逐渐向纵深延,平均每天大约伸延. 培养过程中,必须经常检查,并调整培养温、湿度,若发现菌丝生长异常, 要及时分析原因,采取补救措施,若有杂菌污染,坚决剔除。 .三级菌种的制作 三级种的培养基配方、制作以及接种后的管理,均与松木屑原种相同, 主要区别是原种用斜面母种接种,而栽培种则用松木屑原种接种。每袋原: 一 种可接栽培种 ?袋瓶. ’ 工 菌种检验规程的研究 .感官检验 ..母种 母种的感官检验项目包括容器、棉塞无棉塑料盖、斜面长度、菌 种生长量、斜面背面外观、茵丝特征、培养基上表面距离瓶口距离、分泌 。 物、杂茵菌落、子实体原基、角变等。 ...容器 用游标卡尺测量试管外径和管底至管口的长度,肉眼观察试管有无破 损。 ...棉塞无棉塑料盖 手触是否干燥;肉眼观察是否为梳棉制作,是否洁净,对着光源看是 否有粉状霉菌;松紧度以手提起棉塞脱落与否判断;透气性和滤茵性以塞 入水管长度达到.,试管外露长度达到为合格。无棉塑料盖只检湖北中医药大 学届硕士学位论文 验洁净度。 ...斜面长度 用游标卡尺测量斜面顶端到试管口的距离。 ...斜面背面外观 肉眼观察培养基边缘是否与试管壁分离。 ...菌种外观其它各项 肉眼观察 ...气味 在无菌条件下拔出棉塞,将试管置于距鼻?处,屏住呼吸,用 清洁干净酒精擦拭消毒过的手在试管上方轻轻煽动,顺风鼻嗅。 ..原种和栽培种 ...容器 肉眼观察试管有无破损。 ...棉塞 无棉塑料盖 手触是否干燥;肉眼观察是否为梳棉制作,是否洁净,对着光源看是 否有粉状霉菌;松紧度以拔出或塞进不费力为合格;透气性和滤茵性以塞 入水管长度达到,试管外露长度达到为合格。无棉塑料盖只检验 洁净度。 ...培养基上表面距离瓶袋的距离 用游标卡尺测量 ...接种量 原种用游标卡尺测量,栽培种检查生产记录。 ...菌种外观其它各项 肉眼观察 ...气味 在无菌条件下拔出棉塞,将试管置于距鼻处,屏住呼吸,用 清洁干净酒精擦拭消毒过的手在试管上方轻轻煽动,顺风鼻嗅。茯苓茼种质 量标准和种质资源研究 .微生物学检验 ..拮抗实验配对实验 在真菌领域,由于菌丝体的遗传界限不易观察,个体的识别和鉴定显 得比较困难”。 所谓个体的体细胞不亲和性是一种遗传系统,该系统能引起遗传上明 显不同的个体在交界区产生特征的拮抗反应。如果个体间属于体细胞不亲 和类型,则在菌丝交接处,出现明显反应区.反应区菌丝表现不一,有的 甚为浓密,有的稀疏,有的平贴,有的成棉絮状。在某些强烈的反应中, 反应区出现无菌丝带,有时,反应区菌丝产生露珠,有时背面产生深浅不 一的色素,色素的深浅、露珠的多寡以及反应区质地、高度、宽度、密度 等都是体细胞不亲和性的表现。这种现象通常也被称为拮抗现象。 确定丝状真菌体细胞不亲和的方法有拮抗实验、异核体不亲和性检验 和部分二倍体分析。在以上种方法中,拮抗实验最为简便。对大量野 外分离菌株的研究表明,体细胞不亲和的菌株其基因型不同.所以,拮抗 线实验又广泛用于丝状真菌种内菌株的鉴定、分类或是否同种异名.熊杰 等研究茯苓菌丝体的配对试验表明,同一菌株担孢子间产生拮抗,不同 菌株担孢子间的两个细胞核是具有遗传互补性,茯苓可能是一种次级同宗 结核茵.林芳灿等以个香菇菌株为材料,对其菌丝原生质体单核体 及孢子单核体的交配型进行了分析。在茵丝原生质体单核体中,未获得原 双核体预期应有的:的核型比例.在担孢子中,种类型的单核体亦 不呈预期的:::之比。为确定在中国广泛栽培的香菇菌株中所存 在的、因子的数目,进行了个菌株单核分离物间的交配试验。鉴定 个 表明,个野生菌株有个不同的因子和个不同的因子,而 栽培菌株仅有 个不同的因子和个不同的因子.