大口静灰球体外抑菌实验研究_20754

大口静灰球体外抑菌实验研究_20754 大口静灰球体外抑菌实验研究 [标签:来源] 作者:翁丽丽，王淑敏，朱娜，宋启印 【摘要】 目的观察大口静灰球不同溶剂浸提液体外抑菌效果。方法以金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、绿脓假单胞菌、枯草芽孢杆菌为受试菌，采用对倍稀释法测定大口静灰球不同溶剂浸提液体外最低抑菌浓度(MIC)，并通过测定平板内抑菌圈直径观察其体外抑菌效果。结果实验 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，95%乙醇、醋酸乙酯、三氯甲烷浸提液对以上4种细菌均有不同程度的抑制作用。结论大口静灰球具有一定的抑菌作用，可用于抗菌药物的研究开发。 【关键词】 大口静灰球; 体外抑菌 马勃是一种常见的用于消肿、解毒和止血功用的药用真菌，近年来，马勃在抗菌和抗癌方面的作用，也受到广泛关注[1]。《中国药典》规定大马勃Calvatia gigantea (Batsch ex Pers.)Lloyd.、紫色马勃Calvatia lilacina (Mont. et Berk.) Lloyd和脱皮马勃Lasiosphaera fenzlii Reich. [2]为中药马勃的来源。全国很多地区也用大口静灰球 Bovistella sinensis Lloyd.子实体作马勃入药。大口静灰球来源于马勃科、静灰球菌属，分布地区主要是河北、河南、山东、吉林、江苏等地，含有多种氨基酸、无机盐、麦角甾醇、类脂质及马勃素等成分。 1 材料与仪器 1.1 药材实验用大口静灰球干燥子实体Bovistella sinensis Lloyd购于吉林省仙草药材公司。 1.2 供试细菌菌种金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，ATCC25923;大肠埃希氏菌Escherichia coli， ATCC44186;绿脓假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，ATCC10105;枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，History ? ISF ? AS 1.21，由长春中医药大学微生物实验室提供。 1.3 药品和试剂95%乙醇、醋酸乙酯、三氯甲烷、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、琼脂粉、医用酒精等(皆为分析纯)。 1.4 仪器YXQ-I，S.50S II立式高压蒸气灭菌器; METTLE TOLEDO型电子天平;HG303.4K电热恒温培养箱;DHG.9070A型电热恒温鼓风干燥箱 ;BCN.1360型生物洁净工作台 ;KQ-250DB型数控超声波清洗器;PH B-4便携式酸度计。 2 方法 2.1 供试细菌培养 2.1.1 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制备液体培养基:牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 ml加热溶解，调节pH 7.0,7.2。固体培养基:牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 ml，琼脂20g，加热溶解，调节pH 7.0,7.2，于121?高压蒸气灭菌30 min后制备细菌平板培养基[3，4]。 2.1.2 供试菌液的制备将各菌种分别接种到已标好菌种名称、株号、日期的斜面试管上，然后于37?恒温培养箱中培养24,48 h。挑选生长在琼脂上的纯菌落，直接用0.9%生理盐水稀释比浊到3号麦氏比浊管，浓度(9×108 cfu/ml)，再1?10稀释，制备好的供试菌液备用。 2.2 4种溶剂浸提液抑菌原液的制备将干燥的大口静灰球子实体剪去根部，保留不孕基部，粉碎后分别称取5 g分装于250 ml的三角烧瓶中，分别用100 ml的水、95%乙醇、醋酸乙酯、三氯甲烷浸渍24 h，超声(温度40?、频率60Hz)30min后抽滤，重复浸提3次，合并相同溶剂浸提液，回收溶剂至剩余量大约5ml，移入已称重的小安瓿瓶中，于60?水浴浓缩，后60?烘干，称重，计算大口静灰球子实体以不同溶剂超声浸提的得率，分别为3.056%，2.901%，1.212%，0.936%。分别吸取2 ml相应的溶剂，作为子实体抑菌原液备用。以上4种溶剂浸提液的抑菌浓度分别是76.40，72.53，30.30，23.40 mg/ml。以无菌水、95%乙醇、醋酸乙酯及三氯甲烷各2 ml为阴性对照。 