·16O -
结台位点分布的细节,对基因
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
达的影响及
信号传导机制等 另一方面是通过进一步的
动物实验、及其普通药理学,药物动力学,稳
定性和毒性的研究确定其在临床应用上的价
值 。
参 考 文 献
l Thoenen H et a】.Exp Neurol,1993;l24:47
2 LindsayRM et a】.Exp NeuroI.1 993;124:103
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国外医学1;}于生物学舒册1996年第18鲞箜 塑
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(1 995-07—20 收 稿 )
连 接 酶 链 反 应
‘ 汪晓辉综述 杨瑞馥审较
杖 &7 F 军事医学科学院微生物流行病学研究所‘北京,1㈣7l
。 摘要 连接酶链反应 (LCR)是蛙 PCR后新发展的一种较有前景的体外核酸扩增技术 四条寡
用前景 本文综违 了渡技术的原理、方法及近年来的初步应用
美键词
.
重量壁壁垦皇{欲 卡j噶教 。 话
近年来 转录 依赖 的扩增 系统 (tran—
script—ba~ed amplification system,TAS) 、
自主序列复制(self—sustained sequence repli。
cation, 3SR)“ 、 Q口 复 制 酶 (Q beta
replicase) 、链替代扩增反应 (strand dis—
placement amplication,SDA)n 以及连接酶
链反应 (1igase chain reaction,LCR)~ 、循玮
探针反应(cycling probe reaction,CPR) 等
体外核酸扩增技术作为 PCR技术的补充或
改进而得以建立和发展。与其它核酸扩增技
术相 比LCR的最大优势在于可准确区分基
因序列中单个基因突变,在遗传性疾病、肿
瘤诊断和细菌、病毒的基因分型、致病 力鉴
定等领域有着广泛的应用前景。1988年 Lan—
degreen” 第一次用 LCR诊断人镰型细胞贫
血病;Wu和 Wallace描述 了相 的检测披
术,称之为连接酶扩增反应 (1i~ase ampltfica—
tion reaction,LAR)。最初的LcR是由不耐
热的 T.DNA连接酶介导两对互补引物通过
反复循环的变性 (i00℃)和连接 (30℃)步
骤完成整个扩增反应 ,明显的非特异性连接
现象和每次变性后需补加连接酶使方法的运
用受到限制 。髓着耐热连接酶的问世 .使j=王
应温度可在接近引物 Tm值下进行 ,极大地
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国外医学丹子生物学丹册1996年第18卷第4塑
降低了非依赖模板的连接现象,并使整个反
应 自动化成为可能 本 文综述 了近年来 LCR
的最新进展和应用前景
1 LCR的反应原理
LCR 反 应 是 以 DNA 连 接 酶 将 某 一
DNA链的 5l_磷酸与另一相邻链 3 羟基连
接为基础的。原理 如图 1所示 ,两对引物
A、B和 A 、BI,其中弓}物 A与引物 A 互补,
引物 B和引物 B。互补。双链 DNA经加热变
性后.两对引物分别与模板复性 复性后引
物 A和 B|的 3端分别与引物 B和 A一的 5端
紧邻 ,若完全互补,则在连接酶作用下,可
使相邻两引物的 5磷酸与 3羟基形成磷酸二
酯键而连接 前一次连接产物在变性后又可
作为引物的模板参加反应 +使扩增呈指数增
长。经 20~30次循环,可将连接产物扩增 1 0
倍以上。若引物 A和 A’的 3端和 5端配对
的碱基发生了突变.则没有连接和扩增发生
这种单碱基的突变可定义为与某表型相关的
两个::同等位基因、种或其它基因多形态。在
LCR 泵理的基础上进一步发展 其它连接
酶链反应.如:连接检测反应 (1igase detec—
tion reation LDR),LDR与 LcR原理相似,
它是通过一对紧邻引物与双链靶 DNA中的
一 条单链杂交获得线性扩增结果 I DR通常