姚占芳?等研究 香菇的栽培菌株的遗传特性表明,拮抗作用强的则遗传差异大。 ...供试培养基 配制培养基,灭菌冷却. ...平板的制作湖北中医药大学届硕士学位论文 在无菌操作台内,将锥形瓶内的已灭菌好的培养基倒入半径的培 养皿中。冷却后,在培养皿中分别接入相同大小的三块接种块,两两接种 块间距离相等,?恒温培养。 ...观察不同菌株之间的拮抗反应如附图二。 ..霉菌检验 危害食药用菌类菌种的霉菌生长条件多与其相似,所以采用食药用菌 通用的培养基即可,无需使用霉菌专用培养基。并且霉菌的菌丝和菌 落外观与食药用菌明显不同,可以培养后肉眼鉴别。 ...方法 从菌种中挑出见方的菌种块,接种于斜面上,置于? ?下培养,对比观察出现茯苓菌落以外的菌落,或有异味者为霉菌 污染物。必要时按照茵丝生长状态检验方法制作水浸片,显微观察。 ..细菌检验 危害食药用菌的细菌在其生长条件下可以很好生长。因此采用食药用 菌通用的培养基或细菌肉汤培养基均可,在?条件下培养。 在培养基上,糊状的细菌茵落可以很明显的区别开来。在液体培养基 中,若有细菌污染,则培养产生的大量细菌会使培养基由半透明变为浑浊。 ...方法 从菌种中挑出的菌种块,接种于斜面上,置于??下 培养,天后取出,对比观察. .茵丝生长速度测定及茵丝萌发定植能力 对于食药用真菌茵丝的生长,一般在适宜的温度范围内.温度相对过 高茵丝生长速度固然加快,但往往易造成菌丝体徒长,易衰老,菌丝活力 和抗性不强.在适宜温度稍低的环境下,菌丝生长速度虽有所下降,但菌 种健壮,活力和抗性均较强,作为接种物使用时萌发快,长势好.并且一 般菌种的质量不完全取决于菌丝生长速度的快慢,其最终产量和菌丝生长 速度间也没有明显的相关性.且多数食药用真菌在通用固体培养基,茯苓茵 种质量标准和种质资源研究 以及??温度条件下均能较好生长,并在生产上也多采用该条件. 所以本试验中未用菌丝生长速度作为筛选培养基类型和温度等条件的指 标,而是按照常规条件对不同菌株的生长速度进行了测量。 ..母种 ...供试材料 茵龄 天的茯苓母种支 ...观察和测量 按要求准备试管斜面,取材料斜面试管上位一半处菌种 见方,菌丝朝上接种于试管中,接种试管个,置于?下培养。 小时后观察是否有污染,如无污染日后再观察,如尚未长满,以后 每日观察,直至第天。记录长满试管的天数。 黔 ..原种和栽培种 ...培养基:采用下列配方制备茯苓原种和栽培种培养基。 .. 松木屑%,麦麸或米糠 %,糖%,石膏% ...观察 . 按要求制备原种和栽培种,然后接种,置于?下培养?天 抄 后进行首次观察,目的在于排除污染,以后每天观察一次,周后开 始每天观察,记录长满日期. .真实性鉴定 ..菌丝形态鉴定 ...供试菌株 安徽岳西、。英山石镇、草、日本滑菇 ...供试培养基 培养基。 ...平板和染色样品的制备 在无菌操作台内,将锥形瓶内的培养基倒入培养皿中,约倒至培养皿 高度的一半左右,在无菌操作台内待冷却之后待用.将供试菌株的茵丝体湖 北中医药大学届硕士学位论文 接种到平板中央,每个菌株个重复,每个培养皿插片盖玻片,在离菌株 ~.处,斜插片灭菌的盖玻片,置的培养箱中培养,待生长 如图 的菌丝爬上盖玻片时取出。 图染色的样品 ...染色 从培养皿中取出附有菌丝体的盖玻片,用擦镜纸擦去反面菌丝,用镊 子将盖玻片附有菌丝体的一面贴染液盖上,取出的盖玻片滴上 染色 液,染色~后盖片观察,并拍照记录哺。 ...水装片的制备 在载玻片上滴两滴蒸馏水,从培养皿中取出附有菌丝体的盖玻片,用 擦镜纸擦去反面茵丝,用镊子将盖玻片附有菌丝体的一面贴蒸馏水盖上, 在显微镜下观察测量,观察?