糖类的高效毛细管电泳

有机化学 器一 YOUJI HUAXUE，1998，j8 88--96 学术动态 ／ 糖类的高效毛细管电泳 张剑波 田庚元 (中国科学瞬王焉： 化卓 海200032) ‘ 摘要 高教毛细管电泳以其快速、高教、简便、高分辨率、样品和溶剂消耗步及易于仪器化等优点正成为生物 活性分子分离和分析工作中的一个重要工具。介绍了作为四大基本生命物质之一的糖类化台物的高效毛细管电 泳研究进展，包括 CZE、CGE、MB∞ 和 CITP等四种分离模式以及直接紫外债 光法、间接紫外债 光法、示差法、电 化学法和质谱法等五种检测方式。并简要介绍 HPCE在单糖、寡糖和多糖分离与分析中的应用。展望了 HPCE用 于单个细胞中糖类组分的研究前景。 关键词 糖类，毛细管电泳，单糖，寡糖，多糖 ／-4p， 高效毛细管电泳以其快速、高效、简便、高分辨率及样品和溶剂消耗少等优点在最近十几年内 正成为分离和分析生物活性物质的有力工具之一。科学家们已利用毛细管电泳对生物大分子．如： 蛋白质、多肽、核酸等进行了许多深入的研究_l-，而在生命过程中作为信息载体和四大基本生命物 质之一的糖类化合物，由于其自身结构的高度复杂性和分离检测的困难使得糖类化合物的高效毛 细管电泳较之其它生物分子存在着更多的问题和困难。下面试就近年来糖类化合物，尤其是寡糖 的毛细管电泳方面的研究进展作一简要评述。 HPCE虽然可以分为 CZE(CapiUary zone electrophoresis，毛细管区带电泳)、CGE(Capillary耐 electrophoresis，毛细管凝胶电泳)、MECC(Micelhr electrokinetic capillary chromatography，胶束电动 毛细 管 色 谱)、CEC(Capillary dectrochmmatography，毛细 管 电色 谱)、CIEF(Capillary iscele~'trofocusing，毛细管等电聚焦)和 CITP(Capillary isotachophoresls，毛细管等速电泳)等六种分 离模式，但目前在糖化学中常用的仅前三种模式。 1 毛细管区带电泳 其原理是不同的溶质在均一的缓冲溶液体系中根据其电泳淌度的不同而分离成为独立的区 带。下面根据糖类分子是否进行衍生化反应以利于检测加以分类说明。 1．1 未衍生化的糖类： 1．1．1 直接紫外或荧光检测法： 因为大多数的糖类化合物没有合适的发色基团或荧光基团，所以对其直接进行紫外或荧光检 测都是十分困难的，检出灵敏度一般为nmol级。少数糖类在紫外区(232nm)有显著的紫外吸收， 这样检出限可提高到fmol级【 ，如糖胺聚糖酶解所得的酸性二糖片断，低分子量的肝素碎片以及 含有 N一乙酰葡萄糖胺、N一乙酰半乳糖胺和唾液酸残基的寡糖。未衍生化的单糖和寡糖若与硼 酸盐形成络合物，则其在 195rim处的紫外吸收会有 2--20倍的增加_3_，尽管如此检出量也需 ng水 平。与硼酸形成络合物还可以增加糖类的电迁移能力和对立体差异糖的分离能力。提高温度则会 1996—1l一13收稿，1997—03—03修回。 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 1期 张剑波等：糖类的高效毛细管电泳 增加检测灵敏度。 圈1 麦芽糖、麦芽四糖 和麦芽六糖一ANTS衍生 物的 CZE分离图谱 (出峰依次为 ANTS 芽糖一 ANTS、麦芽四糖 一ANrs和 麦芽六糖 一ANTS) F'堰．1 Rapid Separation ofANTS—derNatized rnalto—oligosaceharides (San】pIe e~ratx3nents in coder of sppearaoce：A ．ANTS一 1．1．2 间接紫外或荧光检测法： 这种方法是利用没有紫外吸收的糖类化合物可以替代背景电 解质中加入的紫外或荧光物质而观察到负峰以实现对糖类化合物 的检测。这种技术对于通常无法衍生化的非还原性寡糖以及醛糖 酸的鉴定非常有用。糖类化合物若带固有负电荷则灵敏度会更高， 如对于D一葡糖酸和 D一半乳糖酸，检测灵敏度可达 18frnol(S／N =5)【 ，当使用 5一磺基水杨酸作为背景电解质和发色物质时，对 含羧酸和磺酸基 团的合成肝素片断的检测灵敏度则可达 ～ 5hnol【 。 1．1．3 示差捡测法： 除了紫外和荧光法外，示差检测也是易行的方法。激光型的示 差检测可达 fmol数量级，线性动态范围亦超过三个数量级_。J。 1．1．4 电化学检测法： 这是一种适用于简单糖、糖醛酸和糖醇的简便、灵敏和选择性 的检测方法，其质量检出限(0．5fmo1)远远高于目前常用的 }Ⅱ，AEc — PAD方法 -。