pGAP-毕赤酵母表达系统的研究进展

pGAP-毕赤酵母 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达系统的研究进展 112张建峰，耿宏伟，王丕武 (1. 吉林农业大学生命科学学院，长春 130118; 5 2. 吉林农业大学农学院，长春 130118) 摘要:三磷酸甘油醛脱氢 酶(GAP)启动子具有很强的组成型表达能力，在近年来广泛应用于 巴斯德毕赤酵母表达外源 蛋白。文中通过对 pAOX1、pFLD1、pGAP 三种表达载体的比较， 阐述了 pGAP 表达系统 在生产外源蛋白中的优点及国内外现阶段的相关应用。 关键词:pGAP;巴斯德毕赤酵母; 表达系统;外源蛋白 10 中图分类号:Q786 Research Progress on pGAP- Pichia Pastoris as a Gene Expression System 112ZHANG Jianfeng, GENG Hongwei, WANG Piwu 15 (1. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118; 2. Faculty of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun 130118) Abstract: The GAP gene promoter has a very strong constitutive expression ability，therefore,pichia pastoris has been widely applied to the expression of the heterologous protein in recent years. By comparing the three kinds of expression vector pAOX1, pFLD1 and pGAP, this paper 20 elucidates the advantages are brought by the pGAP expression system during the producing of the heterologous protein as well as the related application at home and abroad. Key words: pGAP; pichia pastoris; expression system; heterologous protein 0 引言 25 随着分子生物学技术的快速发展，越来越多的人开始关注利用微生物表达系统表达外源 蛋白。酵母是一种单细胞低等真核生物，特性是易于培养、繁殖快、利于基因操作，并且能 对外源蛋白进行翻译后修饰和加工、适合高密度发酵、不产生有毒物质，逐渐受到了人们的 [1]关注，为外源基因在真核生物中的表达提供了广阔的前景。 最先用于表达外源蛋白的酵母属是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。1981 年 [2]30 Hitzeman 等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功。此后继续用该系统表达了其它多种真核和 [3]原核蛋白，酿酒酵母表达系统逐渐成为分子生物学中研究的较为透彻的酵母表达体系。但 酿酒酵母系统也具有局限性，比如缺乏强有力的启动子，表达菌株不够稳定，分泌效率差， [4]表达质粒易于丢失等。所以，人们又发展了新一代的酵母表达系统——巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)表达系统，即甲醇酵母表达系统。 35 近年来发现了一种甲醇型酵母即巴斯德毕赤酵母，其细胞的过氧化物酶系中含有甲醇代 谢途径的必需酶，因而巴斯德毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中快速生长 [5][6]。目前使用最广泛的巴斯德毕赤酵母受体是由Cregg 1985 年建立的 GS115。由于 GS115 +具有组氨酸脱氢酶缺陷型基因 his4，因而可接受含 HIS4 的载体而具有 HIS表型以筛选转化 子。现在大多利用甲醇为唯一碳源诱导巴斯德毕赤酵母表达系统进行外源蛋白的表达，然而 基金项目:教育部高校博士学科专项科研基金(20070193005) 作者简介:张建峰(1973-)，男，副教授，作物生物技术 通信联系人:王丕武(1958-)，男，教授，作物遗传育种及生物技术. E-mail: peiwuw@yahoo.com.cn 40 由于甲醇对表达产物的卫生安全性存在影响，因而需要开发不利用甲醇诱导的表达体系。 [7]Waterham H R等克隆的 pGAP 组成型表达系统可以利用甘油或葡萄糖等无毒性物质作为 唯一碳源，适于大规模生产外源蛋白，因此受到越来越多的关注。 