与一种一级扩增 (PCR、3SR、Q8复制、RT
PCR)联合应用。结合 PCR的复合 LDR可
通过一次扩增检测产物中的多个单突变位
点,已应用于胆囊纤维化疾病和 21三体综合
征诊断中 。G—LCR(gapped LCR)和 P—LCR
(polygapped—LCR)是 另一种连 接扩增 反
应 。,相邻引物之间存在一个或多个碱基缺
口,需先向反应体系提供填补缺口所需的碱
基如:GC或 AT,然后由 Taq DNA聚合酶
介导上述碱基特异填补此空缺,随后由连接
酶封口。比较 LCR与 P—LCR、G LCR可
看出,P—LCR和 G—LCR在三个水平提高反
应的特异性。(1)反应俸系中必须存在特异
· 161 ·
摸板与引物正确配对;(2)相邻引物间的缺
口只有在提供合适的碱基才能 由DNA聚合
酶赍导填补;(3)DNA连接酶只有在紧邻的
LCR引物的 3;端和 5、端与模板完全互补基
础上才能发生连接反应。从 LCR反应原理可
以看出+LCR是建立在对待检靶基因和欲区
分基因序列非常清楚的基础上。
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圉 1 LCR的反应原理示意 图
2 LCR产物的检测
最初 LCR产物 的检 测是 通过 P标记上
游引物的 3 末端 ,用变性凝胶电泳分离 LCR
产物,最后用放射自显影方法加以鉴定.可
检出 200个靶分子存在 ,或在两相邻引物的
接口处设计一个横跨两引物的检测探针,它
只与发生了连接反应的产物杂交从而达到检
测的目的。也有用荧光素代替 P进行引物的
非同位素检测,其优点①可对产物初步定量;
②是在复合LCR中,用不同的荧光染料标记
不同的引物可同时检测多个扩增产物 ;③操
作安全。不利之点是需要特殊的荧光仪。也
有尝试用地高辛标记引物 .通过变性凝胶电
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· 162·
泳和 Southen杂交鉴定 LCR产物的报道。在
LCR产物检测中最近发展了一种更为简便
的微孔板夹心杂交方法 ,在一条 LCR引
物的 5-末端标记生物素,在另一条引物的 3。
末端标记非同位素受体如荧光索 (FAM)或
地高辛。LCR扩增产物首先被包被在徽孔板
上的链霉亲合素捕获 ,进一步的鉴定由连接
了碱性磷酸酶 (AP)的抗地高辛抗体通过夹
心杂交完成,上述检测的敏感度只比同位素
检测法低 1o倍。另一种原理相同的检测方法
采用在 LCR引物的 5’末端添加 Poly(dA),
3 末端用生物素标记 ,LCR产物可被带Poly
(dT)的磁珠钓取,随后用连接有 AP的链霉
亲合紊检澳I产物 ,显色检测结果 。上述检测
模式在利用 LDR/PCR进行微生物分类鉴定
和建立通用检测系统上更其实用意义 如在
细菌 16S rRNA的保守区设计通用引物利用
PCR或 RT—PCR钓得其 16S rDNA,同时在
可变区带有种或屑特征性碱基上设计 LDR
引物特异检测扩增产物 尽管如此,产物 片
段过短需要用同位素标记或非同位素标记的
杂交检测方式仍限翩了 LCR在临床上的普
遍使用。
3 影响LCR反应的重要因素
在众多影响 LCR反应特异性、敏感性因
素中,引物和反应条件是整个反应的关键。
1.引物;LCR引物应设计在检测基因的
突变位点上。所用寡核苷酸引物应足够长
(20—30个核苷酸),以确保引物与靶 DNA
特异杂交。设计的四条引物的 Tm应在一个
狭小范围内波动,理想的 Tm值为 70=k2℃。
同时非互补引物之间不能有桥联现象,在互
补引物对上添加菲互补的尾或加大相邻引物
的间距均会降低甚至阻碍连接反应的发生。
研究还表 明引物 3’末端与模板配对的碱基
性质影响连接的效率 ,3。末端为G、C的连接
效率高于A、T,原因可能与GC碱基配对是
三个氢键 ,与模板结合更紧密有关。在 LCR
国外医学分子生物学分册 1996年星 堂塑 塑
反应中由引物错配引发的连接产物一般在正
常扩增产物量的 0、2~1.3 ,最严重的错配
是 G~T和 T—T。这种非靶依赖的连接以及引
物的平端连接可通过提高反应温度和降低模
板数 (<3 amo1)加以克服,值得注意的是模
板 DNA的二级结构也影响连接的效率
