APX活性测定

APX活性测定APX活性测定一. 实验原理 ASA + H2O2APX ASA—H + H2O ASA在紫外分光光度计的290nm处达到最大吸收峰值。随着AsA被氧化，溶液中290nm波长下的消光度值（A290）下降，根据单位时间内A290减少值，计算AsA-POD活性。AsA氧化量按消光系数2.8(mmol/L)/cm计算，二. 实验材料与试剂材料：小麦叶片试剂：50mmol/LPBS+EDTA；0.4mmol/L PBS+AsA；1.0mmol/L H2O2。三. 实验步骤 1. 酶液提...

APX活性测定一. 实验原理 ASA + H2O2APX ASA—H + H2O ASA在紫外分光光度计的290nm处达到最大吸收峰值。随着AsA被氧化，溶液中290nm波长下的消光度值（A290）下降，根据单位时间内A290减少值，计算AsA-POD活性。AsA氧化量按消光系数2.8(mmol/L)/cm计算，二. 实验材料与试剂材料：小麦叶片试剂：50mmol/LPBS+EDTA；0.4mmol/L PBS+AsA；1.0mmol/L H2O2。三. 实验步骤 1. 酶液提取：取0.2g小麦叶片剪碎，加入PBS缓冲液（pH=7.8）进行研磨提取，研磨成匀浆后，定容到5ml，滤液离心（12000g 4℃）20min，上清液作酶粗提液供测定。 *通常离心力常用地球引力的倍数来表示，因而称为相对离心力 “ RCF ”（relative centrifugal force），用数字乘“g”来表示。相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，此时“RCF”相对离心力可用下式计算：g=1.119×10－5×(rpm)2r *在朗伯比尔定律中，k表示光被吸收的比例系数，K有两种表示方法，即质量吸光系数a和摩尔吸光系数?。活性测定：试剂 CK Amax Aleft PBS+EDTA 3 3 3 酶液 0.1 0.1灭活 0.1 PBS+ASA 0 0.2 0.2 H2O 0.4 0 0 H2O2 0 0.2 0.2 按如表所示添加试剂，Amax管中用40℃热水使酶灭活；注意H2O2要最后再添加，反应后立刻导入比色皿中立即进行测定。四. 结果分析测试结果：时间/s 0 10 20 30 40 50 60 70 80 分光值 -0.664 -0.667 -0.672 -0.674 -0.679 -0.684 -0.689 -0.693 -0.699 时间/s 90 100 110 120 130 140 150 160 170 分光值 -0.702 -0.707 -0.713 -0.720 -0.722 -0.729 -0.735 -0.740 -0.745 时间/s 180 190 200 210 220 230 240 250 260 分光值 -0.750 -0.756 -0.761 -0.765 -0.770 -0.775 -0.779 -0.779 -0.779 Amax=-0.661 到240s时反应结束，及反应时间t为240s 计算公式： APX（μmol/gFW·min）=(△A*VT*60*Vr)/(Vs*W*2.8*t) =[(-0.661-Aleft)*60*0.4*0.1]/(5*0.2*2.8*240) =(-0.661-Aleft)/280 其中：△A=Amax -Aleft VT：酶提取液体积 Vs：测定液体积 Vr：反应物体积 W：鲜重带入各数据绘制标准曲线时间/s 0 10 20 30 40 50 60 70 80 APX 1.07E-05 2.14E-05 3.93E-05 4.64E-05 6.43E-05 8.21E-05 1.00E-04 1.14E-04 1.36E-04 时间/s 90 100 110 120 130 140 150 160 170 APX 1.46E-04 1.64E-04 1.86E-04 2.11E-04 2.18E-04 2.43E-04 2.64E-04 2.82E-04 3.00E-04 时间/s 180 190 200 210 220 230 240 250 260 APX 3.18E-04 3.39E-04 3.57E-04 3.71E-04 3.89E-04 4.07E-04 4.21E-04 4.21E-04 4.21E-04 由APX酶活性曲线图可知，APX酶的活性随时间的增加而增加，大约成一个线性关系，线性关系为y = （0.0173x-0.0045R2）*10-5 R2= 0.9958 ；当反应到达一定时间（大约240s）后，酶的活性不再改变，这是受到底物浓度的影响；另外，反应的起始不是0，这是因为在加入H2O2后，立刻加入比色皿进行比色的过程中，反应已经发生，所以刚开始测到的值并不为0.

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