【WORD格式论文原稿】耐热乳糖酶基因 BGAB 的克隆及其在毕赤酵母中的

【WORD格式论文原稿】耐热乳糖酶基因 BGAB 的克隆及其在毕赤酵母中的 免费查阅标准与论文: 耐热乳糖酶基因 bgaB 的克隆及其在毕赤酵母中的 1表达 王霁昀，夏雨，陈海琴，田丰伟，赵建新，陈卫，张灏* 江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 (214122) *E-mail: zhanghao@jiangnan.edu.cn 摘 要:耐热 β-半乳糖苷酶以其良好的热稳定性和较高温度下的水解特性使之具有常温乳糖酶无法比拟的优越性。本文主要研究来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热 β-半乳糖苷酶基因 在毕赤酵母真核系统中的表达。将耐热 β-半乳糖苷酶 bgaB 基因克隆到大肠杆菌-毕赤酵母穿 梭质粒 pPIC9k 中，经测序证实插入的外源基因读码框正确后，电转化到毕赤酵母 GS115 中 构建重组菌株 GS115-pPIC9k-bgaB，经 MD 和遗传霉素平板筛选得到 3 株阳性转化菌株，甲 醇诱导后，可表达相对分子质量约为 70 kDa 的蛋白，与预期值一致。所表达的半乳糖苷酶 0.26 U/mL。活力最高为 关键词:耐热 β-半乳糖苷酶;毕赤酵母;重组表达 中图分类号:Q78 1 引言 β-半乳糖苷酶(EC.3.2.1.23)俗称乳糖酶，能水解 β-1,4 半乳糖苷键而具有重要的工业 用途，如在乳品加工中利用乳糖酶水解牛奶中乳糖生产低乳糖奶，可以有效地解决乳糖不耐 症的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，扩大牛奶的消费人群，促进乳品工业的迅速发展，增强人民身体素质[1]。来源 不同的乳糖酶理化性质有很大差别，其中之一就是热稳定性不同，例如酵母乳糖酶热稳定性 较差，是一种常温水解酶，而来源于嗜热细菌和霉菌的乳糖酶热稳定性较好。来源于嗜热脂 肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)的乳糖酶具有良好的热稳定性，由该菌染色体基 [2]因 bgaB 编码的耐热 β-半乳糖苷酶，在 70?仍具有较高的稳定性。 作为真核生物，甲醇诱导毕赤酵母表达系统非常适合外源蛋白的表达，它具有高等真核 表达系统的许多优点:如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与 E. coli 及 酿酒酵母同样简单[3]。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简 单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优 点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍，这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋 白表达系统[4]。Invitrogen 公司开发的 pPIC9k 是一种穿梭型质粒[4]，既可在原核细胞中复 制，又可在真核细胞中表达。本实验采用毕赤酵母表达系统，利用 pPIC9k 穿梭质粒，首次 探讨 bgaB 在真核系统中的表达。 本课题组已经从 Bacillus stearothermophilus 染色体扩增得到编码耐热 β-半乳糖苷酶的 bgaB 基因，并克隆到大肠杆菌和枯草芽孢杆菌表达系统中进行了表达研究[5-6]。考虑到毕 赤酵母表达系统的上述优点，且还未有见 bgaB 基因在毕赤酵母中表达的文献报道，本实验 将尝试把 bgaB 基因克隆转化到毕赤酵母基因组中，并在毕赤酵母中实现表达。 2 材料和方法 2.1 实验材料 1本课题得到国家自然科学基金(No.30670065);国家 863 计划项目(No.2007AA10Z316，No.2006AA10Z318) 的资助。 -1- 免费查阅标准与论文: 2.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，质粒 pMA5-bgaB 和 pPIC9k 均由本实验室保存。 