蕨类植物组织培养研究进展

蕨类植物组织培养研究进展 蕨类植物也称羊齿植物,起源于古生代志留纪和泥盆纪的棵蕨,是分类地位介于苔藓植物和种子植物之间的一大类植物,全世界约有12000多种。由于蕨类植物具有独特的叶形,观赏蕨成为切叶的主要种类。此外,颜类植物还用于食用、药用、指示植物等”。由于蕨类植物的生活史迥异于种子植物,因此被作为一种研究植物形态发生和遗传变异的有效手段广泛应用。自然条件下,蕨类植物主要通过孢子进行繁衍,或通过根、根状茎、叶等部位产生无性芽抱和顶端分生组织产生新植株。然而,自然繁殖的蕨类植物远远不能满足人类的需求,一些颜类植物也因生境的恶化而日趋减少,组织培养作为一种有效的快速繁殖手段运用于蕨类植物生产中。目前,部分蕨类植物生产已进入商品化。通过组织培养方式进行繁殖对于一些无孢子或孢子量少、孢子不育的杂交种以及孢子繁殖困难的种类尤为适宜。此外,对于蕨类植物物种,尤其是濒危物种砂锣的保存也具有重要意义,利用无菌保存(配子体或孢子体)可以在不受自然条件影响下,在有限空间保存大量种质资源。 1 蕨类植物组织培养途径 藻类植物组织培养可分为以孢子为外植体和以孢子体(根状茎、匍匐茎、嫩叶)为外植体两种途径。 1.1以袍子为外桓体的途径 在自然条件下,蕨类植物通过叶腋及叶背产生的抱子进行繁殖,孢子囊内的孢子母细胞经过减数分裂,产生大量孢子,孢子经萌发形成原叶体,原叶体再分化形成颈卵器和精子器,在有水的条件下颈卵器中的卵子和精子器中的精子受精形成合子,合子发育成胚,进而形成幼小孢子体。以孢子作为外植体即是用组织培养的条件模拟自然条件下孢子发育所需条件而进行的。目前在藻类植物中许多种类已利用孢子进行组织培养获得成功,由于蕨类植物生活史与种子植物有很大差别,因此,在孢子培养过程中所需条件亦不尽相同。 1.1.1孢子萌发孢子接种后一般于2—4周萌发,但蕨类植物中有些种类的孢子如渺锣、狠尾蕨、鹿角蕨的孢子具有休眠特性,致使从孢子萌发到形成原叶体的阶段延长,有些种类萌发时间长达1—2年。对于此类抱子可采用激素,如GA3处理以打破休眠,渺锣抱子经50mdLGA;处理2—5min,能使孢子萌发时间从1年缩短至2 个月。 孢子萌发培养基一般采用MS为基本培养基,但有些种类在全量MS中不能萌发,只在稀释的MS 、Knudsont、Knop等低盐培养基中才可萌发。培养基中糖浓度对孢子萌发也 1.1.2原叶体的生长和发育在原叶体生长和发育阶段加入细胞分裂素、糖对原叶体发育和孢子体形成有促进作用,但也有例外,如在Osmunda、Pteris ensiformis中发现培养基中加入蔗糖反而抑制原叶体发育并使其坏死。培养基中琼脂浓度、pH值和培养温度对原叶体生长也有一定的影响。 原叶体培养普遍采用半固化培养基,Douglas等r采用液体培养基将原叶体进行悬浮培养,取得较半固化培养基更好的增殖效果。 1.1.3 孢子体形成孢子体可在无激素培养基中无需诱导而直接发育,但有些特殊蕨类按一般方法只能得到原叶体而无法诱导得到孢子体,如荷叶铁线蕨在孢子体形成诱导中需在成熟原叶体上滴加1mg/L ABA。直接从原叶体得到孢子体这一途径增殖率一般较低。Knauss 发明了一种称之为不完全组织培养技术,即将培养了2个月的原叶体与1/2MS液体培养基以1:20比例于搅切器中搅切,所得匀化物加入固体培养基或直接倒入灭菌后的土壤(沙:泥炭藓为3:1)中直接诱导孢子体形成。此法大大增加了原叶体的增殖率,尤其是直接倒人土壤中,这样可以大大节省工作量,并加速孢子体的驯化。目前,这一技术已在多种蕨类植物中得到应用。但这一技术并非适合于所有蕨类植物,如在Osmurda regalis中,此法反而抑制抱子体的形成。很重要,在有些蕨类植物中如渺锣,糖的加入会抑制萌发。 1.2以孢子体为外植体的途径 除利用孢子作为外植体外,在蕨类植物中还利用根状茎、嫩叶、匍匐茎、鳞片、茎尖等外植体通过愈伤组织、不定芽、GGB(绿色小球,green globular body)。等方式进行试管增殖,利用这些孢子体 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 具有快速、取材不受季节限制等优点。 1.2.1基本培养基的选用在蕨类植物中大多采用MS作为基本培养基,培养基中无机盐的浓度很重要,它对于蕨类的组培效率及试管苗的正常发育均有影响。Higuchi等认为,在肾蕨属中1/4MS浓度效果良好,而对于鸟巢蕨全量MS的浓度更合适。