生物化学
实验一、蛋白质等电点的测定、蛋白质沉淀、变性及呈色反应
一、蛋白质等电点的测定
【实验目的】
掌握蛋白质的两性解离性质；初步学会测定蛋白质等电点的一种方法；掌握蛋白质变性与沉淀的关系。
【实验原理】
蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基酸的氨基 与羧基成肽键结合，但总有一定自由氨基与羧基以及酚基、巯基、胍基、咪唑基等酸碱集团，因此蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以两性离子状态存在，在电场内该蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的pH值，称为该蛋白质的等电点。当溶液的pH低于蛋白质等电点时，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的pH高于蛋白质等电点时，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。
由于在等电点时，蛋白质分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从而有利于悬浮液的过滤。在等电点外的所有其他pH值，依据蛋白质所带净电荷采用电泳和离子交换层析来分离和分离纯化该蛋白质。
蛋白质等电点多接近pH 7.0，略偏酸性的等电点也很多，如白明胶的等电点为pH 4.7；也有偏碱性的，如精蛋白的pH 10.5-12.0.在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。
【实验材料】
酪蛋白、醋酸钠、醋酸
【实验器材】
水浴锅，研钵，250ml容量瓶4个，试管8支，刻度吸管1或2ml 3支，5ml吸管2支，小滴管一支
【试剂配制】
1、0.4%酪蛋白醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白1.0g ，加少量蒸馏水在研钵中仔细研磨，将所得蛋白溶液移入200锥形瓶中，并用少量40℃-50℃的温蒸馏水洗涤研钵，将洗液也移入锥形瓶中，加入25ml 1mol/L醋酸钠溶液(20.5g醋酸钠溶于250ml容量瓶中)。把锥形瓶放入50℃水浴中，小心的摇动锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶中的溶液全部移至250ml容量瓶中加蒸馏水至刻度线，混匀。
2、1mol/L醋酸溶液（配置：若36%醋酸，取167ml加蒸馏水至1L即可；若是冰乙酸，则直接取60g,或取57.14ml加蒸馏水至1L）。
3、0.1mol/L醋酸溶液
4、0.01mol/L醋酸溶液。
【方法与步骤】
1.取同样规格的4支试管，按下表顺序分别加入各试剂，然后混匀。
试管号
蒸馏水(ml)
0.01mol/L醋酸（ml）
0.1mol/L醋酸（ml）
1mol/L醋酸（ml）
最终pH
1
3.4
0.6
------
------
5.9
2
1.5
------
2.5
------
5.3
3
3.0
------
1.0
------
4.7
4
2.4
------
------
1.6
3.5
2.向以上试管中加入含有酪蛋白的醋酸钠溶液1ml，加入试管后立即摇匀，并观察其浑浊度，1，2，3，4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。静置10分钟后，再观察其浑浊度并判断其等电点。
【实验结果】
注意各个试管的变化，分别用—，+，++，+++，++++表示各管沉淀量的多少，根据观察的结果，指出哪一个pH是酪蛋白的等电点。
【思考
题
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】
1、什么是蛋白质的等电点？在等电点时，蛋白质溶液的物理性质会发生什么变化？
2、利用蛋白质等电点时物理性质的变化，可以有什么实际的应用？
二、蛋白质的沉淀及变性及呈色反应
【实验目的】
加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识；掌握沉淀蛋白质的几种方法及实用意义；熟悉蛋白质变性与沉淀的关系。