个视野,并拍照记录. ..结实性试验 . 将菌丝体接种至试管斜面或平板中,士?培养 结论 .感官检验 ..母种感官要求如表茯苓茵种质量标准和种质资源研究 表母种感官要求 目 要 求 项 完整无损 容器 干燥、洁净、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 硅胶塞或棉塞 为试管总体积的四分之一至五分之一 培养基灌入量 顶端距塞子一 培养基斜面长度 ? ? 斜面接种块大小 长满斜面 菌种正面外观 菌丝生长量 茵丝体特征 菌丝色白、均匀、粗壮、气生菌丝旺盛 菌丝体表面 均匀,平整、无角变 杂菌菌落 无 菌丝分泌物 菌丝体尖端可见晶莹的露滴状分泌物 培养基不干缩,颜色均匀、无暗斑,无色素 培养基斜面背面外观 有茯苓菌丝特有的气味,无酸、臭、霉等异味 专味 ..原种感官要求见附表一 ..栽培种感官要求见附表一 .微生物检验 ..拮抗实验配对实验 多个菌株间的拮抗试验显示,有的菌株间拮抗现象十分明显,在反应 区出现隆起,沟状,色素等拮抗现象;有的菌株间存在拮抗现象但不明显, 两者之间菌丝体可以和谐生长. 各组茯苓之间的关系具体结果见下如表的第一组、第二组、第三 组、第四组、第五组、第六组、第七组拮抗反应结果 . 湖北中医药大学届硕士学位论文 表.第二组、;幂:华农的拮抗反应结果 表.第四组、茯苓号、、光大和华中茯苓的拮抗反应结果 茯苓茵种质量标准和种质资源研究 表.第五组麻城、、和靖的拮抗反应结果 菌株 结果 麻城 菌株 一 靖 表.第六组福建、、茯苓号、 乖的拮抗反应结果 结果 菌株 茯苓号 菌株 福建 ~茯苓号表.第七组、、、。、、,、金乡、 。、号、野生王、、的拮抗反应结果 菌株 结果金乡 号 野生王 菌株 金乡 ‘号 湖北中医药大学届硕士学位论文 注:以上表格中所表示的:表明拮抗现象非常明显;表明拮抗现象比较明显; 一表明无拮抗现象。 在无性阶段,丝状真菌通过个体间融合形成新的异核体菌丝来实现基 因重组,通过体细胞不亲和性系统来实现非己识别,一方面在维持种内的 基因重组,维持个体在遗传、生理和生态等方面的特性上起作用;另一方 面,它赋予真菌一种保护机制,避免其受到强势基因、侵染性因子如真 菌病毒、致死质粒等的侵袭。所以当具有遗传差异的个体间互相接触时, 会有不同程度的拮抗现象的产生,试验结果显示其中部分菌株之间表现出 十分明显的拮抗现象,例如麻城一一靖、。一一 等,说明其 遗传系统存在差异,确定不同种质;同时部分菌株间拮抗现象不明显,例 如:。一一靖等,说明其遗传差异较小。 ..霉菌检验 结果无污染的茯苓菌种外观洁白,气生菌丝发达,生长旺盛,污染过 木霉的培养物外管明显不同,表面灰绿色,有粉状绿色分生孢子。如图 图霉菌检验无茯苓菌落外的其他菌落,无霉菌污染图细菌检验 .茵丝生长速度测定及菌丝萌发定植能力 澎饼昭 ..不同菌株母种茵丝生长速度、定植时间 科。,,. , 在培养基上,在适温?士?时,萌发定植时间为? 如表. 长满试管斜面的时间为? 表不同菌株母种菌丝生长速度、定植时间 长满时间 长满时间 定植时间 定植时间 菌 株 菌 株“ 弛 麻城 宝山 殳 拍鄢苓号 . ? “ 华中茯苓 . ? ? 茯苓号? 弘 茯苓号?如 弘弛. “ 靳 同仁堂号 ? 丘 % 神苓号靖州号 湖北中医药大学届硕士学位论文光大金乡 . 华农 茯苓号..福建.. .. 大别山 . . 号 武汉同仁堂 . 野生王 杨 . 野生刘 ???????????????????????’?“ ..不同菌株二、三级种菌丝生长速度 在松木屑%,麦麸或米糠%,糖%,石膏%组成的培养基上,? 