2.3 抑菌圈法测定大口静灰球4种溶剂浸提液的抑菌效果将已制好的菌悬液0.1 ml接种于平板上，用无菌刮铲涂匀,盖好平皿，做好标记，放置 5 min，待平板表面水分吸收后，用直径5 mm无菌金属打孔器在平皿内打孔，每皿3个孔,除去洞内琼脂，分别用微量移液器吸取40 μl 4种大口静灰球浸提液及相应阴性对照空白溶剂至孔中，以溶剂充满整个孔为宜，每皿3个孔为相同大口静灰球浸提液或者空白溶剂，并重复实验两次。将培养皿置于37?恒温培养箱中培养24,48 h后，取出观察，用游标卡尺测量并记录抑菌圈直径，试验重复3次，计算各样品抑菌圈直径平均值[5]。 2.4 最低抑菌浓度(MIC)的测定取无菌小试管40支排于试管架，于每行第1管加入牛肉膏蛋白胨液体培养基0.8 ml，2,10管各加0.5 ml，于121?高压蒸气灭菌30 min后备用。于每行第1管分别加入大口静灰球4种溶剂浸提液0.2 ml，混匀后取0.5 ml加入第2管，依次倍比稀释，自第9管吸出0.5 ml弃去，第10管系对照管。将各试管中加入以上菌悬液0.05 ml，混匀后放置37?培养24,48 h，观察结果。以药液最高稀释管中无细菌生长者，该管的浓度即为该细菌对此药物的敏感度，即MIC[6，7]。 3 结果 3.1 大口静灰球4种溶剂浸提液的抑菌结果大口静灰球子实体的水、95%乙醇、醋酸乙酯 和三氯甲烷4种溶剂浸提液，阴性对照无菌水、95%乙醇、醋酸乙酯和三氯甲烷溶液，对金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌，大肠埃希氏菌和绿脓假单胞菌的抑菌作用见表1。 实验结果表明大口静灰球子实体的95%乙醇、醋酸乙酯和三氯甲烷3种浸提液对所测试细菌均有不同程度的抑菌作用。其中以上3种浸提液对金黄色葡萄球菌平均抑菌圈直径(φ)均大于10 mm，小于15 mm，抑菌效果较好;对枯草芽孢杆菌三氯甲烷浸提液抑菌圈直径大于10 mm，小于15 mm，抑菌效果较好。醋酸乙酯和95%乙醇浸提液φ大于5 mm，小于10 mm，抑菌效果稍次;对大肠埃希氏菌醋酸乙酯浸提液φ大于15 mm，抑菌效果最佳。95%乙醇浸提液φ大于10 mm，小于15 mm，抑菌效果较好。三氯甲烷浸提液φ大于5 mm，小于10 mm，抑菌效果稍次;对绿脓假单胞菌醋酸乙酯和三氯甲烷浸提液φ大于10 mm，小于15 mm，抑菌效果较好。95%乙醇浸提液φ大于5 mm，小于10 mm，抑菌效果稍次;水浸提液对以上4种测试细菌均无抑菌作用。阴性对照组中三氯甲烷对金黄色葡萄球菌有不显著抑菌作用，其他溶剂对其余3种测试细菌均无抑菌作用。 3.2 最低抑菌浓度(MIC)的测定结果大口静灰球子实体的95%乙醇、醋酸乙酯和三氯甲烷3种浸提液对测试细菌的抑制作用的最低抑菌浓度(MIC)如表2所示。 从表2可见样品95%乙醇浸提液对这4种细菌的最小抑制浓度(MIC)均为14.505 mg/ml;醋酸乙酯浸提液对金黄色葡萄球、枯草芽孢杆菌的MIC为6.060 mg/ml，对肠埃希氏菌、绿脓假单胞菌的MIC为3.030 mg/ml;三氯甲烷浸提液对枯草芽孢杆菌的MIC为2.340 mg/ml，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和绿脓假单胞菌的MIC为4.680 mg/ml。表1 大口静灰球子实体不同溶剂浸提物对测试菌的平均抑菌圈直径表2 大口静灰球不同浸提液对供试菌的最低抑菌浓度 4 结论 本实验采用抑菌圈法和对倍稀释法对大口静灰球子实体4种不种溶剂浸提液对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌和绿脓假单胞菌4种测试菌的抑菌活性进行了研究。实验结果表明除了水浸提液以外其他3种溶剂浸提液对测试菌都有不同程度的抑制作用，提示中药材马勃中大口静灰球在抗菌药物开发方面有很大的潜能。 【参考文献】 [1] 赵会珍，胥艳艳，付小燕，等.马勃的食药用价值及其研究进展[J].微生物学报，2007，34(2):367. [2] 国家药典委员会.中国药典，?部[S]. 北京:化学工业出版社. 2005:33. [3] 陶申傲，李 绩，岳国海，等.榆耳发酵液抑菌成分的初步研究[J].食品与发酵工业，2006，32(2):33. [4] 谭敬国，胡亚平，吴晗晗. 竹荪抑菌作用研究[J]. 食品科学，2000，21(10): 54. [5] 陈 丽，李晓明，张鞍灵，等.黄硬皮马勃浸提物抑菌活性初步研究[J].西北农业学报.2006,15(3):87. [6] 付 明，刘胜贵，伍贤进.苍耳与灰白毛莓的体外抑菌作用对比研究[J].时珍国医国 药，2006，17(2):200. [7] 郑钧镰，王光宝.药品微生物学及检验技术[M].北京:人民卫生出版社，1989:350.