【实验原理】
（一）蛋白质的沉淀反应
在水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层而形成亲水性的胶体颗粒，在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒的稳定因素被破坏或与某些试剂结合形成不溶解的盐后产生沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类：
1．可逆的沉淀反应：此时蛋白质分子结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后沉淀的蛋白质溶解于原来溶剂中，并保持天然性质。引起可逆沉淀的因素主要有：无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，此过程也称为盐析）、低温下与乙醇或丙酮短时间作用等。除去这些因素后，蛋白质又能溶解。分离提纯蛋白质时，常利用此类反应。
2.不可逆沉淀反应：在热、酸、碱、重金属盐、紫外线等作用下，蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质因变性而沉淀，除去引起的沉淀因素后，蛋白质不再溶于原来的溶剂中。
变性与沉淀的区别：变性强调构象破坏，活性丧失，但不一定沉淀；沉淀强调胶体溶液稳定因素被破坏，构象不一定改变，活性也不一定丧失，所以不一定变性。
（二）蛋白质的主要特征性颜色反应
1．双缩脲反应
双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)是两个分子脲(即尿素)经180℃左右加热，放出一个分子氨(NH3)后得到的产物。具有两个或两个以上肽键的化合物皆可与双缩脲试剂（碱性的Cu2+的溶液）产生紫色反应。蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色的络合物。颜色深浅与蛋白质浓度成正比。
2. 茚三酮反应
除脯氨酸、羟脯胺酸能与茚三酮反应生成黄色物质外，所有的α-氨基酸及蛋白质与茚三酮共热，则产生紫色的还原型茚三酮、茚三酮与氨的缩合物。此反应适宜的pH为5-7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同的pH条件下的颜色反应深浅不同，酸度过大时甚至不显色。该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
【实验药品】
蛋白溶液：10%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1：9）；3%硝酸银溶液；1％硫酸铜；10％Na0H；0.1％茚三酮乙醇液(0.5g茚三酮溶入500ml乙醇中)。
【实验器材】
试管、移液管，胶头滴管，烧杯，玻璃棒，电炉，试管架、试管夹、试管刷等。
【方法与步骤】
1.蛋白质的盐析
试管中加入少量10%卵清蛋白溶液，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀，加入水，观察沉淀是否溶解；
2.重金属离子沉淀蛋白质
取一支试管，加入蛋白质溶液2ml，加入硝酸银溶液1-2滴，震荡试管，立即产生沉淀，放置片刻后倾出上清液，向沉淀中加入少量的水，观察沉淀是否溶解；
3.双缩脲反应
取小试管一支，加1：10鸡蛋白液2滴、10％Na0H溶液5滴及1％硫酸铜溶液1滴，混匀后，呈紫红色的双缩脲反应。
4.茚三酮反应
取小试管1支，加1：10鸡蛋白溶液4滴，蒸馏水5滴和0.1％茚三酮乙醇液6滴，混匀，于沸水浴中加热约1分钟，待冷却后溶液即呈粉红色，以后慢慢变成紫色或蓝色。
【实验结果】
注意观察各个试管内的变化，主要包括是否变浑浊或者是沉淀，变浑浊或者沉淀后加入水或者试剂是否会溶解；试管内颜色是否变化，是什么颜色出现，颜色变化出现后是否稳定。
【注意事项】
1.注意实验的安全性，本实验需要沸水加热。
【思考题】
1.蛋白质沉淀和哪些因素有关，与蛋白质等电点有何关系？
2.蛋白质沉淀、变性、凝固三者之间的关系如何？
实验二、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