PAD 除了具有灵敏度高的优点，还因为使用了脉 冲安培技术从而消除了电极的括染问题，但该方法对糖类物质也存 在着专一性差、响应值变化大和使用较高 PH等不足 J。 1．1．5 质谱检 测法： 质谱由于其精确的定性能力和样品需要量少的特点，使其在各 种 cE检测器中崭露头角。连续流动 FABMS和 ESI—MS都可实 现在线(on—line)和灵敏度高达 amol--fmol的定性检测 J。 1．2柱前衍生化的糖类： 柱前衍生化方法主要是通过化学反应使糖类化合物带上适当 的发色或荧光基团以提高其紫外和荧光检测的灵敏度，还可使糖类 化合物带上固有电荷以改善通常呈中性的糖类分子的电迁移性能； 此外由于具同一还原端的不同寡糖具有唯一的紫外或荧光响应值， 从而给糖类的定量分析带来方便。 许多衍生化反应都可使糖类带上合适的基团并提高其检出限 至fmol--anaol级。这些方法大都基于还原氨基化反应，即糖分子 的还原端与带发色或荧光基团的伯胺反应成为 Sehiff’s碱，再利用 ‘ ， 一 N出 CN还原成仲胺一。0l，例如2一氨基吡啶(2一 n{nDp dine，2 1= ’ 、一AP)法⋯】、4一氨基苯甲酸(4一Amlnobenzo{cacid，4一ABa) 法_l 、CBQCA(3一(4一羧基苯甲酰基)一2一喹啉甲醛，3一(4一 Carhoxybenzy1)一2一quinolinecarhoxaldehyde)~Ll3J、PMP(1一苯基一3一甲基 一5一吡唑啉酮+l— Phenyl一3一methyl一5一pyrazolone)／PMPMP(1一对甲氧基苯基一3一甲基 一5一吡唑啉酮，1一(P — Methy1)phenyl一3一methyl一5一pyrazolone)；~_1 或 AN "IS(8一氨基萘基一1，3，6一三磺酸，8一 Aminonaphthalene一1，3，6一trisulfonlcacid)法_1 。其中AN TS法是一个典型的代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf ，这种方法除 _【 x 吕口 若￡《q』0 c 维普资讯 http://www.cqvip.com 有 机 化 学 1998庄 了可以起到在糖分子中引人发色和荧光基团外，还能使之带上固有电荷。这样分析的速度得以加 快(图 1)，分离效率也得到提高(图2)【l 。另外，衍生物的检测既可以用紫外检测，也可用 He—cd 激光间接荧光的方法检测，灵敏度分别可达fn”l和 amol级。除此以外，尚有一些特殊的柱前衍生 耋 甍 l0 20 rain 图2 平均分子■为18．300的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品A．Ⅵs衍生物的既E分离图谱 (数字代表单糖聚合度) Fig．2 CZE Separation diagram of a dextran standard with an average molecular weight of 18．300 (1、hemrmbersindicatethe d．P．of gIu∞se) 化方法[”]。衍生化试剂的选择主要是基于感兴趣的糖类的性质及其所存在的介质和所使用的仪 器。对于不含氨基的非还原糖类，如甲基甙、糖醇和蔗糖、海藻糖、棉籽糖等，目前尚无合适的衍生 化方法。 2 毛细管凝胶电泳 CGE是经典的凝胶电泳在毛细管中的推广。由于毛细管中凝胶呈杂乱的螺旋状，其中的空隙 可以使欲分离的物质按分子大小以不同速率通过而得以分离。另外 ，盘绕的凝胶还有助于减少扩 散、防止样品在管壁的吸附，也消除了电渗，从而达到提高柱效的目的，因此 CGE的理论柱效可高 达几千万，是一种很有发展前途的分离寡糖和多糖的手段。但这种技术 目前主要用于 DNA的顺 序分析 ，这是因为 CGE相对于常用的CZE方式比较复杂，带电组分迁移较慢，且制胶 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 要求 较高，制得的凝胶在高的电流密度下不稳定；在检测方面，由于聚丙烯酰胺凝胶在短波长区有紫外 吸收，所以使用的检测波长必须大于 220nm，这也限制了对糖类的检测，因此糖类化合物的CGE研 究较少 一般使用 CBQCA进行柱前衍生化，并与 LIF检测法连用。至于其它检测方法如质谱等 还未见报道。 ● ● ～ 她 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 1胡 张剑牧等：糖类的高效毛细管电泳 91 0 20 40 60 80 t(rain) 图3 聚半乳糖醛酸裂解产物的CBQCA衍生物的CGE分离图谱(18％T，3％C) F ．