连接酶链反应

·16O - 结台位点分布的细节，对基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的影响及 信号传导机制等 另一方面是通过进一步的 动物实验、及其普通药理学，药物动力学，稳 定性和毒性的研究确定其在临床应用上的价 值 。 参 考 文 献 l Thoenen H et a】．Exp Neurol，1993；l24：47 2 LindsayRM et a】．Exp NeuroI．1 993；124：103 3 Gel3Tlal~DC et at Ann N Y Acad Sci，1992 F 648 42 4 13eck KD et a】．Neurosvienee，l993i 52： 855 5 Hyman C el：aI．N8ture，1 991 F 350：230 6 Spina M et a1．J Neurochem ．1 9g2I 59 r 99 7 NikkhahG et aI．Exp13rainRe，，1993；92：516 8 Ferrari G et a】．J Netlroscj Res，l99l；30：493 9 M agal E et a】．J NeuroscI，1993 F 52：867 l0 OttO D eI a1．J Neurosci，1990 F 10：1912 11 J0nes墨R et al Cell，1~94}16j 9889 12 Casper DC et a】．j Ne~rosciRes，l99l F 30：372 国外医学1；}于生物学舒册1996年第18鲞箜 塑 13 DW 13urt Biochem B ophy Res Comm L~Tt， I 992I l84： 59{I 14 I L F et a1． Science，l 993{ 260： l130 15 Burt DW et a：． Biochem Biophys Res Com— ITIunt l 992； 184j 590 16 Yan n et aI．NatuTe 1 995{ 373：341 17 Oppe~heim RW et a1 Natuze，1995；373：344 l 8 Henderson CE et a】．Science 1 994{2 6：】062 1 0 Strom bcrg I et a1．Exp NeuroIt 1993 F 124}40l 00 Scha3．1-DG et 8】 Exp NeuroI，1993；124：368 2l Sendner M et 8】 Naturet l990I 345： 440 22 Yan n et aI_J Neurobio1．1 993{ 24： 1555 23 KoIiatsos VE et a1．Pr0c Natl Acad Sci USA， 1994} 91： 3304 2 L1．L．e*-a1．3 Neuto o!，1894}35：750—766 25 Yan n et a1．J N@UYOSCl，l994 F 14：5281 26 1、OITIt~c A et a1． Nam re．1995I 373： 335 27 Beck KD et a】 Nature，1995{ 373： 339 28 Petty BG et al Ann NeKl~OI、1994j 36：24 (1 995-07—20 收 稿 ) 连 接 酶 链 反 应 ‘ 汪晓辉综述 杨瑞馥审较 杖 &7 F 军事医学科学院微生物流行病学研究所‘北京，1㈣7l 。 摘要 连接酶链反应 (LCR)是蛙 PCR后新发展的一种较有前景的体外核酸扩增技术 四条寡 用前景 本文综违 了渡技术的原理、方法及近年来的初步应用 美键词 ． 重量壁壁垦皇{欲 卡j噶教 。 话 近年来 转录 依赖 的扩增 系统 (tran— script—ba~ed amplification system，TAS) 、 自主序列复制(self—sustained sequence repli。 