【实验目的】
掌握蛋白质含量测定的原理和方法；掌握分光光度法的原理及722型分光光度计的使用方法；
标准
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曲线法准确测定未知样品中蛋白质的含量
【实验原理】
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。
【实验药品】
绿豆芽、考马斯亮蓝G―250、结晶牛血清蛋白、NaCl、擦镜纸
【实验器材】
电子天平；分光光度计；试管架；试管6支；刻度吸管1ml或2ml 2支，比色皿；离心机、离心管、研钵；50mL容量瓶；50mL小烧杯。
【试剂配制】
考马斯亮蓝G―250： 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。
标准蛋白质溶液：准确称取10mg牛血清蛋白，用0.9%的NaCl稀释至100ml，即为0.1mg/ml的原液
【方法与步骤】
1.牛血清蛋白标准曲线的制作
试管号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白液（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
水（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
蛋白浓度(μg/ml)
0
20
40
60
80
100
G-250 （ml）
5
5
5
5
5
5
各管混匀后2分钟，以1号管作空白对照，测定各管595nm下的吸光值，以吸光值为纵坐标，蛋白质溶液的浓度为横坐标作图，得标准曲线。
2.未知样品中蛋白质溶液的测定
准确称取玉米下胚轴2g，加入2ml蒸馏水研成匀浆，转移至100ml容量瓶，再用蒸馏水分次充分洗涤研钵，洗涤液收集一并合如容量瓶，定容为100ml，放置10分钟以充分提取蛋白质；用离心机3000转/分钟离心10分钟，上清液置入小烧杯即为未知待测液。
取未知浓度的蛋白液1ml加入试管，再加入考马斯亮蓝G-250染色液5ml混匀，测定595nm下的吸光值，对照标准曲线求出未知蛋白液的浓度。
【实验结果】
根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋自质含 (ug) ，计算每克鲜重蛋白质的含量：
豆芽中的蛋白质含量（%）=
C：标准曲线查得的蛋白质浓度（μg/ml）
V:：稀释体积（ml）
N：稀释倍数(10)
W：样品质量（g）
【注意事项】
1.玻璃仪器要洗涤干净；
2.取量要准确
3.在试剂加入后的5-40分钟内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。
4.测定中，蛋白-染料复合物有少部分吸附于比色杯壁上，测定完成后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
【思考题】
1.考马斯亮蓝 G - 250 法测定蛋自质含量的原理是什么？还有哪些蛋自质定量法？
2.如何正确使用分光光度计？
实验三 影响酶活性的因素
【实验目的】
掌握影响酶活性因素的实验；熟悉影响唾液淀粉酶活性因素的实验方法；掌握温度、抑制剂、pH对酶活性影响的机制。
【实验原理】
酶是生物体中具有催化功能的一类蛋白质，因此它的催化作用受温度的影响很大。当反应速度最快时的温度称为此酶作用的最适温度。大多数动物酶的最适温度为37～40℃。
酶的活性受环境pH值的影响极为显著。酶表现其活性最高时的pH值称为最适pH。低于或高于最适pH时，酶的活性逐渐降低，不同酶的最适pH值不同，例如胃蛋白酶的最适pH为1.5～2.5，胰蛋白酶的最适pH为8.0。
能使酶的活性增加的物质称为激动剂，氯离子对唾液淀粉酶有激活作用。使酶的活性降低的物质，称为抑制剂，铜离子则对唾液淀粉酶有抑制作用。
本实验以唾液淀粉酶为例，此酶只能催化淀粉的水解，最终产物为麦芽糖；而不能催化其它糖的水解反应，如纤维素、蔗糖等。
淀粉水解程度不同，遇碘呈色反应不同。因此，可以通过呈色反应，了解淀粉水解的程度，从而间接判断唾液淀粉酶活力的大小。
淀粉水解如下：
