[doc] 嗜热厌氧乙醇菌JW200中乙醛脱氢酶的纯化

[doc] 嗜热厌氧乙醇菌JW200中乙醛脱氢酶的纯化 嗜热厌氧乙醇菌JW200中乙醛脱氢酶的纯 化 第30卷第1期 2007年3月 南京师大(自然科学版) JOURNALOFNANJINGNORMALUNIVERSITY(NaturalScienceEditi on) V01.30No.1 Mar,2007 嗜热厌氧乙醇菌JW200中乙醛脱氢酶的纯化 彭惠,毛忠贵,武国干,邵蔚蓝 (1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214036) (2.南京师范大学微生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 重点实验室,江苏南京210097) [摘要]研究了嗜热厌氧乙醇菌 (Thermoanaerobacterethanolicus)JW200中乙醇代谢途径的关键酶之一乙酰 CoA依赖型的乙醛脱氢酶 (acetaldehydedehydlogenase,ALDH,EC1.2.1.10)的纯化.结果表明,经DEAESepha— lOSeFastFlow阴离子交换层析,两次为30%与80%硫酸铵盐析和相 应盐浓度的Butyl—HIC疏水层析,TOYOPE— ARLHW一55F分子筛层析等提纯步骤,可得到电泳纯的ALDH,其 提纯倍数为910倍,得率为7%.由SDS—PAGE 和梯度PAGE测得全酶由4个亚基组成,全酶相对分子质量为 360000,亚基相对分子质量为100000. [关键词]乙醛脱氢酶,嗜热厌氧乙醇菌,纯化 [中图分类号]Q556[文献标识码】A[文章编号】 1001-4616(2007)0l-0078-04 PurificationofAcetaldehydeDehydr0genaseFrom ThermoanaerobacterethanolicusJ,00 PengHui,MaoZhonggui,WuGuogan,ShaoWeilan’ (1.TheKeyLaboratoryofIndustrialBiotechnologyUnderMinistryofEducat ion,SouthernYangtzeUniversity,Wuxi214036,China) (2.TheKeyLaboratoryofMiclObiolEngineering,NanjingNormalUniversit y,Nanjing210097,China) Abstract:Aacetaldehydedehydrogenase(CoA—acetylating)whichisoneofthekeyenzymesofthealco— holmetabolicpathwaywaspurifiedfromThermoanaerobacterethanolicusJ W200throughfollowingsteps: ?ionexchangechromatographyonDEAE—SepharoseFastFlow,? ammoniumsulfatefractionationwith saturation30%andhydrophobicinteractionchromatographyonButyl—HI C,?ammoniumsulfatefrac- tionationwithsaturation80%andhydrophobicinteractionchromatography onButyl—HIC,?gelfiltration onTOYOPEARLHW一 55F.Thepurifiede~ymeshowedasinglebandonSDS—polyacrylamidegelelec— trophoresiswithapurificationof910fold.andayieldof7%.Themolecularwei ghtofthesubunitand thewholeenzymewereestimatedbySDS—PAGEandgradationPAGEas100000and360000,respective— lv. Keywords:acetaldehydedehydrogenase,ethanolicus,purification 0引言 乙醛脱氢酶(acetaldehydedehydrogenaseALDH)广泛地存在于真核生 物和原核生物中,根据对辅酶的 依赖性可以分为3类]:(1)CoA非依赖型,需要NAD(P).广泛分布于动 物,植物,酵母和细菌中;(2) CoA依赖型,不需要NAD(P).存在于一些细菌中;(3)酰化CoA依赖型, 需要NAD(P).仅在几种细菌, 一 种绿藻及一种鱼中发现. 嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacterethanolicus)JW200是一种革兰 氏阳性高温厌氧细菌,能利用廉价 收稿日期:2006-07—28.修回日期:2006—10-09. 