cation， 3SR)“ 、 Q口 复 制 酶 (Q beta replicase) 、链替代扩增反应 (strand dis— placement amplication，SDA)n 以及连接酶 链反应 (1igase chain reaction，LCR)~ 、循玮 探针反应(cycling probe reaction，CPR) 等 体外核酸扩增技术作为 PCR技术的补充或 改进而得以建立和发展。与其它核酸扩增技 术相 比LCR的最大优势在于可准确区分基 因序列中单个基因突变，在遗传性疾病、肿 瘤诊断和细菌、病毒的基因分型、致病 力鉴 定等领域有着广泛的应用前景。1988年 Lan— degreen” 第一次用 LCR诊断人镰型细胞贫 血病；Wu和 Wallace描述 了相 的检测披 术，称之为连接酶扩增反应 (1i~ase ampltfica— tion reaction，LAR)。最初的LcR是由不耐 热的 T．DNA连接酶介导两对互补引物通过 反复循环的变性 (i00℃)和连接 (30℃)步 骤完成整个扩增反应 ，明显的非特异性连接 现象和每次变性后需补加连接酶使方法的运 用受到限制 。髓着耐热连接酶的问世 ．使j=王 应温度可在接近引物 Tm值下进行 ，极大地 维普资讯 http://www.cqvip.com su 高亮 su 高亮 国外医学丹子生物学丹册1996年第18卷第4塑 降低了非依赖 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 的连接现象，并使整个反 应 自动化成为可能 本 文综述 了近年来 LCR 的最新进展和应用前景 1 LCR的反应原理 LCR 反 应 是 以 DNA 连 接 酶 将 某 一 DNA链的 5l_磷酸与另一相邻链 3 羟基连 接为基础的。原理 如图 1所示 ，两对引物 A、B和 A 、BI，其中弓}物 A与引物 A 互补， 引物 B和引物 B。互补。双链 DNA经加热变 性后．两对引物分别与模板复性 复性后引 物 A和 B|的 3端分别与引物 B和 A一的 5端 紧邻 ，若完全互补，则在连接酶作用下，可 使相邻两引物的 5磷酸与 3羟基形成磷酸二 酯键而连接 前一次连接产物在变性后又可 作为引物的模板参加反应 +使扩增呈指数增 长。经 20～30次循环，可将连接产物扩增 1 0 倍以上。若引物 A和 A’的 3端和 5端配对 的碱基发生了突变．则没有连接和扩增发生 这种单碱基的突变可定义为与某表型相关的 两个：：同等位基因、种或其它基因多形态。在 LCR 泵理的基础上进一步发展 其它连接 酶链反应．如：连接检测反应 (1igase detec— tion reation LDR)，LDR与 LcR原理相似， 它是通过一对紧邻引物与双链靶 DNA中的 一 条单链杂交获得线性扩增结果 I DR通常 与一种一级扩增 (PCR、3SR、Q8复制、RT PCR)联合应用。结合 PCR的复合 LDR可 通过一次扩增检测产物中的多个单突变位 点，已应用于胆囊纤维化疾病和 21三体综合 征诊断中 。G—LCR(gapped LCR)和 P—LCR (polygapped—LCR)是 另一种连 接扩增 反 应 。，相邻引物之间存在一个或多个碱基缺 口，需先向反应体系提供填补缺口所需的碱 基如：GC或 AT，然后由 Taq DNA聚合酶 介导上述碱基特异填补此空缺，随后由连接 酶封口。比较 LCR与 P—LCR、G LCR可 看出，P—LCR和 G—LCR在三个水平提高反 应的特异性。(1)反应俸系中必须存在特异 · 161 · 摸板与引物正确配对；(2)相邻引物间的缺 口只有在提供合适的碱基才能 由DNA聚合 酶赍导填补；(3)DNA连接酶只有在紧邻的 LCR引物的 3；端和 5、端与模板完全互补基 础上才能发生连接反应。从 LCR反应原理可 以看出+LCR是建立在对待检靶基因和欲区 分基因序列非常清楚的基础上。 ==卫皿 皿匕== 谭 l i 佃 吏 —— =^皿皿Ⅲ皿正—一 0 B A 一 5 A’ 一 皿 皿 IL ～ ㈠ ￡ — — 皿 皿 I口=一 堆 稚 c l 十 韧 5 t l ——]Ⅲ皿皿Ⅲ ～ B 5 A I ． B’ A’ ‘ 卫皿ⅡⅡ皿 。 B A 一 -KKKm IIITKW ：， 5‘A’ ：Ⅱ皿Ⅱ_皿I[[ ～ ． ’ 臻 D ’ 往忙 圉 1 LCR的反应原理示意 图 2 LCR产物的检测 最初 LCR产物 的检 测是 通过 P标记上 游引物的 3 末端 ，用变性凝胶电泳分离 LCR 产物，最后用放射自显影方法加以鉴定．可 检出 200个靶分子存在 ，或在两相邻引物的 接口处 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 一个横跨两引物的检测探针，它 只与发生了连接反应的产物杂交从而达到检 测的目的。也有用荧光素代替 P进行引物的 非同位素检测，其优点①可对产物初步定量； ②是在复合LCR中，用不同的荧光染料标记 不同的引物可同时检测多个扩增产物 ；③操 作安全。不利之点是需要特殊的荧光仪。也 有尝试用地高辛标记引物 ．通过变性凝胶电 维普资讯 http://www.cqvip.com su 高亮 su 高亮 su 高亮 su 高亮 su 高亮 · 162· 泳和 Southen杂交鉴定 LCR产物的报道。在 LCR产物检测中最近发展了一种更为简便 的微孔板夹心杂交方法 ，在一条 LCR引 物的 5-末端标记生物素，在另一条引物的 3。 末端标记非同位素受体如荧光索 (FAM)或 地高辛。LCR扩增产物首先被包被在徽孔板 上的链霉亲合素捕获 ，进一步的鉴定由连接 了碱性磷酸酶 (AP)的抗地高辛抗体通过夹 心杂交完成，上述检测的敏感度只比同位素 检测法低 1o倍。另一种原理相同的检测方法 采用在 LCR引物的 5’末端添加 Poly(dA)， 3 末端用生物素标记 ，LCR产物可被带Poly (dT)的磁珠钓取，随后用连接有 AP的链霉 亲合紊检澳I产物 ，显色检测结果 。上述检测 模式在利用 LDR／PCR进行微生物分类鉴定 和建立通用检测系统上更其实用意义 如在 细菌 16S rRNA的保守区设计通用引物利用 PCR或 RT—PCR钓得其 16S rDNA，同时在 可变区带有种或屑特征性碱基上设计 LDR 引物特异检测扩增产物 尽管如此，产物 片 段过短需要用同位素标记或非同位素标记的 杂交检测方式仍限翩了 LCR在临床上的普 遍使用。 3 影响LCR反应的重要因素 在众多影响 LCR反应特异性、敏感性因 素中，引物和反应条件是整个反应的关键。 1．引物；LCR引物应设计在检测基因的 突变位点上。所用寡核苷酸引物应足够长 (20—30个核苷酸)，以确保引物与靶 DNA 特异杂交。设计的四条引物的 Tm应在一个 狭小范围内波动，理想的 Tm值为 70=k2℃。 同时非互补引物之间不能有桥联现象，在互 补引物对上添加菲互补的尾或加大相邻引物 的间距均会降低甚至阻碍连接反应的发生。 研究还表 明引物 3’末端与模板配对的碱基 性质影响连接的效率 ，3。末端为G、C的连接 效率高于A、T，原因可能与GC碱基配对是 三个氢键 ，与模板结合更紧密有关。在 LCR 国外医学分子生物学分册 1996年星 堂塑 塑 反应中由引物错配引发的连接产物一般在正 常扩增产物量的 0、2～1．3 ，最严重的错配 是 G～T和 T—T。这种非靶依赖的连接以及引 物的平端连接可通过提高反应温度和降低模 板数 (<3 amo1)加以克服，值得注意的是模 板 DNA的二级结构也影响连接的效率 2．LCR的反应条件：标准的 5O l LCR 反应体系中含有四条引物 (每条引物浓度在 25～200 fmo1)、模板 DNA (5 fmo1)和 15 U 耐热 DNA 连接酶和 反应缓冲液 (50 mlTl Tris—HCI pH7． 6100 mmol／L KCI， 10 mmol／L MgCI ， 1 mmoI／L EDTA． 