D1S80座位的等位基因扩增片段长度多态性分析

D1S80座位的等位基因扩增片段长度多态性分析 摘要 目的: 对天津地区 112 名无关个体的 D 1S80 基因座位进行了扩增片段长度多态性分 析, 检测其等位基因和基因频率。 方法: 应用聚合酶链反应, 小型聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染方法 观察长度多态性。 结果: 发现了 26 个等位基因, 大小在 355, 771之间, 基因频率为 0. 0045,bp 0. 1384, 杂合度为 73% 。70 种基因型, 个人鉴别力为 0. 985。对 6 个家系 23 名相关个体的分析结果 符合孟德尔定律。 结论: 180 基因座位个人鉴别力高, 方法简便、灵敏, 可在个人识别和亲 D SPCR 子鉴定中发挥重要作用。 关键词扩增片段长度多态性 聚合酶链反应; D 1S80 基因座位; 对 人 类 基 因 组 的 研 究 已 揭 示 了 越 来 越 多 的 P rim er 1: 5’GAA CT GAGCCTCCAA CA CAT GCCCGCC G 3’ 片段表现出高度的多态性, 一些多态性座位 DN A 2: 53P rim er ’GT T CGTT T GGA GA G TCA CG TGCCCC T TGC ’ () 含有可变数目串联重复序列 , 是由一些非 V N T R 在 25反应体系中 95?, 5变性后 进 PCR Λl m in 1 编码核苷酸序列组成, 这些基因座位有个体差 入 循 环: 92?, 1; 68?, 1; 72?, 2共m inm inm in 异, 可用于个人识别。 又因其遗传规律遵循孟德尔 35 个循环, 最后 72?延伸 5。m in定律, 故又可用于亲子鉴定。选择与位点两 V N T R 扩增产物的检测: 利用聚丙烯酰胺凝胶垂直电 ) ( 端互补的序列作为引物经 聚合酶链反应扩 PCR 泳, 银染显色的方法检测扩增产物。 增出的片段长度有个体差异, 这称为扩增片段长度 2 () 多态性 2。 作为“基因指纹”在公检法 A m p FL P 2 结果 (工作中的侦破案件、指证正凶、判定遗产继承 亲权 本文对天津地区 112 名无关个 体 血 液 DN A) 鉴 定等 许 多 方 面 得 到 广 泛 应 用。 本 文 用 2A m p 进行座位的2分析, 该座位具有高 180 D SA m p FL P 技术扩增了 基因座位, 分析了该座位 180 FL P D S度的多态性。已发现有 26 个等位基因, 其扩增片段 的多态性。调查了天津地区 112 名无关个体和 6 个 长度分布于 355, 771之间, 基因频率为0. 0045bp 家系 23 名相关个体的等位基因及基因频率, 为今 () , 0. 1384 见表 1 和图 1, 杂合度为 73% 。后开展亲子辨认、个体识别及刑侦物证等法医学鉴 定奠定基础。 表 1 天津地区 112 名无关个体 D 1S80 座位基因频率 1 材料与方法等位基因 等位基因 1. 1 材料 序号 频率序号 频率 ()以核心单元数编号 ()以核心单元数编号 标本: 在天津地区取 112 个无血缘关系的中国 人的静脉血, 抗凝, 部分用肝素抗凝; 家系 ED TA ( ) ( ) 1 13 3550. 017914 26 5630. 0491A bp A bp 血样由本室自愿者提供。 ( ) ( ) 2 14 3710. 022315 27 5790. 0179A bp A bp ( ) ( ) 3 15 3870. 075916 28 5950. 0536A bp A bp 试剂: 均为进口或国产分析纯试剂( ) ( ) 4 16 4030. 062517 29 6110. 0446A bp A bp 1. 2 方法( ) ( ) 5 17 4190. 040218 30 6270. 0536A bp A bp 全血 的提取: 将 200新鲜抗凝全血用DN A Λl ( ) ( ) 6 18 4350. 116119 31 6430. 0134A bp A bp ( ) ( ) 7 19 45210. 031320 32 6590. 0089A bp A bp ( ) ( ) 8 20 4670. 035721 33 6750. 0045A bp A bp ( ) ( ) 9 21 4830. 062522 34 6910. 0045A bp A bp 3 法提 取 即 用 含 2100、, T KM DN A T r ito n X KC l( ) ( ) 10 22 4990. 035723 35 7070. 0045A bp A bp () 和的 缓冲液 即 裂解液处理, 然 M g2C l T E T KM ( ) ( ) 11 23 5150. 138424 36 7230. 0223A bp A bp 后用 10% 溶液和饱和 溶液温育去除蛋 SD S N aC l ( ) ( ) 12 24 5310. 022325 37 7390. 0134A bp A bp ( ) ( ) 13 25 5470. 040226 39 7710. 0089A bp A bp 白, 室温离心上清以乙醇沉淀 。所得 沉DN A DN A 淀干燥后溶于 40Λl ddH 2O 中, 置 4?备用。 