紫外快速测定法
一、原理:
Vc的2.6—二氯酚靛酚容量法,操作步骤较繁琐,而且受其它还原性物质、样品色素颜色和测定时间的影响。紫外快速测定法,是根据Vc具有对紫外产生吸收和对碱不稳定的特性,于243nm处测定样品液与碱处理样品液两者消光值之差,通过查标准曲线,即可计算样品中Vc的含量。
二、实验器材:
紫外分光光度计、
离心机、
分析天平、
容量瓶(10ml, 25ml)、
移液管(0.5ml,1.0ml)、
吸管、
研钵。
三、实验试剂:
10%HCl:取浓盐酸133ml,加水稀释至500ml。
1%HCl:取浓盐酸22ml,加水稀释至100ml。
1M NaOH溶液:称取40gNaOH,加蒸馏水,不断搅拌至溶解,然后定容至1000ml。
四、操作步骤:
(一)标准曲线的制作
1.抗坏血酸标准溶液的配制:用分析天平准确称取抗坏血酸10mg,加2ml 10%盐酸,加蒸馏水定容至100ml,混匀。此抗坏血酸溶液的浓度为100μg/ml。
2.取带塞刻度试管8支并编号,分别按
表
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内所规定的量加入抗坏血酸标准溶液和蒸馏水。
1
2
3
4
5
6
7
8
标准抗坏血酸溶液加入体积(ml)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.8
1.0
蒸馏水加入体积(ml)
9.9
9.8
9.7
9.6
9.5
9.4
9.2
9.0
总体积(ml)
10.0
10.0
10.0
10.0
10.0
10.0
10.0
10.0
抗坏血酸溶液浓度(μg/ml)
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
8.0
10.0
3.消光值的测定:以蒸馏水为空的,在243nm处测定标准系列抗坏血酸溶液的消光值,以抗坏血酸的含量(μg)为横坐标,以相应的消光值为纵坐标作标准曲线。
(二)样品的测定
1.样品的提取:将果蔬样品洗净、擦干、切碎、混匀。称取5.00g于研体中,加入2-5ml 1% HCl,匀浆,转移到25ml容量瓶中,稀释至刻度。若提取液澄清透明,则可直接取样测定,若有浑浊现象,可通过离心(1 0000g, 10min)来消除。
2.样品的测定:取0.2ml提取液,放入盛有0.4ml 10% HCl的10ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为空白,在243nm处测定其消光值。
3.待测碱处理液的制备:分别吸取0.2ml提取液,2ml蒸馏水和0.8ml 1M NaOH溶液依次放入10ml容量瓶中,混匀,15min后加入0.8ml 10% HCl,混匀,并定容至刻度。以蒸馏水为空白。在243nm处测定其OD值。
4.由待测样品与待测碱处理样品的消光值之差和标准曲线,即可计算出样品中Vc的含量。
5.也可直接以待测碱处理液为空白,测出待测液的消光值,通过查标准曲线,计算出样品的Vc的含量。
四、计算
Vc的含量(μg /g)=(μ×V总)/( V1×W总)
式中: μ——从标准曲线上查得的抗坏血酸的含量(μg)
V1——测消光值时吸取样品溶液的体积(ml)
V总——样品定容体积(ml)
W总——称样重量(g)