2.1.2 酶和试剂 限制性内切酶 EcoR I、Not I、Sac I、T4 DNA Ligase 均购自 Takara 公司;KOD plus 高 保真 DNA 聚合酶购自 Toyobo 公司;MBI 1 kb DNA Ladder Mix 购自 fermentas 公司;溶壁 酶(Lyticase)，DNA 回收纯化试剂盒，酵母基因组提取试剂盒均购自 QIAGEN 公司;PCR 引物由上海博尚生物科技有限公司合成;遗传霉素(G418)，ONPG，X-gal 购自上海生工; 其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。 2.1.3 培养基 大肠杆菌培养采用 LB(Luria-Bertani)培养基;毕赤酵母宿主菌培养采用 YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)培养基;整合质粒转化大肠杆菌所得重组菌的筛选采用添 加氨苄青霉素(100 μg/mL)的 LB 培养基;整合质粒转化毕赤酵母 GS115 所得整合菌株转 化子的筛选采用 MD 培养基;筛选多拷贝整合菌株转化子采用添加不同浓度遗传霉素 G418 (0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 mg/mL)的 YPD 培养基;诱导发酵多拷贝转化子采用 BMGY 和 BMMY 培养基。 2.2 bgaB 基因的克隆 含有 bgaB 基因的质粒 pMA5-bgaB 为本实验室构建并保存。以其为模板，用 Primer 设 计合成 P1、P2 两条引物(下划线序列为引入的限制性内切酶识别位点，其中上游引物含有 EcoR I 酶切位点，下游引物含有组氨酸标签和 Not I 酶切位点)，引物序列如下: P1:GCCCGCCGAATTCATGAATGTGTTATCCTCAA P2: CGCGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGCTAAACCTTCCCGG PCR 反应总体系为 50 μL，其中 10×KOD plus Buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL， dNTP(2 mmol/L) 5 μL，P1、P2(100 mmol/L)各 1 μL，模板 1 μL，KOD plus 酶 0.5 μL。 PCR 反应条件:95? 5 min;95? 45 s，58? 45 s，72? 2 min，30 个循环。 2.3 重组质粒的构建 PCR 扩增得到的 DNA 片段经电泳胶回收，和 pPIC9k 质粒分别用 EcoR I 和 Not I 双酶 [8]切，酶切后于 16?连接过夜，连接产物转化 E. coli DH5α，涂布于含氨苄青霉素(100 μg/mL) 的 LB 培养基，过夜培养，挑取转化子，扩大培养后抽提质粒，经酶切、测序验证后，将鉴 定正确的阳性克隆子命名为 pPIC9k-bgaB。 2.4 重组质粒转化毕赤酵母 测序正确的阳性克隆，扩大培养后抽取质粒，用 Sac I 单酶切线性化，按照 Invitrogen 的毕赤酵母表达系统操作手册，采用电转化仪(Eppendorf Electroporator2510)将线性化的 质粒电击转化至毕赤酵母 GS115 感受态细胞，通过组氨酸缺陷平板(MD)筛选阳性转化菌 株，同时空载体 pPIC9k 也以同样的方式进行电转化，作为阴性对照。 2.5 多拷贝转化子的筛选 通过 MD 平板筛选得到的阳性菌株，用无菌水适当稀释后各取 20 μL 点种到含有不同浓 -2- 免费查阅标准与论文: [8]度(0，0.25，0.50，0.75，1.0，1.5，2.0 mg/ml)的 G418-YPD 抗性平板上进行复筛，挑 取在最高浓度 G418-YPD 平板上生长的菌落进行诱导表达，并提取酵母基因组作为模板，用 通用引物进行 PCR 验证，检验目的基因 bgaB 的插入情况。引物为 Invitrogen 操作手册上提 供的通用引物 5’AOX1 和 3’AOX1。 2.6 重组子的诱导表达 选取能在最高浓度 G418-YPD 平板上生长的菌落进行甲醇诱导表达:挑取阳性单菌落接 种于 25 mL BMGY 增殖培养基中，30?，250 r/min 摇床培养至 OD600=2-6，3000 r/min 离 心 5 min，收集细胞，去除上清，用 BMMY 培养基重悬细胞至 OD600=1.0，30?下继续诱 导培养，每隔 24 h 添加甲醇，使甲醇终浓度保持在 0.5%，摇床培养 4-7 d。 