10 mmol／L NAD一，10 mmol／L DTT 和 22 g 鲑 鱼 精 DNA)在 反 应 体 系 中 也可 加 入 0．01 ～O．1 的 Trition X一1O0以提高连接 效率，一般 每个循 环的连 接效 率为 4O～ 5O％，有报道用 (NH) I．和 MnCI 替代缓 冲液中的 KCI和 MgCIz，连接效率更高。同 时试剂浓度 (引物和酶)、模板量和反应条件 也影响连接效率。LCR产物量= (1+E) ，E 是扩增效率 ，N为循环数。N与起始模板数 量有关，模板 DNA越多，信号越早能被检测 到，所需的循环数越少 此时过长的反应会 使扩增的非特异性增加 标准的 LCR反应首 先在 94‘C变性樽板 DNA15秒 一1分钟．随 后在 60～65℃(理想温度是比Tm低 5℃)使 引物复性并连接 与 PCR相比．LCR不需延 伸步骤。反应循环数一般为 10~30个循环 对 G—PCR，变性温度为 85℃，退火温度为 50 ～ 53℃．循环数为 30~60次。最常使用的耐 热连接酶是 NAD依赖耐热 DNA连接酶 ，最 近另一种需要 ATP作为挤同因子的耐热连 接酶已被克隆、测序 。 4 LCR的应用 LCR的快速 特异、敏感的特性尤其是 区分单个碱基突变的能力使其广泛应用于遗 传疾病和肿瘤的诊断及细茁 病毒的检测中 ①遗传性疾病和肿瘤诊断：最早报道用 LCR 维普资讯 http://www.cqvip.com su 高亮 su 高亮 su 高亮 国井医学分子生物学分册 1996年竖 堂塑 塑 区分』、pA珠蛋白和 镰刀型珠蛋白的不同 基固 型。近来 LCR大摄应 用于基因突变 引起 的凡、动物遗传失调疾病的检测如胆囊纤维 化和 Leber遗传性神经病、运动过度性间歇 麻痹症、人或牛白细胞粘附缺陷症等 “。 而 LCR结合PCR可同时检测靶基因序列的 多个点突变．已运用于困多点突变造成的IJ丌 囊纤维化疾病和多拷贝的三重复碱基引起的 肌营养不良症。②细菌感染诊断 ：利用 LCR 可检测点突变的特性．从基因高度同源的种、 属细菌群中区分致病细菌的存在，对临床治 疗有 重要意义 。在细菌 LCR检测中首先应对 欲检测细菌的靶基因序列有清楚的了解，现 多选 择在细 菌 的 16S rDNA 的 保守 区设 计 PCR通用引物，在可变区设计细菌种特异的 LCR引物建立通用诊断系统以快速、准确地 检测亲源关 系极为相近的细菌 Wiedmann 1992年 报道引物设计在李斯特菌的 16S rDNA的V 、V 基因可变区的 LCR可准确 从正常的李斯特菌中检测出 10CFU 的革核 细胞．々生 李斯特菌，原理相似的检测系统也 应用 植物致病菌斯图尔特欧文氏菌的检测 中 ，设计一对在 1 6S rDNA上与其它欧文 氏菌只有一个碱基差别的斯图尔特欧文氏菌 种特异的 LCR引物可区分甚至遗传距离极 近的 Herbnicota欧文氏菌。当然并不是将检 测的所有靶基因设计在细菌的 16S rDNA 上，Lovanisci报道了用LCR在 1S6l1O基因 区设计引物检测致病结核杆菌。脑膜炎双球 菌与淋病奈瑟氏菌基因高度同源，它们在多 拷贝Op．和 Pilin基因上只有两个碱基的差 别。Birkenmeyer针对上述基因设计三套寡 核苷酸探针．采用 G—LCR方法从含脑膜炎 双球菌的临床标本中检出淋病奈瑟氏茁．阳 性反应信号是本底的 5～2O倍 上述方法检 测结果与常规的培养砌合率为 100 ，说明 LCR方法在既使有--N两个碱基差别的微 生物检测中也具有极高的特异性。Bassir：” 用引物设计在编码外膜蛋 白基因的 LCR检 · 1 63· 测妇女碌标本中的沙 眼衣原体并以常规的培 养和酶免疫法作对照，结果三种方法的相对 敏感性分别为 87．7 、56．3 和 18·8 ，作 者认为 LCR无论从敏感性、特异性 及快速 特性上均优于常规法适于沙眼衣原体感染的 临床诊断和流行病学调查 @病毒诊断 ：运 用甚!≯．有报道用非同位素 LCR方法扩增 HIV病毒的 gag区．可检出 i～10个H1V病 毒存在 ． 