温度下,菌丝长满菌袋一般为?。如表 表不同菌株二、三级种菌丝生长速度 菌株 长满时间 长满时同 长满时间 菌株 长满时间 菌株 菌株号 华中茯苓 茯苓号 宝山 野生王 茯苓号 福建 ? 靖州号? 金乡核 支 各 图: .英山石镇 图: 安微岳西 ..茯苓茵丝水装片显微测量与观察结果 茵丝直径为.?. ,“左右的较多见图;。英山 ,. 石镇菌丝直径为.~.左右的较多见图;草茵 丝普遍较粗,直径为? 见图;号日本滑菇 茵丝较细, 直径为? 见图 . 水装片显微观察图如下: 茯苓茵丝体具有无限生长的特性,往往以接种块为圆心呈辐射状蔓 延,并且顶端可以不断地分枝,显微观察表明个细胞之间形成明显的隔 膜,每个细胞有多个细胞核,且核的数目不等,茯苓的菌丝为多核菌丝体. 草、日本滑菇 无锁状联合见图、图 ,而茯苓茵丝体中却 看到了某些菌丝的个细胞之间的隔膜处有个小小的突起,菌丝体管状、 具有明显隔膜、分枝较多,每个细胞含有多数细胞核,粗壮茵丝直径为 .?.但难以判断茯苓是否具有锁状联合见图、图,这与 宁平、陈水明的结论一致,或许也是单毅生等认为茯苓具有锁状联合, 而富永保人等 认为茯苓是不产生锁状联合的原因,故茯苓是否具有锁状湖 北中医药大学届硕士学位论文 联合还有待进一步研究。 ?甚?《。 .? 图: .英山石镇 图: 安徽岳西 ..结实性试验 左右菌丝体表面陆续可见子实体原基分化,并逐渐转变为淡黄色 至深褐色的幼小蜂窝状子实体。如图 图:日本滑菇 图:草 图”子实体 一?。?????????????????????????????’。。’。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 。??????????????????????????????一 茯苓质准和种质资源研究 讨论 传统形态学的研究是以茵丝颜色、宽度、有无锁状联合,子实体的形 态,茵褶特征,孢子形状及担子分隔与否等特征作为分类依据。但它的形 态学特征与环境因素息患相关,同一个种在不同环境下表现出不同的特 征。因此,形态学研究可作为鉴定品种的其中一个手段,但不能作为最终 手段。 细胞学标记是以染色体的形态、体细胞不亲和性等作为遗传分析。在 大多数真菌中,不亲和性是一种识别异己的遗传系统,该系统能引起在反 应区产生的拮抗反应.虽然拮抗反应可作为真菌种内菌株异同的标志,但 却存在着主观性,受到种类范围的局限。因此,只能作为辅助手段用于亲 缘关系. 一 在整个试验过程,无菌操作至关重要,是所有试验成功的前提条件. 其要点是:接种前分钟接种环境用紫外照射消毒灭菌。操作时用酒精 鲈 棉球消毒双手,操作器具用酒精灯外焰灼烧消毒灭菌.开启的管:、瓶:/ 靠近灯焰,拔出的棉塞、硅胶塞勿触及任何地方,动作要快、准、稳。平 时要勤观察勤做试验工作日志,详细记录试验内容,操作方法,经验体会, 渺 一 遇到污染,菌丝褐化的情况时,应马上剔除,勤于思考,分析原因并重新 接种。总之,试验的每一步都应严谨认真.另外,还可以采用浏览捕捉法、 追溯验证法多阅读相关期刊杂志,开拓视野。 制作培养基的过程中煮土豆的时间不宜过长,以免土豆中的小颗粒都 分布在滤液中,制作出的培养基易分层.在滤液中加入琼脂之后非常容易 糊,要不断的用玻棒触及烧杯底部搅拌。试管摆斜面时,培养基的上部必 须离硅胶塞有一定的距离,以减少试管在接种的过程中被污染的几率.湖北 中医药大学届硕士学位论文 第二部分茯苓菌株培养基的筛选研究 材料 .菌株 供试菌株为鄂号: .培养基 ..固体培养基 麦芽糖培养基:麦芽糖.,琼脂.,土豆,蔗糖,., .,水 土豆培养基:土豆.,蔗糖,琼脂,:。.,。