2.7 耐热 β-半乳糖苷酶的酶活测定 [10]按中性乳糖酶酶活检测方法(Gist-Bracades 法)进行。以 ONPG 为底物，一个中性 乳糖酶单位定义为:在 pH6.5 条件下，每分钟水解产生 1 μmol 的 ONP 所需的酶量为一个中 性乳糖酶活单位(NLU 或 U)。对嗜热脂肪芽孢杆菌源酶及其重组酶，反应温度定为 60?。 2.8 SDS-PAGE 分析 [8]用 SDS-PAGE 分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达，分离胶浓度为 12%。 3 实验及结果分析 3.1 pPIC9k-bgaB 重组表达载体的构建 嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热乳糖酶 bgaB 基因编码区为 2016 bp，以质粒 pMA5-bgaB 为模板，PCR 扩增 bgaB 基因全长序列，得到了大小约为 2 kb 片段，与预期相符。将其克隆 入 pPIC9k 载体，经 EcoR I 和 Not I 双酶切验证后，电泳结果表明 bgaB 基因已经成功插入 体中，见图 1。测序结果表明，bgaB 基因序列与原始序列完全一致，也没有发生 pPIC9k 载 移码突变。 图 1 pPIC9k-bgaB 重组质粒酶切鉴定图 Fig.1 Restriction map of recombinant plasmid pPIC9k-bgaB 1: DNA Marker; 2: pPIC9k-bgaB digested with EcoR I and Not I 3.2 重组阳性转化子的筛选 -3- 免费查阅标准与论文: 毕赤酵母 GS115 为组氨酸缺陷型(HIS-)菌株，在不含组氨酸的 MD 平板上不能生长。质粒 pPIC9k 上含有 HIS4 基因，将其线性化后转化 GS115，经同源重组整合到酵母染色体 上会互补宿主菌组氨酸缺陷，使得重组菌能在 MD 平板上生长，实现初步筛选重组子的目 [7]的。将 pPIC9k-bgaB 载体线性化后电转化至毕赤酵母 GS115，在 MD 平板上长出 46 个阳 性菌落，同时将空质粒 pPIC9k 转化至 GS115 中，在 MD 平板上长出 23 个阳性菌落。 重组质粒整合到酵母染色体上的拷贝数的多少决定了目的蛋白表达水平的高低，每一个 重组质粒 pPIC9k-bgaB 中均含有一个 G418 抗性基因，重组酵母细胞对 G418 抗性越高表示 [9]酵母细胞中重组质粒拷贝数越多，通常表达目的蛋白的水平越高。因此为了筛选多拷贝转 化子，本试验用 96 孔板接种共 69 株阳性菌株于 YPD 培养基，转接三次，使各个菌株 OD 值基本相同，再将 69 株菌接种到含不同浓度 G418 的 YPD 平板上培养，随着 G418 浓度的 增大，可生长的阳性菌落逐渐减少。当 G418 浓度达到 1 mg/mL 时，平板上仅有 3 个阳性菌 株生长，用酵母基因组提取试剂盒(TIANGEN)提取阳性菌株的基因组，并用通用引物进 行 PCR 验证，证明 3 株阳性菌株均有目的基因存在，如图 2，说明 bgaB 基因已经成功整合 到毕赤酵母基因组上。 图 2 PCR 鉴定 GS115-pPIC9k-bgaB Fig.2 Identification of GS115-pPIC9k-bgaB by PCR 1: DNA Marker; 2: GS115; 3: GS115-pPIC9k; 4-6: GS115-pPIC9k-bgaB 通用引物可将酵母基因组本身的 AOX1 基因扩增出来，大小约为 2000 bp。pPIC9k 质粒上带有部分 AOX1 基因，大小为 497 bp，连接了目的基因后扩增出的目的片段大小为 2516 bp。由图示结果说明目的基因已成功整合入酵母基因组中。 3.3 重组酵母菌株的诱导表达 将 3 株阳性菌发酵培养，按 1.6 所述方法诱导表达，将发酵得到的菌液离心，用缓冲溶 液将离心得到的菌体重悬，然后进行超声波破壁，破壁后 12000 r/min 离心，上清液有明显 活力，用 1.7 所述的方法进行酶活测定，3 株阳性菌的测定结果分别问 0.19，0.23，0.26 U/mL。 3.4 SDS-PAGE 检测 将发酵后的菌液上清和破壁后的上清液进行蛋白质电泳检测，转入 pPIC9k 空质粒的 GS115 作为阴性对照，发现在 70 kDa 左右有目的条带，见图 3，说明 bgaB 基因得到了表达。 -4- 免费查阅标准与论文: 图 3 GS115-pPIC9k/ GS115-pPIC9k-bgaB 的蛋白表达图谱 Fig.3 SDS-PAGE profile of expressed product of GS115-pPIC9k/GS115-pPIC9k-bgaB : Marker; 2: GS115-pPIC9k; 3-6: GS115-pPIC9k-bgaB1 4 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 本实验首次尝试了耐热 β-半乳糖苷酶基因 bgaB 在毕赤酵母中的整合表达，实验结果表 明，来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的 bgaB 基因已成功转入并整合到毕赤酵母 GS115 基因组上。 蛋白质电泳和酶活测定结果证明 bgaB 基因得到了表达，并检测到了耐热 β-半乳糖苷酶的活 性。但毕赤酵母中重组蛋白的表达受到许多的因素影响，如启动子，宿主，外源基因，培养 [11]条件等，图 3 中目的条带较浅也说明基因表达量较低，因而对于 bgaB 基因在酵母中的高 效表达以及表达条件优化还需进一步的研究。另外，筛选毕赤酵母转化子多拷贝的方法有若 [12]干种，根据 Invitrogen 操作手册，G418 筛选方法会产生多拷贝的假阳性，我们将在后续 的实验中继续尝试多拷贝转化子的筛选。本研究初步探索了耐热 β-半乳糖苷酶基因 bgaB 在 毕赤酵母中的表达策略，并取得了一定得效果，同时，我们在载体构建时在目的基因下游添 加了组氨酸标签，这将为提高表达量后进一步纯化目的蛋白提供简便手段，也为表达产物的 生物学活性分析奠定基础。 参考文献 [1] 郭勇，郑穗平(酶在食品工业中的应用,M,(北京:中国轻工业出版社，1996:67-69 [2] HIRATA H，S Negoro，H Okada，et al(High production of thermostable β-galactosidase of Bacillus stearothermophilis in Bacillus subtilis,J,(Appl Environ Microb，1985，49(6):1547-1549 [3] S Macauley Patrick，ML Fazenda，B McNeil，et al(Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system,J,(Yeast，2005，22:249–270 [4] Joan Lin Cereghino，James M. 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In this work, we studied the expression of the thermostable beta-galactosidase gene bgaB from Bacillus stearothermophilus in Pichia pastoris. bgaB gene was inserted into the shuttle expression vector pPIC9k and the recombinant plasmid was transformed into Pichia pastoris GS115 by electroporation. Three transformants were obtained through MD plate and G418 plate screening. After the induction of methanol, the enzyme activity of recombinant Pichia pastoris strain reached 0.26 U/mL, and the SDS-PAGE showed that the molecular weight was about 70 kDa.… Keywords: thermostable beta-galactosidase; Pichia pastoris; recombinant expression 作者简介:王霁昀(1984)，女，硕士研究生，研究方向:微生物与分子生物学 -6-