座位序列的扩增: 引物的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 180 D S ) 它是由许多碱基排列顺序相同的重复序 , reg io n s 列单位重复排列组成的, 含有这种重复序列的结构 (叫 可 变 数 目 串 联 重 复 V a r iab le m em b e r s o f ten2 ) 不同个体的相同等位基因, , dem rep ea t sV N T R 等 上串联重复单位的重复次数不同将导致 DN A 位片段长度不同。 目前已发现许多多态性 V N T R 5 区, 如 染 色 体 2 上 的 、染 色 体 17 上 的3A poB ’ 2 和染色体 1 上的 等。1730180 D SD S 结构多态性分布在不同染色体上, 按孟DN A 特定结 德尔规律由亲代遗传给子代, 子代的 DN A 构均来自双亲。这种符合孟德尔遗传规律的具有个 图 1 天津地区 112 名无关个体 D 1S80 座位的基因频率分布 体特异性的 多态性便是进行 分析做个 DN A DN A 体识别和亲子鉴定的理论基础。 根据理论计算, 该座位可能组成的基因型为 () 是一个由核心序列 组 180 D SGN N GT GGG 2 26 = 351 种, 在 112 名个体中我们观察到 70 + 26 C 成的 座位, 其可以通过限制酶切、电泳、探V N T R 种基因型, 其中最多见的是 A 18 和 A 23 组成的基 针分子杂交的方法进行分析, 表现为限制性片段长() 因型 见表 1。()度 多 态 性 。 但 此 法 所 需 的 样 本 量 较 大 R FL P () 300以上, 检材分子必须完整未降解, 实 Λg DN A () 用 值 识别率计算 D P D isc r im in a t io n pow e r 验周期长, 操作复杂; 灵敏度不太高, 且标记探针常 4 () 公式 , 1951求得该基因座的 值:F ish e rD P n 用的同位素有害健康 , 需特别防护。 聚合酶链式反 = 1- = 01985D P 6 P i 2 i= 1 () 应 技术的建立为解决这一问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 提供了新的 PCR 6 个家系 23 名相关个体的 D 1S80 基因座 对 途径。 选择设计与 座位两侧互补的 180 D SV N T R 位扩增片段进行分析, 孩子出现的谱带分别来自父 序 列 合 成 引 物, 在 耐 热 聚 合 酶 的 作 用 下 对DN A ()母亲, 符合孟德尔遗传规律 见图 2。 靶序列进行扩增, 扩增产物采用凝胶电泳、溴 DN A 化乙锭或银染显示 DN A 扩增片段, 可测出 D 1S80 ( 的 扩 增 片 段 长 度 多 态 性 22A m p lif iedF ragm en t ) 2此 法 简 单、快 , , L en g th Po lym o rp h ism A m p FL P 速、灵敏。 在方法学上本文进行了有益的探索。过去常规 检材 的提取是用蛋白酶 将检材置 37?消 DN A K 化 5, 游离出染色体 用饱和酚萃取 2 次, 除 , h DN A 去蛋白质等成份, 再用氯仿萃取 2 次, 除去残存酚 等杂质。 分出水相, 加入含醋酸钠的冷乙醇以沉淀 。该方法繁琐, 费时, 且需接触饱和酚、氯仿等DN A 采 用 有毒 化 学 物 品。 本 实 验 室 提 取 全 血 DN A 3 法 需血量至多 200或更少, 快捷、省时,, T KM Λl 且不用酚- 氯仿抽提, 结果完全可靠。 ()同家系相关个体多态性分析 : 片段长度的标志物 图 2 M 以往有些文献检测等位基因采用琼脂糖凝胶 电泳, 染色, 分辨率低, 且 毒性较大。本文用 EB EB 以上结果表明, 180 的 2在中国人 D SA m p FL P 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 银染方法检测, 分辨率大大 群中具有较高的识别能力, 在法医个人识别、亲子 高于琼脂糖凝胶电泳和 染色, 且灵敏度提高, EB 鉴定等方面均具有重大的实用价值。 减少 污染。EB 3 讨论 在分析的样品中纯合子的扩增产物只有一条( 在 分子上有许多高变区 DN A h yp e rva r iab le 量改变而改变, 亦无遗传 分析, 对今后在该地区进行亲子鉴定和个人识别提 稳定的, 不因扩增 DN A 供了依据。关系, 不干扰 D 1S80 基因座位的分析。 根据 等的报道, 在人类的 基 180 参 考 文 献M cC lu re D S 1 N ak am u ra Y, L epp e r t M , O ’Co nneu P , e t a l. V a r iab le num be r 因座位至少存在 29 个等位基因, 可组成 435 种基 () . o f tandem rep ea t V N T R m a rk e r s fo r h um an gene m app ing 因型, 值在 0. 95, 0. 98 之间。 在我们分析的D P , 1987, 235: 1616Sc ience 112 名无关个体中发现 26 个等位基因、70 种基因, , , . H o rn GT R ich e rd s B K lingge r KW e t a l A m p lif ica t io n o f a 2 型、杂合性为 0. 