,., 水 ., 普通培养基:蔗糖,蛋白胨.,琼脂,。.? .,水 ..液体培养基 麦芽糖培养基:麦芽糖 .,土豆,:..,蔗糖 . ,加水至 ,.?. 土豆培养基:土豆,蔗糖,..,,.,加水至 普通培养基:蛋白胨. ,葡萄糖,?.,:?. . ,加水至 方法 .固体培养 按上述固体培养基配方及常规配制方法配制好培养基.分装在小试管 .取出适当冷 和三角瓶中,于高压灭菌锅中./压力下灭菌 却,于无菌中倒皿并放置,确定无菌后接种,置于恒温培养箱中在茯苓菌种质 量标准和种质资源研究 下培养.培养过程中进行形态观察. .摇瓶液体培养 按上述液体培养基配方及常规配制方法配制好培养基.每种液体培养 基分装个 三角瓶中,每瓶 然后置于高压灭菌锅中. /压力下灭菌 .取出冷却,于无菌室中接种从斜面扩大培养 基中取种.用型弧往复式生物液体培养振荡器中进行摇瓶培养, 往返转速/,培养温度,培养过程中进行培养观察. 结论 .茯苓在固体培养基的生长情况与固体培养基的选择.如表,见附图 三 ’. 表固体培养基上茯苓的生长状况 从上表可以看出,茯苓在普通培养基和麦芽糖培养基上的生长状况 明显优于土豆培养基,普通培养基略好于麦芽糖培养基,故以普通培养基湖 北中医药大学届硕士学位论文 作为茯苓固体培养基对茯苓母种进行移接较好. .液体培养基的培养基的生长情况与液体培养基的选择.如表 表液体培养基上茯苓的生长状况 普通培养基 土豆培养基 时间/ 麦芽糖培养基 从表中可知,在麦芽糖液体培养基中,菌丝生长情况和结苓最好, 因此应茯苓的最佳液体摇瓶培养基是麦芽糖液体培养基.第三部分茯苓菌株 的酯酶同工酶研究 .材料 .实验菌株为第一部分中的个菌株见附表四 .主要试剂及其配制‘’耵 表主要试剂及其配制 样品提取缓冲液.:称取.碳酸氢二钠 :.? :,.磷酸二氢钠:.?,溶于水中,并稀 释至. 过硫酸铵溶液:称取.过硫酸铵,溶于水中,并稀释至。现 配,?下最多可贮放两周 ,用蒸 分离胶缓冲液.: .,., 馏水溶解定容至,?保存. 分离胶贮液:丙烯酰胺.,,一甲叉双丙烯酰胺.,用蒸 馏水溶解定容至,棕色瓶?保存. 浓缩胶缓冲液.: .,.,,用蒸馏 水溶解定容至,?保存. 浓缩胶贮液:丙烯酰胺.,,一甲叉双丙烯酰胺.,用蒸馏 水溶解定容至,棕色瓶?保存. 澳酚蓝指示剂:澳酚蓝.,加.的氢氧化钠溶液.使之溶湖北中医药大学届硕士 学位论文 解,用水稀释至。 电极缓冲液.: .,甘氨酸.,用蒸馏水溶解定容 至,保存,使用时稀释倍。 酯酶显色液:、一醋酸萘酯各溶于的丙酮,坚牢兰 盐溶于./.的磷酸盐缓冲液中,混合,现配现用。 %乙酸溶液:冰乙酸,加蒸馏水定容至. 。 %的蔗糖溶液:蔗糖加蒸馏水定容至 。 磷酸盐缓冲液./,.:称取.,. 溶于水稀释至。 石英砂 .培养基 培养基和麦芽汁培养基 .主要仪器 本试验所用的仪器名称、型号及其生产商如表所示: 表试验所用的仪器名称、型号及其生产商用过滤纸吸干水分,称取菌丝.放入 研钵中,再加入适量液氮充分研 磨菌丝体至粉末状,用.的离心管分装,加入等量质量/体积研 / ,小心抽取上清液, 磨液.充分混匀,离心 与蔗糖溶液和澳酚蓝溶液按::混合,即得同工酶电泳样品乜?. .凝胶制备 ..分离胶和浓缩胶配方组成如表 表分离胶和浓缩胶配方 浓缩胶组成/ 分离胶组成/ ..灌胶 ...先灌分离胶待凝固后再灌浓缩胶.灌胶前接通冷却水,夹紧连接 上下贮液槽的两根橡皮管. ...用细头滴管吸取胶液,沿长、短玻璃板中间缝隙从一端加入胶液. 为防止产生气泡可稍拾起另一端气泡往高处走,不断加入胶液.若分