基金项目:中国973项目子课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 基金(2004CB719600),国家自然科学基金(30170511)资助项目. 作者简介:彭惠(1979一),女,博士研究生,主要从事极端微生物遗传代谢工程的学习与研究.E—mail:pph0259@126.corn 通讯联系人:邵蔚蓝(1958一),女,特聘教授,博士生导师,主要从事微生物分子生物学的教学与研究.E—mail:wlshao@jsmail.corn.cn 一 78— 彭惠,等:嗜热厌氧乙醇菌JW200中乙醛脱氢酶的纯化 的淀粉,木聚糖等为底物发酵,产生乙醇和CO为主的代谢产物.由于它具有工业生产乙醇的潜力,国 际上对该菌的研究既有利用传统的发酵技术提高乙醇产量,也有通过 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 乙醇代谢途径的各种关键酶深 入研究其代谢机理. 乙酰CoA依赖型的ALDH(EC1.2.1.10)是嗜热厌氧乙醇菌JW200中的乙醇代谢途径的关键酶之 一 .它催化以下反应:乙酰CoA+NADH一乙醛+CoA+NAD+H.然后,乙醛被乙醇脱氢酶催化生成乙 醇.该菌株中的乙酰CoA依赖型的ALDH未见报道.但嗜热厌氧乙醇菌39E中的乙酰CoA依赖型的AL- DH在1994年Zeikus等报道过在厌氧条件下利用特异性亲和柱对其进行了纯化与定性.未见报道嗜热 厌氧乙醇菌中存在其它类型的ALDH.为了深入了解嗜热厌氧乙醇菌JW200中的乙醇代谢途径,填补国内 对此类酶研究的空白,本文首次报道了在非厌氧状态下,主要利用离子交换层析,疏水层析和凝胶过滤层 析对乙酰CoA依赖型的ALDH的纯化研究. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌株 嗜热厌氧乙醇菌ThermoanaerobacterethanolicusJW200(ATCC31550) 由美国佐治亚大学微生物系 J.Wiegel实验室惠赠. 1.1.2化学试剂 乙酰CoA,NAD,NADH购自Roche公司.DEAESepharoseFastFlow为Amersham产品;Butyl—HIC为 BIO—RAD公司产品;TOYOPEARLHW一55F为SOTOHAAS公司产品. 1.2方法 1.2.1培养基和培养条件 嗜热厌氧乙醇菌的培养方法见参考文献[2].2%的接种量培养30L发酵液,69~C培养15h. 1.2.2ALDH的酶活测定方法 1mL酶活测定体系中含 50mmol/LTris—C1(pH8.0,65?);0.5mmol/LNADH;5mmol/LDTY; 0.5mmol/L乙酰CoA和酶.加乙酰CoA前,反应体系于65?预保温10min,以排除其它与NADH偶联的 氧化还原酶的干扰,再加乙酰CoA反应15rain,确保NADH的氧化是与乙酰CoA偶联,冰浴终止反应.计 算NADH在340nm处读数的降低值.空白对照用等体积的去离子水代替乙酰CoA.酶活定义以1~mol/ min的速率氧化NADH为一个酶活单位. 1.2.3蛋白浓度的测定和蛋白电泳 用Bradford法测定蛋白质质量浓度.以小牛血清白蛋白为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 蛋白.SDS—PAGE和梯度PAGE电泳 按参照文献[6]进行. 1.2.4ALDH的纯化 酶的纯化按以下步骤完成,所有操作在常温空气中进行.缓冲液A(20mmol/LTris—C1pH8.0;10% (v/v)甘油,5mmol/LDTY,0.02%叠氮钠)煮沸排除O:,充N:的条件下冷却. (1)制备粗酶液:细胞离心收集,缓冲液重悬后用高压细胞破碎仪在 1.03×10kPa压力破壁.40000 ×重力离心力1h,上清为粗酶液. (2)DEAESepharoseFastFlow阴离子交换层析:粗酶液上用缓冲液A平衡的阴离子柱(2.5× 27cm).用0,0.3mol/LNaC1浓度梯度洗脱,流速6mL/min,6mL/管收集.检测酶活和蛋白浓度.收集有 酶活的管. (3)硫酸铵盐析I与Butyl—HIC疏水层析I:对上一步的酶液做30%的硫酸铵沉淀,离心后收集上 清.沉淀中无酶活.上清液泵入用缓冲液B(缓冲液A中添加2mol/L硫酸铵)平衡好的疏水柱(1.5× 9cm),流速lmL/min,收集不能与填料结合的流出蛋白液.ALDH在该盐离子浓度下不能与疏水柱结合, 存在于流出液中. (4)硫酸铵盐析?与Butyl—HIC疏水层析?:对上一步的酶液做80%的硫酸铵沉淀,离心后收集上 清.沉淀中仅有少量酶活.上清液上用缓冲液c(缓冲液A中添加4.5mol/L硫酸铵)平衡好的疏水柱(1.5 — 79— 南京师大(自然科学版)第30卷第1期(2007年) x9cm),流速1mL/min,进行4.5,2rnol/L硫酸铵梯度洗脱.2mL/管收集,检测每管酶活和蛋白浓度.收 集有酶活的管.超滤浓缩酶液至终体积约2mL. (5)TOYOPEARLHW一55F分子筛层析:酶液上用缓冲液D(缓冲液A中添加0.15mol/LNaC1)平衡 分子筛层析柱(2.5×75cm),流速0.6mL/min,2mL/管进行收集.