遇碘呈 蓝色 紫色 红色 碘本色（黄） 碘本色（黄）
中间可能出现其它过渡色，如蓝紫色、棕红色等。
【实验药品】
1. 1％ 淀粉溶液 （准确称量1克淀粉，用少量蒸馏水混匀，小心加入到沸水中，试剂总量为100ml,并充分搅拌冷凉，置入冰箱备用）
2. 1:10稀释新鲜唾液：用清水漱口后，含蒸馏水少许行咀嚼动作以刺激唾液分泌。吐入小烧杯中备用。
3. I-KI溶液：将碘10g及碘化钾20g溶于100ml蒸馏水中为贮存液。使用前稀释10倍。
4.3％NaCI溶液；
5.1％CuSO4溶液；
6. 1％Na2SO4溶液；
7.缓冲溶液： pH4.8 pH 6.8 pH8.0
pH
0.2M 磷酸氢二钠（ml）
0.1M 柠檬酸（ml）
4.8
9.86
10.14
6.8
15.45
4.55
8.0
19.45
0.55
【实验器材】
恒温水浴、沸水浴、冰水浴、反应板、试管、胶头滴管。
【方法与步骤】
1.温度对唾液淀粉酶活性的影响
取5支试管、编号，按下表操作
试剂 1 2 3 4 5
1％ 淀粉溶液(滴) 10 10 10 10 10
pH6.8缓冲液(滴) 10 10 10 10 10
3％NaCI溶液(滴) 5 5 5 5 5
保温5分钟(滴) 37℃ 100℃ 100℃ 0℃ 0℃
稀释唾液(滴) 5 5 5 5 5
保温5钟 37℃ 100℃ 100℃ 0℃ 0℃
保温5钟 － － 37℃ － 37℃
碘液(滴) 1 1 1 1 1
观察记录颜色
观察、记录各管变化并分析实验结果。
2.pH、激活剂、抑制剂对唾液淀粉酶活性的影响
取7支试管、编号，按下表操作
试剂(滴) 1 2 3 4 5 6 7
0.1％ 淀粉溶液(滴) 10 10 10 10 10 10 10
pH4.8缓冲液(滴) － 5 － － － － －
pH6.8缓冲液(滴) 5 － 5 － 5 5 5
pH8.0缓冲液(滴) － － － 5 － － －
3％NaCI溶液(滴) － － － － 5 － －
1％CuSO4溶液(滴) － － － － － 5 －
1％Na2SO4溶液(滴) － － － － － － 5
稀释唾液(滴) － 5 5 5 5 5 5
H2O (滴) 10 5 5 5 － － －
观察记录颜色
将各管混匀后，同时置于37－40℃水浴中保温。约30秒后，由第5管取出1滴置白瓷板上做碘反应，观察颜色，如为蓝色，则仍每间隔30秒－1分钟作一次碘反应，直至颜色呈棕色。将各管取出，各加碘液2滴，遥匀，观擦记录各管变化并解释其结果。
【实验结果】
1. 温度对唾液淀粉酶活性的影响；结果：
试管 1 2 3 4 5
结果 棕色 兰色 兰色 兰色 棕色
分析：酶的化学本质是蛋白质，温度较低时，催化活性很弱。温度较高时，酶蛋白变性失活。在最适温度时，催化活性最强。
1号管为最适温度，酶活性最强，将淀粉分解为麦芽糖，故呈棕色；
2号管温度较高，酶蛋白变性失活，故呈兰色；
3 号管由高温移至最适温度，因酶蛋白变性失活不能再恢复活性，故呈兰色；
4号管温度较低，酶活性很弱，故呈兰色；
5号管由低温移至最适温度，使酶活性恢复，故呈棕色；
结论：酶在不同的温度条件下，催化活性不同，在37－40℃活性最强。
2. pH、激活剂、抑制剂对唾液淀粉酶活性的影响；结果：
试管 1 2 3 4 5 6 7
结果 兰色 兰色 深棕色 兰色 棕色 兰色 深棕色
分析：1号管：没有加稀唾液，反应体系中不含酶，无酶促反应发生，故呈蓝色
2号管：pH偏酸，酶活性较弱，反应速度较慢，故呈蓝色
3号管：为最适pH，酶活性较强，反应速度较快，故呈深棕色
4号管：pH偏碱，酶活性较弱，反应速度较慢，故呈蓝色
5号管：为最适pH，含有激活剂氯离子，酶活性最强，反应速度最快，故呈棕色
6号管：含有抑制剂铜离子，酶活性被抑制，故呈蓝色
7号管：含有Na2SO4，对酶活性无影响，又在最适pH条件下，反应速度较快，故呈深棕色
结论：1. 酶在不同的酸碱条件下，催化活性不同，最适pH为6.8
2. 氯离子为激活剂，可提高酶活性6
3. 铜离子为抑制剂，可降低酶活性
【注意事项】
1.温度对唾液淀粉酶活性的影响
（1）每次加试剂后都要摇匀，碘液不要滴在管壁上。
（2）2号管应先冷却,再加碘液，其它各管，均应置于相应温度下或取出后立即加碘液摇匀。