然而，现阶段国内对于 pGAP 组成型表达系统的研究才刚刚起步，对 pGAP 系统还处在 表面的认知上，对该系统在生产中的一些缺点也认识较少，导致研究进展缓慢。文中综合大 45 量实际生产中的应用，介绍了 pGAP 组成型表达系统存在的优缺点，为进一步的研究提供支 持。 1 毕赤酵母表达载体的比较 巴斯德毕赤酵母载体包括自主复制的游离载体和整合型载体，由于没有稳定的附加体质 粒，所以一般用整合型质粒作为外源基因的表达载体。整合型载体导入酵母宿主细胞后通过 [8; 9]50 同源重组与酵母细胞染色体基因组 DNA 整合，能在酵母中稳定存在。现在应用于毕赤 酵母表达系统的载体有醇氧化酶 1 启动子表达载体(pAOX1)、三磷酸甘油醛脱氢酶启动子表 达载体(pGAP)、甲醛脱氢酶 1 启动子表达载体 (pFLD1)以及 Invitrogene 公司开发的多种 表达载体，如 pPIC3、pPIC9、pPIC9k、pAO804、pAO815、pPICz 系列和 pPICza 系列等适 [10]合于胞内或分泌的表达载体。 55 1.1 pAOX1 表达载体 醇氧化酶 1 启动子(pAOX1)是最早开发的 Pichia pastoris (P. pastoris)启动子。醇氧化酶 是甲醇利用途径上的第一个酶，催化甲醇氧化为甲醛，在脱氢酶的进一步作用下为微生物提 供碳源。AOX1 基因的表达是受转录水平调控的。AOX1 基因的调控是诱导机制和抑制机制 相辅的过程，由于 pAOX1 启动子受到甲醇的强烈诱导，能非常有效的控制外源基因的表达 [11-13]60 。在一般情况下，胞内AOX 酶的变化直接反映了外源蛋白的表达状况，因此通过 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 [14]检测胞内 AOX 酶的含量和变化速率，就可以确定外源基因所处的状态。 近年来，已经建立了 pAOX1-P. pastoris 表达系统的高密度发酵 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ，并应用于一些重 [15]组蛋白的生产。但在生产中操作繁杂，需要更换碳源，延迟了发酵周期;特别是甲醇有毒 易于挥发，对表达产物的分离提出了要求，甲醇的大量应用也对环境造成污染，并存在一定 [8; 16; 17] 65 的火灾隐患，制约了 pAOX1 表达系统在大规模工业化生产中的应用。1.2 pFLD1 表达载体 1998 年 Shen 等报道了毕赤酵母中一个新的启动子，谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶基因启 动子(pFLD1)， pFLD1 不仅能以甲醇作为唯一的碳源，也能以烷化胺(例如无毒的物质甲胺) [18]作为唯一氮源诱导它所调控的下游基因的表达。由于 pFLD1 与 pAOX1 对于甲醇诱导表 [19]70 达的水平相当，因此 pFLD1 启动子扩大了毕赤酵母的应用范围，有较好的应用前景。遗 憾的是，目前国内尚没有太多应用 pFLD1 启动子作为调控元件的表达载体的研究。 1.3 pGAP 表达载体 pGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是一种组成型强启动子，能和表达载体一起整合到 [20]酵母基因组中，随基因组一起复制和遗传，避免了外源基因的丢失现象。 Waterham H R [7]75 等首先成功地从 P. pastoris 基因组中克隆了 pGAP。 三磷酸甘油醛脱氢酶可以在包括巴 斯德毕赤酵母在内的多种微生物中连续、高效的表 达。近年来，编码三磷酸甘油醛脱氢酶蛋白的 GAP 基因启动子已经被测定，并且证明了由 于应用的碳源不同，其在巴斯德毕赤酵母中可以高水平表达重组蛋白的可行性。pGAP 启动 子的表达水平较 AOX1 启动子表达的水平高。 含有 pGAP 启动子的质粒(pGAPz)中具有不同于 AOX1 的筛选标记，不需要利用甲 80 TM 醇的诱导而得到表达，pGAPz 质粒含有 Zeocin筛选标记，可以避免在筛选上甲醇存在的 TM 不利影响，Zeocin抗性在酵母和大肠杆菌中均有生物活性。 2 pGAP-毕赤酵母表达系统概述 pGAP-毕赤酵母表达系统是最近几年来新发展起来的毕氏酵母表达系统。pGAPz 和 pGAPza 是由美国 Invitrogene 公司开发的专门针对于毕赤酵母的酵母表达载体，配套毕赤酵 母如 GS115，X-33， KM71 等。该表达系统在近些年已经陆续得到应用，并且成功的在 P. 85 [21; 22] pastoris 中表达出异源蛋白。由于该组成型启动子在发酵表达时可以利用甘油或葡萄糖 等无毒性物质作为唯一碳源，不需要甲醇诱导，避免了在生产过程中大量甲醇利用所造成的 [21] 污染及危险，并且表达产量高，发酵工艺简单，因此更加适于大规模生产。 