73, D P 值为 0. 98, 说明了 D 1S80 h igh ly po lym o rp h ic V N T R segm en t by th e po lym e ra se ch a in . , 1989, 17: 2140具有高度的多态性。 根据计算, 26 个基因可组成 reac t io nN uc le ic A c id s R e s 程志强, 蔡军, 蔡芳, 等. 适于临床 PCR 法基因检测的血样处 3 351 种基因型, 我们只观察到 70 种, 如做更多个体 ( ) 理. 天津医科大学学报, 1996, 2 2: 18 的分 析, 还 会 发 现 更 多 的 基 因 型。 将 与180 D S 1 F ish e r RA S tanda rd cacu la t io n fo r eva lua t ing a b loo d g ro up 4 1 3 5等 座 位 进 行 比 、和 1730HL A DQ ΑA poB D S. , 1951, 5: 95sy stemH e red ity 较, 可见 的个人鉴别率最高。因此应用 180 , , , . D SV N 2 Bo e rw ink le E X io ng W J Fo u re st E e t a lR ap id typ ing o f 5 : tandem ly rep ea ted h yp e rva r iab le lo c i by PCR A pp lica t io n to 位点进行亲子鉴定及个人识别, 首选 位 180 T R D S3. th e apo lipop ro te in B ’ h yp e rva r iab le reg io n sP ro c N a t l A cad 点, 可信度达 98% 。如能联合检测其他基因座位可 , 1989, 86: 212Sc i U SA 进一步提高其可信度。( )1999203224 收稿 本文结果与 等人报道的在 67 例日本人 K a sa i 中发现 21 个等位基因, 大小分布在 387, 723之bp AM PL IF IED FRA GM ENT L ENGTH POLYM O RPH ISM A NALY S IS 180O F ALL EL ES O F LOCUS D S L i X u , Zh ao C ho n g, Zh an g J in gyu ( ), 300070I nstitu te of E nd ocr inology T ianj in M ed ica l U n iv ersity () A bstra c t O bjec t ive: T h e am p lif ied f ragm en t len g th po lym o rp h ism A m p - FL P o f lo cu s D 1S80 a2 112 . : m o n g u n re la ted T ianJ in ch in e se re siden t s w a s an a ly sedM e thod sT h is an a ly sis w a s p e rfo rm ed w ith - . : 26 , po lyac ry lam ide m in ige l e lec t rop ho re sis fo llow ed b y th e silve r sta in in gRe sultsa lle le sran g in g f rom 355 771 0. 0045 0. 1384 , 70 . to bp in size an d f rom to in f requ en cyan d geno typ e s w e re o b se rvedT h e h e t2 () 73% , 0. 98 . e ro zygo sity w a s an d th e d isc r im in a t io n pow e r D P w a s T h e stu dy o n six fam ilie s dem o n2 . : st ra ted th a t th is lo cu s w a s in h e r ited acco rd in g to M en de lian lawCon c lus ionT h e tech n iqu e u sed h e re is , , , . qu ite sim p lerap idex t rem e ly sen sit ivean d do e s no t requ ire th e u se o f rad io iso top e sIt co u ld p ro v ide a .pow e rfu l n ew too l fo r th e fo ren sic iden d if ica t io n o f in d iv idu a ls an d p a te rn ity te st in g Key word s lo cu s D 1S80; po lym e ra se ch a in reca t io n; am p lif ied f ragm en t len g th po lym o rp h ism