2. pH、激活剂、抑制剂对唾液淀粉酶活性的影响
（1）加稀释唾液和加碘液时的时间间隔要保持一致，即在反应时间一样的条件下，观察反应的速度。
（2）试管要冲洗干净，否则影响实验结果。
【思考题】
（1）激动剂和抑制剂有哪几种类型？其作用原理是什么？
（2）温度和pH影响酶活性的原理是什么？
实验四、 水果中维生素C的定量测定
【实验目的】
掌握维生素C的定量测定原理。学会蔬菜水果中维生素C的定量测定方法。
【实验原理】
维生素C具有较强还原性，在中性和微酸性条件下，能将兰色染料2，6-二氯酚靛钠还原为无色。
【实验材料】
豆芽、草酸、抗坏血酸、2,6-二氯酚靛酚。
【实验仪器】
吸量管（10ml）、锥形瓶（50ml）、小研钵、滤纸、容量瓶（50ml）、微量滴定管、组织捣碎器、天平、量瓶。
【试剂配制】
1、1%草酸溶液：取10g草酸溶于1000ml蒸馏水中
2、2%草酸溶液：取20g草酸溶于1000ml蒸馏水中
3、标准抗坏血酸溶液（0.1mg/ml）：精确称取25mg抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）。用1%草酸溶解并定容至250ml。该溶液应储存于棕色瓶中，最好临用前配制。
4、2,6-二氯酚靛酚溶液：称取150mg2,6-二氯酚靛酚溶于约含52mg碳酸钠的热水中，冷却后用蒸馏水稀释至500ml，滤去不溶物，储存于棕色瓶中，4℃冰箱中冷藏（可稳定1周左右）。临用前，以标准抗坏血酸溶液进行滴定。
【方法与步骤】
1.样品液的制备
先准确量取2%的草酸35ml置小烧杯中备用，准确称取样品（豆芽）4g于研钵中，立即加2%草酸约5ml于研钵中并把样品研成匀浆，匀浆中加入2%草酸约10ml，将所得溶液转入50ml容量瓶中，并用剩余2%草酸数次洗涤研钵及残渣一并转入容量瓶，最后用蒸馏水溶液稀释并定容为50ml。
将容量瓶中液体全部转入离心管中，以4000转/分钟离心5分钟，得到上清液即为要测定的样品液。
2、标准溶液滴定
准确吸取1ml标准抗坏血酸溶液于50ml锥形瓶中，加入1%草酸溶液9ml，同时吸取10ml1%草酸于另一50ml锥形瓶中作空白对照，微量滴定管以2，6二氯酚靛钠进行滴定直微红色并在15秒钟不褪色为止。记录所用染料溶液的体积，计算出1ml染料所能消耗的抗坏血酸的量。
3.样品滴定：
小心量取上清液10ml置入50ml锥形瓶中，用微量滴定管将2，6二氯酚靛钠滴入样液，直至微红色并在15秒钟不褪色为止。滴定速度要稍快，2min内滴定完。滴定液用量最好在1～3ml之间，如过多或过少，应增减样液用量。
在另一50ml锥形瓶中放入35ml 2%草酸,并用蒸馏水定容，取此液10ml,放入另一50ml三角瓶内，用2，6-二氯酚靛钠溶液滴定至终点，并记录滴定液用量，做空白对照。
【实验结果】
(V1-V2)×K×V（50）
X= __________________________×100
W×V3（20）
式中，X：100g样品中维生素C的毫克数
V1：滴定样品消耗液毫升数
V2：滴定空白消耗滴定液毫升数
V3：测定样品所用滤液毫升数（20ml）
V：样品提取液稀释总体积（50ml）
W：称取样品的质量（4g）
K: 1毫升滴定液所能氧化维生素C毫克数，可由标定算出。（根据实际测定得知K=1/12）
【注意事项】
2，6-二氯酚靛钠溶液的标定：
称取维生素C 20mg，用1%草酸溶解定容至200ml。吸取10ml，再用1%草酸溶液定容至200ml。吸取此液10ml，置50ml三角瓶中（同时吸取10ml 1%草酸于另一50ml三角瓶中作空白对照），立即用待测定的2，6-二氯酚靛钠溶液滴定至粉红色出现15秒不消失为止，记录用量。按下式计算K值。
G 10 10
K= — × —— ×——
200 200 V
式中，G:称取维生素C的毫克数；
V：滴定10ml标准维生素C与滴定空白所用2，6-二氯酚靛钠毫升数的差值。
【思考题】
1.提取维生素C时，加入2%草酸的作用是什么？
2.如果提取液颜色太深而需要脱色，一般采用什么办法脱色？
3.提取液中抗坏血酸氧化酶是否影响本实验的结果，是否加热消除该酶的影响？
实验五 胰岛素和肾上腺素对血糖浓度的影响 （邻甲苯胺法）
【实验目的】
掌握血糖的测定原理与方法；观察胰岛素和肾上腺素对血糖含量的影响；了解血糖增高或降低的临床意义。