该系统的主要优点在于:首先是外源蛋白表达产量高;其次是毕赤酵母自身分泌蛋白量 较少，利于后续的提取分离;还有不需甲醇作为诱导剂，在发酵过程中，不需从一种碳源到 另一种碳源的转换，既缩短了培养时间，又降低了培养过程中杂菌的污染概率。因此，pGAP 90 表达系统有望代替 AOX1 表达系统而应用于大规模外源蛋白的生产。 3 pGAP-毕赤酵母表达系统表达外源蛋白的特性 3.1 pGAP 系统调控的高效表达 近年来，已有报道一些外源蛋白在 pGAP 系统的调控下得到高效表达。例如，田生礼等 利用 pGAP 系统表达碱性纤维素酶基因，以维持底物浓度的流加方式生产碱性纤维素酶，获 [23]95 得最高的菌体干重达 29.8g/L，最高酶活性可达 24U/mL。随着越来越多的应用，更多的 报道表明 pGAP 系统调控表达的外源蛋白的产量高于 pAOX1 系统。Döring F 等报道在 pGAP 启动子调控下 P. pastoris 表达的人肠肽转运载体( hPEPTl) 和功能载体蛋白(rPEPT2)的水平 [24] 比使用 pAOX1 均高 5 倍。Delroisse JM 等通过摇瓶发酵 P. pastoris 的结果表明:利用 pGAP [25]启动子调控表达获得的重组蛋白的产量比用 pAOX1 启动子多两倍。 3.2 pGAP 表达系统的碳源调控简便100 pGAP 表达系统受到碳源的强烈调控，不需要利用甲醇等有毒物质，而利用无毒的甘油 或葡萄糖作为唯一碳源。并且，这三种物质利用于 pGAP 系统的优异性还存在争议。 在 [7; 26] Waterham 等和张爱联等的研究结果中都证明以甲醇为碳源获得的表达产物最少，更多 的研究倾向于利用甘油和葡萄糖作为 pGAP 系统的碳源。在摇瓶发酵中，多以葡萄糖作为唯 一的碳源。Döring F 等将携带 pGAP-rPEPT2 的 P. pastoris 细胞分别培养于含有葡萄糖和甲 醇的培养基中，结果前者的 rPEPT2 表达水平较后者高大约 8 倍。甘油则较适合作为中大规 105 [11]模生物反应器中发酵 P. pastoris 生产重组蛋白的碳源。 3.3 pGAP 表达系统发酵周期短 与应用 pAOX1 比较，应用 pGAP 系统的发酵周期明显较短。张爱联等分别利用 pGAP 组成型表达系统和与 pAOX1 诱导型表达系统调控表达了 angiostatin (AS)，并进行了比较， [26]结果是组成型表达的峰值在第 2d 出现，而诱导型表达的峰值则在第 6d 才出现。在 pGAP 110 的调控下，外源蛋白随着细胞的增殖而分泌到培养基中，分泌过程中不需要由一种碳源转换 成另一种碳源，操作方便，在生产中发酵时间较 pAOX1 调控的系统短，有利于提高生产效 率，降低生产成本。 115 3.4 pGAP 表达系统更利于外源蛋白的提取 由于 pAOX1 表达系统在发酵过程中需要经甲醇诱导，再更换新的碳源进行分泌蛋白， [27]在操作中比较繁琐，不适合于连续发酵。pGAP 表达系统以甘油或葡萄糖进行发酵，不需 120 [28]要更换碳源，更适于连续高密度发酵。Goodrick 研究 pGAP-P. pastoris 组成型体系表达几 丁质酶，发酵过程以葡萄糖为唯一碳源进行连续发酵，能持续发酵大约 1 个月时间，并且无 [21]酶蛋白降解现象的出现。Khasa 等报道 pGAP- P. pastoris 表达系统能有效的表达人巨噬细 [29] 胞集落刺激因子(hGM-CSF)。以上研究表明 pGAP 表达系统适于大规模、高密度连续的生 产重组蛋白 125 4 展望 pGAP-毕赤酵母作为新一代的表达系统，可以利用无毒性的甘油或葡萄糖等物质作为唯 一碳源应用于生产外源蛋白，表达产物量高，生产工艺简单，发酵周期短，能够进行连续高 密度发酵，在大规模的生产中其突出的优异性正受到人们越来越多的关注。然而，该系统也 TM 存在一定的缺点。如:第一方面，pGAP 调控系统要利用强诱变剂 Zeocin进行筛选转化子， TM 可能导致转化子产生不可预料的突变，同时筛选标记 Zeocin的价格也比较昂贵;第二方面， 130 pGAP 启动子不能对外源基因的表达进行调控，仅适合表达对宿主无毒的蛋白，这就限制了 一些酶利用该系统表达的可行性。所以，这些不足也为我们以后的研究提供了方向，鼓励我 们不断克服在研究中遇到的困难。随着对 pGAP-毕赤酵母表达系统研究的深入和优化，该 系统将在生产外源蛋白领域中发挥重要的作用。 135 [参考文献] (References) [1] 马兴元, 谭建华, 朱平，等. 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统及其在外源蛋白生产中的优势与应 用前景[J]. 中国兽医学报, 2003 (01): 98-101. 140 [2] Hitzeman RA, Hagie FE, Levine HL. et al. 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