质粒浓度测定

质粒浓度测定用分光光度计测定质粒DNA的浓度一、目的熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。二、原理 DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在260nm处。波长为260nm时,DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关,也随构型而有差异。对标准样品来说,浓度为1μg / ml时,DNA钠盐的OD260=0.02当OD260=1时, dsDNA浓度约为50μg / ml ssDNA浓度约为37μg / ml RNA浓度约为40μg / ml 寡核苷酸浓度约为30μg /...

用分光光度计测定质粒DNA的浓度一、目的熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。二、原理 DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在260nm处。波长为260nm时,DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关,也随构型而有差异。对标准样品来说,浓度为1μg / ml时,DNA钠盐的OD260=0.02当OD260=1时, dsDNA浓度约为50μg / ml ssDNA浓度约为37μg / ml RNA浓度约为40μg / ml 寡核苷酸浓度约为30μg / ml 当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时,会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230,计算其比值来衡量样品的纯度。经验值: 纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1。6,表明有蛋白质、酚等污染)纯RNA:1.7 2.0时表明可能有异硫氰酸残存) 若样品不纯,则比值发生变化,此时无法用分光光度法对核酸进行定量。三、材料、试剂及器具 1、材料提取的PUC19样品、PUC19标准样品 2、试剂灭菌重蒸水,TE缓冲液 3、器皿石英比色皿;UV-240紫外分光光度计四、操作步骤 1、UV-240紫外分光光度计开机预热10min. 2、用重蒸水洗涤比色皿,吸水纸吸干,加入TE缓冲液后,放入样品室的S池架上,关上盖板。 3、设定狭缝后校零。 4、将标准样品和待测样品适当稀释(DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl)后,记录编号和稀释度。 5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上,关闭盖板。 6、设定紫外光波长,分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。 7、计算待测样品的浓度与纯度。 DNA样品的浓度(μg / μl):OD260×稀释倍数×50/1000 RNA样品的浓度(μg / μl):OD260×稀释倍数×40/1000

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