【实验原理】
人和动物血糖浓度受神经、激素的调节，维持相对稳定。胰岛素和肾上腺素是调节血糖浓度的两种重要激素，胰岛素使血糖浓度降低，肾上腺素使血糖浓度升高。
本实验采用邻甲苯胺法测定血糖浓度。葡萄糖为含醛基的己糖，在醋酸溶液中加热，脱水生成5-羟甲基-2-呋喃甲醛，再与邻甲苯胺缩合，生成蓝绿色的醛亚胺（Schiff氏碱），其颜色深浅与样品中葡萄糖含量成正比。然后与同样处理的标准葡萄糖比色，即可求得待检样品中葡萄糖含量。
临床上血糖水平升高主要见于糖尿病，降低见于低血糖。
【实验药品】
1.胰岛素，市售1000单位/L。
2.0.1%肾上腺素。
3.标准葡萄糖应用液：称取干燥无水葡萄糖1g,溶于50ml0.25%苯甲酸溶液中，移入100ml容量瓶中，用0.25%苯甲酸稀释至刻度。再吸取10ml,放入100ml容量瓶内，用0.25%苯甲酸稀释至刻度，即每升含1g葡萄糖。
4.邻甲苯胺试剂：称取硫脲1.5g溶于冰醋酸400ml中，加邻甲苯胺60ml混匀，再加入饱和硼酸液40ml，用冰醋酸稀释至1000ml。充分混匀后棕色瓶中保存。
5.15%三氯醋酸溶液。
6.饱和硼酸液：称取硼酸6g溶于蒸馏水100ml中，混匀，放置一夜，取上清液应用。
【实验器材】
恒温水浴、沸水浴、离心机、722型分光光度计。
【方法与步骤】
1.动物准备：正常家兔2只，实验前禁食4小时以上，称体重（约2kg），记录并编号。
2. 取血：在耳缘静脉处进行，先拔毛，再用二甲苯擦拭兔耳，使血管扩张，用棉花擦干，然后用注射器抽取血液，将血液收集于含有15%三氯乙酸的离心管内（1：9的比例），边接边摇，充分混匀，取1ml待用。
3. 注射激素后再取血：将一家兔皮下注射胰岛素（1单位/kg体重）2ml，另一家兔皮下注射肾上腺素（0.4mg/kg体重）0.8ml。分别记录注射时间。注射肾上腺素20分钟，胰岛素30分钟后，按上述方法各取血1ml置于含有15%三氯乙酸的离心管内，混匀备用。
4. 制备血滤液：将上述4支试管（注射肾上腺素前、后，胰岛素前、后）标号，以3000r/min离心5分钟，上清液即血滤液。
5.操作：取中试管6支，编号，按下表加入试剂：
试管号 注射肾上 注射肾上 注射胰 注射胰 标准管 空白管
腺素前 腺素后 岛素前 岛素后
血滤液(ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 - -
标准葡萄糖应用液(ml) - - - - 2.0 -
蒸馏水(ml) - - - - - 2.0
邻甲苯胺(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
充分混匀，将6支试管同时置于100℃水浴准确加热8分钟。取出后冷水冷却，在30分钟内用630nm波长进行比色，读取并记下吸光度，算出血糖浓度进行分析比较，观察激素的作用。
【实验结果】
试管号 注射肾上 注射肾上 注射胰 注射胰 标准管 空白管
腺素前 腺素后 岛素前 岛素后
现象 绿色（浅） 绿色（深） 绿色（深）绿色（浅）绿色 试剂色（淡黄）
A（吸光度）值 0.253 0.672 0.304 0.185 0.316 0
结果分析与结论：
结果分析：血中葡萄糖含量（mg/L）＝测定管吸光度／标准管吸光度×100
注射肾上腺素前血中葡萄糖含量（mg/L）＝测定管吸光度／标准管吸光度×100
＝0.253/0.316×1000
＝80.1
注射肾上腺素后血中葡萄糖含量（mg/L）＝测定管吸光度／标准管吸光度×100
＝0.672/0.316×100
＝212.7
注射胰岛素前血中葡萄糖含量（mg/L）＝测定管吸光度／标准管吸光度×100
＝0.304/0.316×100
＝96.2
注射胰岛素后血中葡萄糖含量（mg/L）＝测定管吸光度／标准管吸光度×100
＝0.185/0.316×100
＝58.5
结论：胰岛素使血糖浓度降低，肾上腺素使血糖浓度升高。
【注意事项】
1.每只家兔只做一种激素实验。
【思考题】
1.常见影响血糖浓度的激素有哪些？哪些是升高血糖的，哪些是降低血糖？
2.本实验的原理是什么？
3.试列举你所知道血糖测定的方法还有哪些？
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