3 Separation of oligomers derived with CtK~A from an autoclave hydrolysis of poly(galacturonie acid)Poly(aerylamide)gd concentration(18％T，3％C) 在具体实用中因为相差一个糖单位所引起的分子大小的差异比较小，所以一般需要用交联度 较大的聚丙烯酰胺凝胶才能对糖类分子进行比较好的分离。uu等分别用 10％和 18％的交联聚 丙烯酰胺凝胶对部分水解的 Dextranl5和酶解的硫酸软骨素进行电泳分离【19 ；分离麦芽糖、麦芽 四糖、麦芽六糖则需用 25．5％聚丙烯酰胺凝胶(C=3％) -；高压釜中裂解的聚半乳糖醛酸经荧光 标记后的电泳图谱显示出～7O个碎片(图3)l2 ；从人脐带中提取的透明质酸用牛睾丸透明质酸酶 消化后的 CGE可得～4O个峰l驯 对于大分子量的多糖而言，由于分子太大以致一般不能穿透凝胶的空隙，所以它们的分离需要 用到脉冲场技术。丑J。比如在线状聚丙烯酰胺凝胶中使用脉冲场电泳技术可以获得非常好的 Dextran分子量标准的电泳图谱(图4) 3 胶束电动毛细管色谱 一 般而言，亲水性的糖类化台物分子不易进入水相中悬浮的胶束内，而形成两相之间的分配。 所以糖的MECC并不有利。但缓冲液中加入 SBS会改善 CE的峰型和分辨能力[ ，原因可能是 SDS的电泳淌度与所要研究的糖化合物的相接近而降低了溶质与背景电解质之间的电导差异，从 而减轻了峰的拖尾。 维普资讯 http://www.cqvip.com 有 机 化 学 1998矩 l z j — 0 20 40 60 '80 图4 标准分子■ Dextran的脉冲场CGE分离图谱l4％T，3％c) (峰1：8 8kDa，2：39．1kDa，3：70 0kDe，4：503 0kDa，5：667．8kDa，6：2，000kDa，所加电压 lOkV，频率3}k) Fig．4 Separafion of polydextran stan~"ds by pulsed—field capiflary gel electrophoresis(4％T，3％C) (Peak assignments are 1：8．81d3a，2；39．1kDa，3：70．0kDe， 4：5o3．0kDa，5：667 8kDa，6：2，000kDa Applled voltage，10kV；and frequ~-'y，3}k) 中性和唾液酸化的 N一连接的寡糖在 SDS胶束中有少量的分配效应，而且其不带电荷的部分 的分配效应的大小随离子化的唾液酸残基数目的增加而降低。但由于唾液酸化的寡糖的固有电荷 在分离过程中占主导地位，所以电泳匿谱中除中性寡糖与电渗流明显分开外，唾液酸寡糖的分离效 果未见改善。再向缓冲液中加人M ，会引起电渗流的显著降低导致观测时间窗(Time Window) 的增加，进而增加了MECC中各组分间的分离程度。另外 M 因为能与糖分子络台，寡糖，主要 是单唾液 酸 化 的寡 糖 的分 离 效果 可 以得 到 进 一 步 的改 善 J。用 4一氨 基 苄腈 (4一 Aminobenzonitrile)对糖进行柱前衍生化可以提高其脂溶性。显然，相对亲水性的糖类衍生物在胶 束中分配较少，它将以与电渗流近似的速度迁移；而相对疏水性的糖类衍生物，象脱氧六碳醛糖，则 几乎全部分配在胶束中，这样它们的流出时间就相对较长一点。使用这种方法可以提高糖的 CE 的分辨能力，并且可以得出不同糖保留时间的一般顺序：六碳酮糖<二糖、三糖<六碳醛糖<五碳 醛糖<脱氧六碳醛糖(图5) 。尽管在 CZE中通过选择不同的衍生化试剂来提高糖一硼酸络台 物的分离效果，其作用并不明显，但 4一氨基苄腈衍生物的 MECC对糖的分离效果却有重要贡献。 譬如对葡萄糖和果糖，无论用何种衍生化试剂其衍生物与硼酸形成的络台物用 CZE无法做到基线 分离；而利用 4一氨基苄腈衍生物进行 MECC则可在很短的时问里得以清楚的分离。另外它还能 区分果糖和山梨糖还原氨基化以后所得的互为非对映异构体的产物。总的来说，糖的4一氨基苄 腈衍生物的MECC方法是目前中性单糖和二糖分离中最为有效和最具选择性的方法。 常理文等人对寡糖的 a一萘胺衍生物进行了 MECC研究，发现分离效果优于 CZE方式[2 。 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 1期 张剑渡等：糖类的高教毛细管电泳 最近又有报道 ，利用 a一氨基吖啶酮对糖类分子衍生化以后，脱氧牛磺胆酸钠作为表面活性剂进行 MECC分离，取得了非常好的效果[ 。