及用 LCR检测 HVI的耐 AZT基 因突变。 。已见报道的还有单纯疱疹病毒、 』、乳 瘤病毒和丙型肝炎病毒和牛痘病毒的 LCR检测 。①其它：除上述应用外， LCR还可用于肿瘤诊断中，如测定 Ha·ras 原瘟基因的点突变。Prchal 将逆转录 PCR 与 LDR结合，逆转录扩增人有活性的 x染 色体 ，井用 LDR分析染色体的多态性 。也有 报道从淋巴细胞、骨髓细胞、成纤维细胞中 分离靶等位基因的 mRNA，经 RT·PCR扩增 后，用LDR确定基因型，这对于肿瘤失控和 胚胎发育研究有重大意义 近年来随着分子生物的迅猛发展，对生 物基因序列的了解不断深入，尤其是全面开 展的人类基因图谱研究使我们更有可能广泛 地运用 LCR及其相关技术诊断因单基因或 几个基因突变造成的人类遗传疾病 ，基于微 生物的 l6S rRNA序列进行遗传分类促使近 2000种微生物的 1 6S rRNA全序列的测定 为LCR的应用提供了清楚的遗传背景。耐热 连接酶的问世以及产物检测采用酶或荧光索 等非同位素标记可使整个反应从扩增到检测 实现 自动化。 参 考 文 献 l Kwoh DY et al- Pr0c Natl Acad Sci USA ． 1989} 86 ll73 2 Bush CE et a】．J c1in M icrobio1，l9s2；30：28l 3 Kran3~r FR et a】． Nature．1989； 339： 40l 4 W aIker GT et a1．Nucleic Acids Res．1 g94}22 (13)一 2670 5 M art[on W iedmann et a1．PCR M ethods A口D]l， l994； 3 55l B Duck D et a1．Biotechniques，1990}9(2)：l42 维普资讯 http://www.cqvip.com · 1 64 · 7 Landegren et a1．Science．1988~26：1077 8 Larry G et al j Virol M elhods}1991’35：117 9 W inn-Deen ES et a1．Am J Hum Genet，1993 F 53： 15L2 lO Abrayaya K et a1． Nucleic Acids Res，1 995； 23： 675 U Bart CA et a1．Anlm Genet}1994 F 25‘95 12 FangP et a1．Am JHum Genet，1992 F A214 13 Wangj et 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，并且国外已有商品出售。目前，国外 利用生物工程技术，已经获得降钙素的多种 表达方式0 ，而国内尚未见到有关基因表达 方面的报道。 1 降钙素的基因结构 关于人降钙素 (cT)的基因结构基本上 已弄清楚，它和编码降钙素基因相关肽 (caf citonin gene related peptide，CGRP)的基 因 位于同一个转录单位上，即CT／CGRP基因 (图 1)。该基因长约 6．5kb，位于第 11号染 色体短臂上。具有以下特点： 1．CT／CGRP基 因由 6个外 显子组成 。 CT mRNA由外显子 I、 Ⅱ、 Ⅱ、N编码， CGRP mRNA由外显子 1、Ⅱ、Ⅱ、V、Ⅵ 编码。外显子 1为两肽共同的非编码序列 ，外 显子 I、Ⅲ为两肽共同的编码序列，外显子 Tli为降钙素及其 C端煦的编码序列，外显子 V、V1分别为降钙素基因相关肽的编码序列 和非编码序列“ 。 2． 有 1个 “CAP” 位 点 和 1个 “TATA”盒．这是基因的转录起始信号 ，其 位点约在外显子 1上罅一35bp处 。 3．有两个 Poly(A)位点，一个位于外 显子N之后 ，以形成 cT mRNA，其多聚腺 苷酸信号为 AATAAA{另一个位于外显子 、 ／ 维普资讯 http://www.cqvip.com