3-细胞吞噬和酸性磷酸酶染色

报告成绩    实时记录成绩    实验三 细胞吞噬和酸性磷酸酶染色（Gomori氏法） 学生姓名      学号    班级    座位号：        同组同学            日期： 2014 年 10 月 21 日 备注：                                                            【Introduction】 （1）细胞吞噬在生命活动中的作用和意义：吞噬细胞可以抵御外来物质的入侵，也能发挥特异性免疫的作用。单细胞动物通过细胞吞噬作用摄取营养物质；高等动物通过巨噬细胞的吞噬作用防御微生物的侵入，消除衰老和死亡的细胞。 （2）溶酶体的概念和生理作用：溶酶体是普遍存在于所有动物细胞（哺乳动物的成熟红细胞除外）中的细胞器。主要功能有：消化营养保护作用、对细胞内吞物质的消化、对细胞自身物质的消化、参与机体组织器官的变态和退化、参与受精作用、参与激素的合成和浓度调节。 （3）酶细胞化学实验技术的原理及其实验注意点：酶细胞化学是利用细胞内酶具有催化某种反应的特性来检测酶活性。在一定条件下酶进行催化产生可见的沉淀物，最后被光镜或电镜识别，以此来研究酶的定位及活性变化。在实验时，要注意实验的温度、pH值、固定剂、抑制剂或激活剂、底物浓度、作用时间、避免扩散，使细胞的形态结构保存良好，并保持酶的活性。 【Materials & methods】 实验仪器： 复式双筒显微镜（带油镜）；Motic数码互动系统；擦镜纸/盖玻片；载玻片/镊子；记号笔；小片滤纸；移液器/吸头；香柏油/二甲苯；高速离心机2台；温箱1台（30 ℃ ）；水浴锅2台（37 ℃ ）；烘箱1台（100 ℃ ）。 实验材料：四膜虫培养液（500μl）； 0.1%油烟墨汁（500μl）；2%豆奶液（200μl）。 实验试剂：10%甲醛溶液；酸性磷酸酶作用液；0.2%硫化铵水溶液（现用现配）；蒸馏水；亮绿。 实验操作： 1．ACP染色： （1）吞噬：吸取200μl四膜虫培养液加入豆奶中→离心→快速弃去上清液。 （2）制片：吸取10μl悬浮液滴在载玻片上→设置对照组→干燥→在甲醛中固定→蒸馏水浸洗。 （3）反应：空白对照在100度烤箱中干烤→所有标本放入酶作用液→实验组37度水浴10分钟，对照组采用其他温度→反应完毕在自来水中浸泡。 （4）显色：放入0.2% (NH4)2S中，实验组显色60秒，对照组采用其他时间→反应完毕在自来水中浸泡→彻底干燥后40倍镜检。 2．四膜虫吞碳： （1）吸取10μl四膜虫培养液于载玻片上→10倍镜观察→加入20μl墨汁→混匀→10倍镜观察 （2）涂布开→干燥→亮绿染色20秒→自来水中浸洗1分钟→干燥后40倍镜观察 【Results】 1． ACP染色：40倍物镜下，可观察到实验组的四膜虫细胞内有许多深棕色的小泡。 生物绘图请见附录。 2．四膜虫吞碳：10倍镜下，可观察到四膜虫不停游动，吞噬碳粒。 亮绿处理后，在40倍物镜下可观察到四膜虫细胞中有大小不同的黑色碳粒。 【Discussion】 1. 讨论实验为何出现所得结果。若实验结果不理想，请分析是何原因？如何改进？ 答：由下表一分析可得，硫化铵显色的时间不能太久，最好控制在30秒左右，否则颜色过深。另外，酶作用的时间如果太长，可能引起产物的扩散，使颜色过深；酶作用的温度太低，也会对结果产生一定的影响，使颜色过浅。 