2.LCR的反应条件:标准的 5O l LCR
反应体系中含有四条引物 (每条引物浓度在
25~200 fmo1)、模板 DNA (5 fmo1)和 15 U
耐热 DNA 连接酶和 反应缓冲液 (50 mlTl
Tris—HCI pH7. 6100 mmol/L KCI, 10
mmol/L MgCI , 1 mmoI/L EDTA. 10
mmol/L NAD一,10 mmol/L DTT 和 22 g
鲑 鱼 精 DNA)在 反 应 体 系 中 也可 加 入
0.01 ~O.1 的 Trition X一1O0以提高连接
效率,一般 每个循 环的连 接效 率为 4O~
5O%,有报道用 (NH) I.和 MnCI 替代缓
冲液中的 KCI和 MgCIz,连接效率更高。同
时试剂浓度 (引物和酶)、模板量和反应条件
也影响连接效率。LCR产物量= (1+E) ,E
是扩增效率 ,N为循环数。N与起始模板数
量有关,模板 DNA越多,信号越早能被检测
到,所需的循环数越少 此时过长的反应会
使扩增的非特异性增加 标准的 LCR反应首
先在 94‘C变性樽板 DNA15秒 一1分钟.随
后在 60~65℃(理想温度是比Tm低 5℃)使
引物复性并连接 与 PCR相比.LCR不需延
伸步骤。反应循环数一般为 10~30个循环
对 G—PCR,变性温度为 85℃,退火温度为 50
~ 53℃.循环数为 30~60次。最常使用的耐
热连接酶是 NAD依赖耐热 DNA连接酶 ,最
近另一种需要 ATP作为挤同因子的耐热连
接酶已被克隆、测序 。
4 LCR的应用
LCR的快速 特异、敏感的特性尤其是
区分单个碱基突变的能力使其广泛应用于遗
传疾病和肿瘤的诊断及细茁 病毒的检测中
①遗传性疾病和肿瘤诊断:最早报道用 LCR
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国井医学分子生物学分册 1996年竖 堂塑 塑
区分』、pA珠蛋白和 镰刀型珠蛋白的不同
基固 型。近来 LCR大摄应 用于基因突变 引起
的凡、动物遗传失调疾病的检测如胆囊纤维
化和 Leber遗传性神经病、运动过度性间歇
麻痹症、人或牛白细胞粘附缺陷症等 “。
而 LCR结合PCR可同时检测靶基因序列的
多个点突变.已运用于困多点突变造成的IJ丌
囊纤维化疾病和多拷贝的三重复碱基引起的
肌营养不良症。②细菌感染诊断 :利用 LCR
可检测点突变的特性.从基因高度同源的种、
属细菌群中区分致病细菌的存在,对临床治
疗有 重要意义 。在细菌 LCR检测中首先应对
欲检测细菌的靶基因序列有清楚的了解,现
多选 择在细 菌 的 16S rDNA 的 保守 区设 计
PCR通用引物,在可变区设计细菌种特异的
LCR引物建立通用诊断系统以快速、准确地
检测亲源关 系极为相近的细菌 Wiedmann
1992年 报道引物设计在李斯特菌的 16S
rDNA的V 、V 基因可变区的 LCR可准确
从正常的李斯特菌中检测出 10CFU 的革核
细胞.々生 李斯特菌,原理相似的检测系统也
应用 植物致病菌斯图尔特欧文氏菌的检测
中 ,设计一对在 1 6S rDNA上与其它欧文
氏菌只有一个碱基差别的斯图尔特欧文氏菌
种特异的 LCR引物可区分甚至遗传距离极
近的 Herbnicota欧文氏菌。当然并不是将检
测的所有靶基因设计在细菌的 16S rDNA
上,Lovanisci报道了用LCR在 1S6l1O基因
区设计引物检测致病结核杆菌。脑膜炎双球
菌与淋病奈瑟氏菌基因高度同源,它们在多
拷贝Op.和 Pilin基因上只有两个碱基的差
别。Birkenmeyer针对上述基因设计三套寡
核苷酸探针.采用 G—LCR方法从含脑膜炎
双球菌的临床标本中检出淋病奈瑟氏茁.阳
性反应信号是本底的 5~2O倍 上述方法检
测结果与常规的培养砌合率为 100 ,说明
LCR方法在既使有--N两个碱基差别的微
生物检测中也具有极高的特异性。Bassir:”
用引物设计在编码外膜蛋 白基因的 LCR检
· 1 63·
测妇女碌标本中的沙 眼衣原体并以常规的培
养和酶免疫法作对照,结果三种方法的相对
敏感性分别为 87.7 、56.3 和 18·8 ,作
者认为 LCR无论从敏感性、特异性 及快速
特性上均优于常规法适于沙眼衣原体感染的
