薄层层析

薄层层析 薄层层析操作要点 铺板 铺板用的匀浆不宜过稠或过稀:过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹;过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1:2,3，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载;涂层厚，显色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。 点样 尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。 展开剂配制 选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如:取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。 展开系统的饱和 一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快。 温湿度的控制 温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。湿度的影响，估计主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性(容量因子)的变化，湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。 薄层色谱法 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 操作规程 依据:《中华人民共和国药典》2000年版二部。 内容: 1 简述:薄层色谱法，是将适宜的固定相涂布于玻璃板上，成一均匀薄层。等点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别，杂质检查或含量测定的方法。 2 仪器与材料: 2.1 玻板:除另有规定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的规格，要求光滑，平整、洗净后的不附水珠，晾干。 2.2 固定相或载体:最常用的有硅胶G、硅胶GF、硅胶H、硅胶HF254，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。其颗粒大小，一般要求直径为10—40µm。薄层涂布，一般可分无粘合剂和含粘合剂两种;前者系将固定相直接涂布于玻璃板上，后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10—15%煅石膏(CaSO4?2H2O在140?烘4小时)，混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.5—0.7%)适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定展开液或缓冲液的薄层。 2.3 涂布器:应能使固定相或载体在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。 2.4 点样器:常用具支架的微量注射器或定时毛细管，应能使点样位置正确集中。 2.5 展开室:应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，应便于观察。 3 操作方法: 3.1 薄层板制备:除另有规定外，将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的泡后，倒入涂布器中，在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布(厚度为0.2—0.3mm)，取下涂好薄层的玻璃板，置水平台上于室温下晾干，后在110?烘30分钟。即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度(可通过透射光和反射光检视)。 3.2 点样:除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，点样直径为2——4mm，点间距离约为1.5—2.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。 3.3 展开:展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按正文规定操作。