很有意思的是不同糖的保留时间随着分子大小的增加而减 少，另外若在缓冲液中加人口一环糊精，则单糖的 D，L一差向异构体亦能得到良好分离。 R 0 2 4 6 ( m 1n)；B n 图5 一些单糖和二糖的 4一氨基苄腑衍生物的ME(]c分离图谱 ． (喙 M：甲醇 ，Ia-．．'b：D一果糖，2a／b：L一山梨糖 3：乳糖．4：蜜二糖 ，5：纤维素二糖，6：麦芽四糖， 7：麦芽糖，8：D一甘露糖 ．9：D一葡萄糖，10：D一半乳糖，11：D一棱糖，12：L一鼠李糖． 13：D一来苏糖 ，14：D一阿拉伯糖 ，15：D一岩藻糖，16：D一木糖 ，R：衍生化试剂) F．幔．5 ⅣIECC of a／llixttire of nlono— and oligo—saccharides derlvatlzed with 4一aminobenzonltrile (Zone idemification：M，meth~ol；1 a／b：D—fructose， 2 a／b：L—sorhose，3：lactose，4：mellblcse，5：cellcbiose，6：malwtriose，7： mahcse．8：D一Ⅱ1anr跚 ，9：D—glucose，10：D一出 “ ，II：D—ribose，12： L—d埔rnn。Be，13：D—lyxose，14：D—amblnc~et 15：D—fuc~e．16：D—xyI∞e，R：reagem) 4 毛细管萼速电泳 关于糖类化合物的 CITP报道得不多，检测主要是通过电导法。这方面的研究工作有：透明质 酸类寡糖酶解活力的测定[2 、藻类酸性多糖的分析[ 、羧甲基纤维素水解所得羧甲基 一D一葡萄 糖的分析 ]。 5 总结 概括而言之，糖的 CE研究工作正方兴未艾地得到开展。CE作为一种极有前途的分离、分析 工具，必将与当前糖化学工作中普遍使用的 H1％C互为补充、各显其能(如下表所示)。特别是 CE 的快速、高教和样品消耗少等优点，对于开展生物体内极微量和短半衰期以及分子量更大的活性糖 分子的研究提供了极大的便利。目前使用 CZE已经可以进行单个细胞中无机离子、氨基酸、神经 递质、蛋白质、酶等成分进行定性和定量的分析研究[圳，相信在不远的将来细胞和亚细胞水平的超 维普资讯 http://www.cqvip.com 有 机 化 学 1998正 微量糖类化合物，甚至单个糖分子，的分析研究亦将取得长足的进步，这必将对人类更加清楚地认 识和理解生命现象中的信息传递和转导过程提供巨大帮助。 致谢：衷心感谢章广韬博士、邓绍江博士和卢保元博士在论文修改过程中给予的帮助。 2 参 考 文 献 (a】Heiger D N “High Performance Capillao·Electrophoresis”，Hewlett Packard company，France，l992 (b)Grossman PD，Colbtun J C．“CapillaryElectrot~oreds：Thoe~ andPractice ，Acad~rac Press，SanDiego 1992 (c)PerrettD，RossG TrendsAnol Chem．，1992，11：156 (a)Al—Hakim A，Ijrthardt R J．Ana1．Biochem 1991，195：68 (b)Damm J B L，OverldiftGT，VermeulenBW M，F1 uitSl~kaCF，V~DederstGW．J Chromatogr．1992 608 297 (c)HermeminP，wi把d R，DoengesR，BauerR，l-lauptH，PatelT，ParekhRB，Br~zelD．A ．B~x'hem 1992 206：419 (d)Tavema M，B0illet A，Biou D，Scb．1uter M，Wemer R，Ferrier D．Electrophoresis，1992，13：359 呲 tetter—Kuhn S，Paul邮 A，Gammann E，Widmer H M ．Ano／．CAem ．199l 6了：1541 Berghddt A，()ve 1日rd J，CA d~tg A，Frederesken R B J Chromatogr．1993，644：412 Dsrfirl2J B L，OverldiftGT．J Chromatogr．，1994，678：151 (a)BllllioAE，KrattigerB，MaystreF，Widme~HM．Anal Chem 1991， ：2689 (b)任吉存，何金兰，邓延倬，程舟克．高等学校化学学报1993，14：1661 Ye 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