临床诊断和流行病学调查 @病毒诊断 :运
用甚!≯.有报道用非同位素 LCR方法扩增
HIV病毒的 gag区.可检出 i~10个H1V病
毒存在 . 及用 LCR检测 HVI的耐 AZT基
因突变。 。已见报道的还有单纯疱疹病毒、
』、乳 瘤病毒和丙型肝炎病毒和牛痘病毒的
LCR检测 。①其它:除上述应用外,
LCR还可用于肿瘤诊断中,如测定 Ha·ras
原瘟基因的点突变。Prchal 将逆转录 PCR
与 LDR结合,逆转录扩增人有活性的 x染
色体 ,井用 LDR分析染色体的多态性 。也有
报道从淋巴细胞、骨髓细胞、成纤维细胞中
分离靶等位基因的 mRNA,经 RT·PCR扩增
后,用LDR确定基因型,这对于肿瘤失控和
胚胎发育研究有重大意义
近年来随着分子生物的迅猛发展,对生
物基因序列的了解不断深入,尤其是全面开
展的人类基因图谱研究使我们更有可能广泛
地运用 LCR及其相关技术诊断因单基因或
几个基因突变造成的人类遗传疾病 ,基于微
生物的 l6S rRNA序列进行遗传分类促使近
2000种微生物的 1 6S rRNA全序列的测定
为LCR的应用提供了清楚的遗传背景。耐热
连接酶的问世以及产物检测采用酶或荧光索
等非同位素标记可使整个反应从扩增到检测
实现 自动化。
参 考 文 献
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0 -I‘
降钙素的基因结构与表达调控
殴 7
、
杜清友 王会信
军事医学科学院基础医学研究所 (北京,100850)
摘要 降钙幕与降钙幕基 因相关敢 (CT/CGRP)基因编码一组多耽.即降钙素 (cT)、降钙索
的 N端赋和 C端肽、降钙素基因相关肚 (CGRP)及症粉不溶幕 (Amylin) CT/CGRP基因转录而
成的 mRNA前体 .在不同组织 中通过选择性加工形成 CTmRNA或 CGRPmRNA,再通过翻译及蛋
白质加工 ,最后形成成熟的降钙謇或降钙素基 固相关 肚。本文 简单舟绍一下降钙素的基因结构及表
述调控方面的研究进展 。
关键词 降钙素 基因结构 表达调控
降钙素 (calcitonin,CT)是Copp在 1961
年发现井命名的。随后研究发现,降钙素广
泛存在于哺乳类动物的甲状腺、甲状旁腺、胸
腺以及肾上腺组织中和鱼类的终腮体组织
中。在各种降钙素中,鱼类的活性最高 ,且
半衰期较长。鲑鱼降钙素的活性是人的几十
倍,半衰期比人的长 346倍“·。降钙素的主
要生理作甩是调节体内钙、磷的代谢。它不
仅是治疗 Paget氏病的首选药物 ,而且还能
治疗各种原因引起的高血钙症。尤其是近几
年发现,在治疗老年性骨质疏松症方面的显
著疗效 ,给降钙素临床应用带来更 阔前
景 】。人、鸡、鲑鱼降钙素已经在临床上使用
多年 ,并且国外已有商品出售。目前,国外
利用生物
工程
路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理
技术,已经获得降钙素的多种
表达方式0 ,而国内尚未见到有关基因表达
方面的报道。
1 降钙素的基因结构
关于人降钙素 (cT)的基因结构基本上
已弄清楚,它和编码降钙素基因相关肽 (caf
citonin gene related peptide,CGRP)的基 因
位于同一个转录单位上,即CT/CGRP基因
(图 1)。该基因长约 6.5kb,位于第 11号染
色体短臂上。具有以下特点:
1.CT/CGRP基 因由 6个外 显子组成 。
CT mRNA由外显子 I、 Ⅱ、 Ⅱ、N编码,
CGRP mRNA由外显子 1、Ⅱ、Ⅱ、V、Ⅵ
编码。外显子 1为两肽共同的非编码序列 ,外
显子 I、Ⅲ为两肽共同的编码序列,外显子
Tli为降钙素及其 C端煦的编码序列,外显子
V、V1分别为降钙素基因相关肽的编码序列
和非编码序列“ 。
2. 有 1个 “CAP” 位 点 和 1个
“TATA”盒.这是基因的转录起始信号 ,其
位点约在外显子 1上罅一35bp处 。
3.有两个 Poly(A)位点,一个位于外
显子N之后 ,以形成 cT mRNA,其多聚腺
苷酸信号为 AATAAA{另一个位于外显子
、 /
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