序号 结果 分析 1 空白对照 温度（37℃）硫化铵（30s） 细胞呈淡黄褐色， 无吞噬泡形成的迹象 100℃烤了10分钟，酸性磷酸酶变性失去活性， 不能分解β-甘油磷酸磷生成磷酸盐沉淀 2 温度（37℃）硫化铵（30s） 可见四膜虫细胞内有许多 深棕色的小泡 此反应条件下观察较恰当， 小泡就是吞噬溶酶体，酸性磷酸酶所在的位置 3 温度（37℃）硫化铵（60s） 四膜虫内有一些深棕色小泡， 中间还有深棕色团块 此温度下显色太过， 有吞噬溶酶体，但是产物已经扩散 5 温度（4℃）硫化铵（30s） 四膜虫内有一些浅色小泡， 此温度下显色不够， 有吞噬溶酶体，但是不明显 6 温度（4℃）硫化铵（60s） 四膜虫内有一些深棕色小泡， 中间还有深棕色团块 此温度下显色太过， 有吞噬溶酶体，但是产物已经扩散 表一 当酶作用时间10分钟时，不同条件处理后的四膜虫 2. 对该实验有何意见或建议？ 答：整个实验流程还是比较紧凑有序的，只是在酶作用的时间上最好做一下调整。因为从实验结果来看，原先安排的20分钟太长了，可能会导致酶产物扩散，我认为10分钟是比较合适的。另外，对照组的显色时间最好再安排一个梯度，比如45秒。 【Questions】 1. 如果标本在工作液中孵育时间过久，可能会出现什么现象？ 答：如果标本在酸性磷酸酶作用液中孵育过久，可能会造成酶和产物扩散以及核染色现象，镜检时就会出现较大的棕黑色团状，影响观察效果。 2. 实验结果中观察到是深色物质就一定是酸性磷酸酶吗？ 答：不一定。因为空白对照组中也能观察到四膜虫细胞呈淡黄褐色，说明细胞中有酸性磷酸酶之外能显色的物质。理论上来说，只要有磷酸基团的存在，就能与铅离子结合生成无色的磷酸盐沉淀，磷酸盐再与硫化铵作用，生成棕黑色的硫化铅沉淀，从而显示出深色。 3. 还有什么 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 可以定位酸性磷酸酶？ 答：还有偶氮偶联法。在酸性条件下，酸性磷酸酶将基质中的磷酸萘酚AS-BI水解，释放萘酚AS-BI，萘酚AS-BI，萘酚AS-BI与六偶氮付品红偶联，形成不溶性红色沉淀，定位于胞质内。如果细胞的胞质呈红色为阳性反应，无红色为阴性反应。[1] 偶氮偶联法是显示各种酶类最重要的方法。 【References】 [1] 叶裕春,谢竞雄,王耀平,宋德莲,胡琴. 偶联偶氮(取代萘酚)法显示白细胞硷性磷酸酶活性的初步观察. 上海医学. 1980年10期. 实验三 细胞吞噬和酸性磷酸酶染色（Gomori氏法） 学生姓名      学号  班级   座位号：     同组同学            日期： 2014 年 10 月 21 日 【Real-time Record】 流程 具体步骤 备注 1吞噬 吸取混匀的四膜虫培养液200μl加入到含有2%豆奶液的离心管中，反复吹打3次混匀，盖好管盖，管盖上做本组标记，放置7分钟。 3000rpm 离心1分钟，谨慎取出离心管，迅速吸取上清200μl弃入水槽。然后吸取余下200ul液体，对着底部沉淀缓慢吹打，如此反复几次，将沉淀悬浮于所剩的200ul豆奶液中。 2制片 取以上悬浮液10μl，滴于一张干净的载玻片的下方，涂布成直径约1cm左右的圆。两片标本置30℃ 温箱中15分钟，令其彻底干燥。 每人做2片：①实验组T ②阴性对照C（加热使酶失活） 3固定 将所有标本于10%甲醛溶液中固定10分钟，取出，放蒸馏水中1分钟，充分洗去上面残留的固定液。 4反应 取空白对照组做记号，于100℃干烤10分钟（使酶失活）。其他标本置于室温。 将所有标本片放入酶作用液的染色缸中，将染色缸置于37℃水浴（预热），给定时间20分钟。 到设定时间后将指定标本片放入自来水中浸泡，1分钟。换水后重复一次操作。 5显色 将指定标本片放入0.2% (NH4)2S中，给定显色时间1分钟。标本片放入自来水中浸泡，1分钟。换水后重复一次操作。 6 镜检 以小滤纸片吸干玻片背面的水，待彻底干燥后用显微镜观察。注意标本间的差异。