将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5—1.0cm(切勿将样点浸入展开剂中)，密封室盖，等展开至规定距离(一般为10—15cm)，取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测，如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量，则可用薄层扫描法。薄层扫描的方法，除另有规定外，可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明，结合具体情况，选择吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多，故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，进行比较并计算定量，以减少误差。各种供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。 4 注意事项: 4.1 所用玻璃板应洗净不挂水珠，光滑平整。 4.2 铺板要均匀，厚度适宜，并于室温下晾干后在110?活化30分钟，置于有干燥剂的干燥箱或干燥器中备用。 4.3 点样点一般为圆点，不能太大。 簿层色谱(TLC法) 二、基本原理 这是利用吸附剂(硅胶、氧化铝等)对不同组分吸附能力的差异从而达到分离目的的方法。 三、操作要点和说明 薄层色谱法的整个过程包括以下步骤: 1、薄层板的制备 制薄层板的主要原料是吸附剂和粘结剂 吸附剂:最常用于 TLC的吸附剂为硅胶 GF254; 硅胶HF254。 粘结剂:一般用所羧甲基纤维素钠(CMC)，也有用淀粉的。CMC 为粉状固体，用时先加水，水浴上熬成糊状，配成1,水溶液。 制板:(1)小板的制备:将硅胶加 1, CMC，调成桨状(在平铺玻璃板上能晃动但不能流动)，将其涂在载玻片上( 75 X 25)，为使其坦平，可将载玻片用手端平晃动，致坦平为止，放在干净平坦的台面上，晾干之后放入110?烘箱活化1小时即可使用(一次可做很多块)。 (2)大板的制备:略 2、点样 点样用的毛细管为内径, lmm的管口平整的毛细管，将样品溶于低沸点的溶剂(乙醚、丙酮、乙醇、四氢呋喃等)配成1,溶液。 点样前，可先用铅笔在小板上距一端5mm处轻轻划一横线，作为起始线，然后用毛细管吸取样品在起始线上小心点样，如需重复点样，则应待前次点样的溶剂挥发后方可重点。若在同一块板上点几个样，样品点间距离为5mm以上。 3、展开 展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑。薄层的展开在密闭的容器中进行。先将选择的展开剂放入色谱器中(小板可用广口瓶代替)，使色谱器内空气饱和5,10min，再将点好试样的薄层板放入色谱器中进行展开，点样的位置必须在展开剂液面之上，当展开剂上升到薄层的前沿(离前端 5,10mm)或多组分已明显分开时，取出薄层板放平晾干，用铅笔划溶剂前沿的位置后，即可显色。 4、显色 如果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点。如果本身无色，可先在紫外灯光下观察有无荧光斑点(有苯环的物质都有)，用铅笔在薄层板上划出斑点的位置;对于在紫外灯光下不显色的，可放在含少量碘蒸气的容器中显色来检查色点(因为许多化合物都能和碘成黄棕色斑点)，显色后，立即用铅笔标出斑点的位置。 5、用 TLC跟踪有机反应 在同一块板上点上原料样和反应混合物样(均需配成稀溶液)，按上述方法进行展开和显色，记下原料样的斑点位置和反应混合物样中相应斑点的位置和大小。过一定时间后，再取反应混合物样液点样、展开、显色，如发现反应混合液样中相应于原料斑点的位置处，无斑点或斑点变小，则说明反应已经完成或接近完成，所以依此可跟踪有机化学反应。这在有机合成上很有意义。 薄层层析(TLC) 薄层层析是将吸附剂或者支持剂(有时加入固化剂)均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。把欲分离的样品点在薄层上，然后用适宜的溶剂展开，使混合物得以分离的方法。由于层析 在薄层上进行故而得名。 薄层层析是一种微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。 根据分离的原理不同，薄层层析可以分为两类:用吸附剂铺成的薄层所进行的层析为吸附薄层层析;用纤维素粉、硅胶、硅藻土为支持剂铺成的薄层，属于分配薄层层析。 薄层层析中以吸附薄层为多用，吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。 