检测酶活性和蛋白浓度,把每管有酶活 的蛋白进行SDS—PAGE检测,经检测后将单一蛋白条带的管合并备用. 2结果与讨论 2.1ALDH的分离纯化 国外已报道的来源于其它物种的酰化CoA依赖型的ALDH的纯化均是在厌氧环境下利用特异性亲 和柱实现纯化的’引,这是由于此类酶的巯基易被0氧化而导致酶失活.本实验受条件限制,在非厌氧 条件下利用常规的柱层析等分离纯化技术从嗜热厌氧乙醇菌JW200的胞内蛋白中分离纯化得到此类AL— DH,比活为18.2U/mg,纯化倍数为910倍,高的纯化倍数是由于酶在纯化过程中不断失活,另外ALDH酶 量较少.厌氧条件下利用特异性亲和柱纯化的菌株39E中的ALDH,其比活为16U/mg,纯化倍数为142 倍.非厌氧环境中酶的保护主要依靠DTF.酶在含DrlT的缓冲液中冰 上可以维持活性6,7d.已失活的酶 在厌氧环境中存放过夜可以部分恢复活性.这也表明主要是氧化导致酶的失活. DEAESepharose阴离子交换层析中,ALDH在盐离子浓度约90mmol/L处洗脱,但未形成独立的峰. 利用ALDH疏水性较弱的特点,采取了2次硫酸铵沉淀结合疏水层析的策略.第一次2mol/L硫酸铵的浓 度下,ALDH不与疏水柱结合,去除了大量结合到柱上的杂蛋白.第二次4.5mol/L硫酸铵的浓度下,ALDH 与柱结合,洗脱时,酶活集中在第一个峰.超滤浓缩酶液,超滤中DrlT浓度小于5mmol/L时,酶活丧失加 剧,补加DTF,可改善酶失活情况.分子筛层析中,酶活集中在第一个峰,用SDS—PAGE检验纯度,得到纯 酶.各步纯化情况见表1和图1.纯酶用来转膜测定蛋白N端序列,已经克隆出其基因,结果另文发表. 表1嗜热厌氧乙醇菌JW200中乙醛脱氢酶的纯化 Table1PurificationoftheALDHfromethanolicusJW200 2.2ALDH的相对分子质量 纯化的ALDH在SDS—PAGE上呈现一条带,亚基相对分子质量约为100000(见图1,7号泳道).在 3%,30%的梯度PAGE电泳中,纯化的ALDH全酶相对分子质量约为360000(见图2),表明ALDH全酶 一 8O一 1,6:标准蛋白的相对分子质量;2:全细胞蛋白;3:DEAE SepharoseFastFlow阴离子交换层析;4:Butyl—HIC疏水层 析I;5:Butyl-HIC疏水层析II;7:纯化的ALDH 图1SDS_I.AGE电泳图 Fig.1SDS-PAGE 1:活性标准蛋白的相对分子质量: 2:纯化的ALDH 图23%一30%梯度PAGE电泳图 Fig.23%-30%nativegradientPAGE 彭惠,等:嗜热厌氧乙醇菌JW200中乙醛脱氢酶的纯化 3结论 本研究纯化的ALDH属于NAD,酰化CoA依赖型的氧化还原酶,胞内含量少,易氧化失活,这给纯化 带来了很大的困难.采用常规柱层析技术等从嗜热厌氧乙醇菌JW200的胞内蛋白中分离纯化得到易氧化 失活的ALDH,比活为l8.2U/mg,纯化倍数为910倍.SDS-PAGE显示酶的亚基相对分子质量约为100 000,梯度PAGE显示全酶相对分子质量约为360000,可能是由4个亚基组成. [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [参考文献] YRuntao.ChenJS.CoenzymeA—acylatingaldehydedehydrogenasefrom ClostridiumbeijerinckiiNRRLB592[J].Appl EnvirMicro,1990,56(9):2591—2599. WiegelJ.Thermoanaerobacterethanolicusgen.nov.,spec.nov.,anew,extremethermophilic,anaerobicbacterium[J].Arch Microbiol,1981,128(5):343—348. HildHM.StuckeyDC,LeakDJ.Effectofnutrientlimitationonproductformationduringcontinuousfermentationofxylose withThermoanaerobacterethanolieusJW200Fe(7)[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2003,60(12):679-686. BurdetteDS,VieilleC,ZeikusJG.CloningandexpressionofthegeneencodingtheThermoanaerobacterethanolicus39E secondary—alcoholdehydrogenaseandbiochemicalcharacterizationoftheenzyme[J].BiochemJ,1996,316(1):115—122. 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