Dykeman等发现1/2MS对荚果蕨的增殖最佳,而3/4MS对单个芽的生长最有利。Lescher等试验也证明了MS对肾蕨属器官发生抑制,而稀释MS可以解除这种抑制,相比较1/2MS而言,在全量MS中,羽叶和根的鲜重分别下降80%和89%,芽和根的数量分别下降为60%和82%。Haper很早就发现P元素对于蕨类植物组织培养的重要性,MS十P元素的培养基因而商品化,称为MFMM,广泛用于蕨类尤其是肾蕨属植物组织培养中。除MS培养基外,其它培养基如N6、Pragre 等在蕨类植物组培中也有采用,但未做过系统研究。 1.2.2植物生长调节剂的选用在肾蕨属植物根状茎尖培养中,诱导不定芽的发生无需外源激素,但NAA、KT可以促进芽的形成和增殖,而BA起抑制作用。组培中也发现BA 对芽形成和增殖的抑制作用。Beck等对鱼昆蕨的激素需求作了详细的研究,确定了KT1—2mg/L十NAA 0.01mg/L的组合有利于芽的增殖和丛生苗的形成。在荚果蕨根状茎培养中发现,KT1—2mg/L对芽生长增殖效果佳,而NAA对芽的生长增殖无促进作用。Hapert 在几种蔽类植物组培中也发现,最佳激素组合为KT和NAA,U范围1—2mg/L, NAA0.1—10mg/L。根的发生可被2,4—D、NAA等促进,但并非必需。根的发生在基本培养某中即可完成。 1.2.3有机物的选用在蕨类植物组培研究过程中,对有机物的研究很少,Loscher等发现肾蕨属植物适合20g/L蔗糖浓度,而荚果蕨在增殖期最佳蔗糖浓度为30—45g /L,在植株生长期为75g/L生长良好。而蕨类组织培养中腺漂吟硫酸盐和麦芽提取物被认为是不必要的。 1.2.4培养条件 Loscher等在肾蕨属植物组培中发现,光对不定芽的诱导是必需的,光的作用不能为外源激素和碳源所代替,而根可在光或暗中发生,但暗培养有利于根的发生。蔽类组织培养中 培养温度一般以24℃为宜,pH为5.4—6.0;在二叉鹿角蕨培养中发现,最佳芽增殖条件pH值为7.0。在GGB培养过程中,由于起源不同,GGB用液体或固体培养应针对具体植物而确定。 在外植体培养中,除愈伤组织、丛生苗、GGB快速繁殖途径外,还有一种如孢子培养中所运用的搅切法,即将幼孢子体桓株于1/2MS液体中搅切,将匀化物倒入固体培养基或消毒土壤中。此法可大大增加苗的增殖率。 2 蕨类植物组织培养中世代转换的诱导及调控 蕨类植物除进行正常的世代交替过程外,在环境条件发生变化时,如营养不良、受损等情况下,能通过捷径来加速完成其生活史,即无配子生殖和无孢子生殖。无配子生殖是指孢子体直接由配子体的营养细胞衍生,而没有性器官的介入。而无孢子生殖是孢子体直接衍生出配子体,经过配子融合形成多倍的孢子体。在自然条件下,世代转换发生的频率极低,而在组织培养条件下,可以大大促成配子体世代和孢子体世代的直接转换。 2.1培养基成分 在培养基中对世代转换调控起重要作用的是糖浓度。一般认为高糖有利于无配子生殖,而低糖则促进无孢子生殖。糖在培养基中所起作用主要是营养而非渗透压作用;而糖醇则是通过渗透压的调节对世代转换产生影响。低浓度糖醇有利于无孢子生殖的诱导。 培养基中某些成分的变化,如柠檬酸铁变为Fe—EDTA,有机N浓度的变化,高压灭菌与过滤灭菌对无配子生殖的诱发并无影响,而在原叶体培养中通过定期更换新鲜培养基,可以促进无配子生殖的发生。在培养基中加入琥珀酸、IAA可以诱发无配子生殖,而NAA、BA、2,4—D、KT在低浓度0.1— 1mg/L均有利于无孢子生殖的诱导。 2.2培养条件 光对无配子生殖的启动是关键的,在黑暗中,无论糖浓度高低均不能诱导无配子生殖,但随光强增大,无配子生殖率降低,最适为25ft-c。一般认为无孢子生殖以嫩叶、液体培养较为有利,无菌条件下取得的叶片好于田间取得的叶片。但在荚果蕨无孢子生殖诱导中发现,根的诱导好于嫩叶,通过加入适当激素也可在较老的叶片中诱导无孢子生殖。 3 小结 组织培养技术在蕨类植物方面的应用前景广阔,它不仅有利于缓解对现有蕨类植物需求的压力,保存蕨类植物种质资源,还有助于探讨和阐明蔽类植物生理、遗传等一系列理论问题。但截止至目前,在12000种蕨类植物中,成功进行组织培养的仅占极少一部分,主要集中在肾蕨、鹿角蕨、二叉鹿角蕨、荚果蕨、凤尾蕨等少数属种中,其中一些已进入商业化运营,但尚有许多属种尚未进行组织培养系统化研究,部分属种尽管已组培成功,但存在周期长、增殖率不高的问题。因此,蕨类植物组织培养还有待于进一步的研究和探索。