TLC? 吸附TLC?固定相为吸附剂?氧化铝、硅胶。(较多用) TLC? 分配TLC?固定相为液态(水)?固定相吸苷在支持剂上。 (一)吸附薄层的基本原理: 吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同，及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离。 吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附强度决定于吸附剂的吸附能力，还受被吸附成分的性质影响，更与展开剂的性质有关。 1.吸附薄层层析:在硅胶薄层板上，样品中的两成分是两种结构近似的染料，在展开剂四氯化碳的作用下。在展开剂和薄层板之间不断地产生吸附、解吸，再吸附，再解吸，„„。由于对氨基偶氮苯的极性比偶氮苯的极性稍强一些，层析的结果，对氨基偶氮苯受到的吸附作用稍强于偶氮苯，从而将两者分离。 展开结束以后，会在薄层板上形成两个斑点，混合物中的成分得以分离。 中药中的有效成分复杂多样，结构近似者不少。特别是对未知结构的成分分析，设计并摸索出合理的层析条件是首要任务。只有先设计出可用的层析条件，再经摸索改进，超乎想像的新武 才可能对未知或者已知成分进行成功地分离。然后才能谈得上进一步的分析研究。 要设计出合理有效的层析条件，必须熟悉薄层层析条件的选择的基本要领。下面对薄层层析条件的选择做一初步介绍。 薄层层析的三项基本构成物质是:样品组分、吸附剂、展开剂。摸索层析条件，实际上是协调上述三者的关系，寻求一种能够有效分离样品组分的配合 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 及实际操作要领。很明显，一切层析都是针对分析任务，也就是围绕待分离的样品组分来进行调整适应的。可见，层析条件的选择是以样品中的各组分为中心，适当调适展开剂的吸附剂的极性来实现的。 (二)薄层层析条件的选择:基本思路是根据待分离样品组分的极性来确定吸附剂的极性(类型、活化度)和展开剂的极性(主要溶剂、调节溶剂、辅助溶剂等)。 要得到理想的薄层层析结果，首先要协调、处理好吸附剂、展开剂、及被分离成分三者之间的关系 1.吸附剂:对吸附剂的基本要求是颗粒细致、大小均匀(亦即有较大的表面积和适当的吸附活性);不能与样品组分、样品溶剂、展开剂发生化学反应;更不能与溶剂及展开剂发生溶解。(注:实际操作中，可通过选择不同的活化温度对吸附剂活性进行调节。) 最常用的吸附剂是,,,和,,,,。另外，市场上还有氧化镁、硅酸镁、碳酸镁、硅藻土、活性炭等。其中，只有活性炭是非极性吸附剂，其余均是极性吸附剂。它们对水和极性大的化合物吸附能力强。 (1)氧化铝:化学式为Al2O3，国产层析用氧化铝有碱性、中性、酸性三种，以中性氧化铝应用较广。 氧化铝的特点: ? 氧化铝为吸附力较强的极性吸附剂，它适用于中性或者碱性的亲脂性化合物的分离。通常氧化铝的吸附能力与其自身的含水量有关。含水越多，吸附活性越小，吸附能力越小。氧化铝根据其含水量多少将其活性划分为五级。 ? 氧化铝的吸附能力与其自身的含水量有关 (2)硅胶:表达式为SiO2?XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基(,Si,OH)，这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。 特点: ?.硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。如对有机酸、挥发油、萜类、皂苷、黄酮、蒽醌、氨基酸等成分的分离适用，不能用于生物碱等碱性物质的分离。 ? 硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。 由于结构的决定作用，氧化铝的活化温度可以很高(150?,160?)，而硅胶的活化温度却不能太高(105?,110?)。一旦超过500?，硅醇基会相互脱水而失活。 ? 硅胶的活化温度通常为105?,110?，不能过高。 根据样品的酸碱性和极性大小确定了吸附剂以后，正确选择展开剂也是保证层析较好的分离的重要条件。 1.展开剂:薄层层析中用来将样品展开的溶剂。 展开:用极性适当的溶剂浸润已经点了样品的薄层板一端，凭借毛细作用带动样品在薄层板上移动，最终使样品分离的操作过程。 展开剂常是由两种或者两种以上的溶剂铵一定的比例组成的溶剂系统。简称溶剂系统或展开所用的溶剂。 “展开剂”,“溶剂系统”,“溶剂”;“展开”,“展开过程” 在吸附薄层中，化合物在吸附薄层上移动的速度与展开剂的极性有关。展开剂的极性越大，化合物移动的速度越快，展开剂的极性越小，化合物的移动速度慢。 众所周知，普通高中要出较好的高考录取升学率，一要有良好的教学条件，二要有有经验的任课老师，三要能招来基础好的实践初中生。同理，薄层层析要得到较好的展开效果，必须依据所要分离的样品来正确选择层析条件，对样品的极性进行认真研究，以确定及实验摸索适宜的吸附剂、展开剂。 2.被分离成分:分析任务所要完成分离的样品中的有效成分。 被分离成分的极性决定于其母核结构类型及官能团极性。如果吸附剂活性和展开剂活性固定不变的条件下，被分离成分的极性越大，吸附剂对其作用越强，展开距离越短;被分离成分极性越弱，吸附剂对其作用越大，展开距离越大。 一些基团的极性相对大小顺序已经在课本P31列出。当然，具体物质的极性大小判断时，还要结合分子结构的具体情况进行判断。 总之，选择层析条件时，必须针样品中对被分离成分的极性，试行判断或确定吸附剂种类和活性，再探索配制展开剂。 在选择层析条件时，必须根据样品、展开剂、被分离物质三方面缩合考虑。 历史上吸附层析出现最早，是由俄国生物学家茨维特用碳酸钙作为固定相，石油醚作为流动相来分离植物色素的。除了吸附层析之外，另一经典的层析法是以液体作为固定相的液相层析。液体固定相(多为水)被吸苷在固态载体物质上，这些载体物质多是一种多孔性物质。这些液态固定相被载体固定在柱中，就成为液,液分配柱层析。 (三)分配薄层层析:用极性溶剂吸苷在固体支持剂上所形成的混合物，铺成薄层(或装柱)，然后活化、点样(或上样)，再用极性较弱的展开剂(或洗脱剂)进行展开。 分配层析的一般原理:在展开过程中，各成分在固定相和流动相之间作连续不断的分配，由于各成分在两相间的分配系数不同，因而可以达到相互分离的目的。 以CS表示某成分在固定相中的浓度，Cm表示某成分在固定相中的浓度。则 分配系数 K,CS/Cm 载体应该具备的基本条件:中性、多孔粉末、无吸附活性、在洗脱剂之中不溶解;所能够吸收固定相的量，最好能达载体本身重量的50%以上;能使流动相自由的通过载体所吸收的固定相，并且不改变溶剂系统的组成。能够满足这些条件的载体是硅胶、硅藻土、纤维素粉等。 分配层析所用的固定相一般为水及各种水溶液(酸、碱、盐与缓冲液)、甲酰胺、低级醇(亲水性)等。 分配层析所用的流动相选用与水不溶(或微溶)的有机溶剂。如石油醚、苯、卤代烷类、脂类、酮类(如丁酮)、醇类(丁醇、戊醇)等或者它们的混合物。 分配层析对混合物中各成分的分离，主要决定于各成分分配系数的差异，一般说来，对于种类成分均能适用，特别能适用于水溶性、亲水性物质而又稍能溶于有机溶剂中者。这样就恰好弥补了一般吸附层析(如氧化铝吸附层析适用于亲脂性物质)的不足。但是，由于分配柱层析样品处理量较少，因此，如能用吸附柱层析解决问题时，常优先使用氧化铝或硅胶吸附柱层析。 一般分配层析的条件可以由PC来摸索，再应用于分配柱层析。 (四) 薄层的制备: 1(基板的规格和构成:5×15?、5×20?、10×10?、20×20?大小的玻璃板或者不锈钢板、塑料板。 2(薄层板的分类:软板(制板时不加粘合剂)、硬板(制板时加入粘合剂)。 3(软板的制备:详见P32。 4(硬板的制备:详细演示、介绍手工铺板，了解薄层涂铺器的使用方法。 (五) 薄层层析的操作步骤: 1(点样: ? 样品的溶解:将样品溶于展开剂极性相近、挥发性高的有机溶剂。 ? 薄层点样:用毛细管(0.5mm以下)或用专业点样器进行点样。 点样的要求:样点位置应在距离底边1-1.5cm处;点样量适当;样点直径小于2-3mm;间隔反复点样;多个样点时，间隔为2cm且处于同一条直线上。 经验做法:可先在PC或TLC点上不同量的样品，并展开、显色后观察分离情况，以此确定最佳样品用量。 2(展开:当样点上的溶剂充分挥干后，将薄层放置在密闭容器中，使适当的展开剂从薄层的一端向另一端进行浸润展开的过程。 要求:密闭容器可选用层析缸、标本缸、标本筒等;展开方式有上行法、下行法之分，展开方向有单向、双向、多次展开等。详见P33。 注意事项:先悬空饱和、再入液展开;样点不能泡在展开剂中;薄层浸入时不能歪斜进入。 3(显色:用适当的方法或者适当的显色剂处理薄层，使其上可能已经分离的各成分斑 点显示出来，以方便计算各个斑点的比移值，从而提供定性与定量的依据。 显色的基本步骤是:一看、二照、三碘、四显，荧光背景也常见。详见P34。 4(比移值的计算与定性、定量:展开结束后，经过各种显色操作后，样品中各个成分的斑点可能出现了不同程度的分离，为了表达各成分的相对位置(极性)通常以比移值作为称量斑点位置的指标。比移值的符号为Rf: Rf,(斑点中心与原始样点之间的距离)/(溶剂前沿与原始样点之间的距离) 注意事项:薄层层析的Rf 值受多种因素影响，即使严格按照实验要求做了，结果的重现性仍较差。因此，薄层定性时常与标准品一起点样进行对比分析。