基因克隆技术
周国岭 杨光圣 傅廷栋
（华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 !"##$#）
摘要 综述了基因克隆常用技术包括图位克隆法、转座子或 %! &’(标签法、同源序列法、
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
达序列标签
（)*%）法和差异表达基因分离方法的原理、应用、应用的潜力和限制因素。
关键词 基因克隆；图位克隆；转座子标签；%! &’(标签；同源序列；)*%；差异表达基因
中图法分类号 + $,-
人类基因组
计划
项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载
（./0）的迅速进展及几种模式
生物基因组测序的相继完成为人类提供了大量的基
因组信息，这已成为人类探索生命奥秘的入手点，同
时也为后基因组时代提供了更富有挑战性的任务。
基因组学时代的主要任务是图谱制作和序列测定，
后基因组学时代则是进行基因组功能注释（123452
6334767843），这也是功能基因组学的主要研究目
标［9，:］。但如何利用这些研究成果为人类服务，基
因则是一个重要的资源。克隆化基因不仅可以用来
兴旺生命科学工业（如制药业等），改良农作物、畜禽
品种等，还可以对遗传性疾病进行基因治疗，探索疾
病的分子机制和生物发育调控规律。由于基因组计
划要耗费大量人力、物力、财力，所以并非每一种生
物都可以拿来测序，而且模式生物的基因有时并不
能直接用于其它生物，因而克隆其它生物中对人类
有益的基因也变得日益重要。随着基因专利权的建
立和完善，基因争夺大战的硝烟日益弥漫全球，克隆
基因似乎有着一本万利的诱惑力。在这样一个大环
境下，克隆基因的技术也随着分子生物学发展的步
伐而日臻完善和多样化。在传统遗传学（正向遗传
学）占主导地位的时代，人们以基因产物为导向来分
离克隆基因（功能克隆）。由于基因产物的结构、功
能已知，可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列，反
推其核苷酸序列，设计探针或引物从基因组 &’(文
库或 ;&’(文库中筛选克隆（如玉米组蛋白脱乙酰
酶 !":基因的分离［"］），也可以制备产物抗体，从表
达载体构建的 ;&’(文库中筛选相应克隆，进而分
离目的基因。功能克隆受限于蛋白质的分离纯化技
术，在大部分基因产物的结构功能未知的情况下，人
们不得不从另外的角度去寻求突破。近年来，反向
遗传学（<2=2<>2 123278;>）的建立，为分离未知产物的
基因提供了越来越多的策略和思路。
! 图位克隆技术（"#$%&#’() *+,-.-/
,0 $,’.1.,-#+ *+,-.-/）
随着各种生物分子标记连锁图的相继建立和越
来越多的基因被定位，?# 年代初，图位克隆技术也
应运而生。其基本工作思路为：首先将目的基因精
确定位在分子标记连锁图上，利用与目的基因紧密
连锁的标记筛选大片段 &’( 文库（如 @(A、B(A、
%(A、0(A或 ;4>58C 文库），并构建含目的基因区域
的精细物理图谱，利用该物理图谱采用染色体步行
（;D<454>452 E6FG831）的方法逐步逼近目的基因（如
人的 #$%9基因的克隆［!］和拟南芥的 &’(()* 基因
的克隆［-］）。若侧翼标记与目的基因连锁十分紧密
或共分离，无需步移就可直接着陆，获得含目的基因
的大片段克隆，再将大片段克隆作亚克隆分析或用
大片段克隆作探针筛选 ;&’(文库，从而将目的基
因确定于 9个较小的 &’(片段上，进一步作序列分
析和目的基因功能鉴定。基因组 &’( B(A或 0(A
克隆末端序列的分离是图位克隆中很重要的一步，
@631等利用 B(A或 0(A载体的特有酶切位点 #+,
!或 -./!和 B(A 片段内的多酶切位点（01+H"、
!23 !、 -,4 !、 567 ! ） 进 行
双酶切，然后与质粒载体连接，进行锚定0AH来分
收稿日期：:##9! #-! #!
周国岭，女，9?$,年生，华中农业大学农学系在读硕士生 I武汉 !"##$#
第 :#卷 第 J期
:##9年 9:月
华 中 农 业 大 学 学 报
K4L<36F 4M .L6ND431 (1<8;LF7L<6F O38=2<>87P
Q4F I:# ’4IJ
&2;I :##9，
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
-,! R -?:
离 !"#的长末端序列［$］，发展了一种高效快速的方
法。图位克隆法首先被应用于模式植物拟南芥
（!"#$%&’()%) *+#,%#-#），%&&’年 ()*+,-+.等成功分离了
与拟南芥种子形成和发芽相关的脱落酸信号传导基
因 !.//［0］，"*12-34等则分离到拟南芥的!5 /脂肪
酸脱饱和酶基因 0!1/［6］。由于抗性性状的遗传行
为简单，表型易鉴定，而人的遗传性疾病也有这个特
点且人类高密度的分子标记连锁图已建立，所以图
位克隆技术在分离植物抗性基因和与人的遗传性疾
病相关的基因上取得了很大的成功。如番茄抗霜霉
病基因 2*’［&］、水稻抗白叶枯病基因 3#’%［%7］、小麦
抗线虫基因 4"5/［%%］及 ’77 多个与人遗传性疾病相
关基因的克隆等。
利用图位克隆法克隆基因不仅需要构建完整的
基因组文库，建立饱和的分子标记连锁图和完善的
遗传转化体系，而且还要进行大量的测序工作，所以
对基因组大、标记数目不多、重复序列较多的生物采
用此法不仅投资大，而且效率低。因而图位克隆法
仅局限应用在人类、拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和
生物上。随着比较基因组学的发展，人们意识到要
充分利用图谱饱和生物的遗传信息服务于其它生
物。我们可以利用同科异种间染色体共线性或同线
性，通过比较基因组分析和染色体着陆，将控制该物
种有关性状的基因或分子标记直接定位在它的分子
标记连锁图中。如利用小麦与水稻基因组间的同线
性，8+*9+等将小麦控制开花时间的基因（6"-）和控
制谷粒硬度的基因（7#）定位在第 :组染色体上［%’］。
通过大鼠与人的比较基因组分析，8;<+*= 等定位了
8>"的一个候选修饰基因 7?0:［%/］。这些进展不
仅为更快捷地克隆基因创造了条件，而且拓宽了图
位克隆法的应用范围。已有人开始利用水稻的图谱
信息筛选水稻小麦同线区的 !"#或 @"#，用于测序
以搜索候选基因［%’］。而且随着越来越多的 ABC被
定位在分子标记连锁图上，也使人们有可能通过图
位克隆法来分离贡献率大的 ABC来改良生物性状。
图 ! 图位克隆法示意图
"#$% ! &’()*’+,- ./01#1$
2 转座子或 3! 456标签法（78’1+)
(0+01 08 3! 456 7’$$#1$ 9,7:0-）
同源或异源的转座子或 B! DE"可以插入到
基因组中导致基因结构的变化，从而产生突变基因
型。从 %&60年 F34-9+2等将 B! DE"作为一种基
因标签来筛选突变体以来［%?］，迄今为止在植物上已
获得了拟南芥、番茄、玉米、水稻、金鱼草等的转座子
插入诱变和拟南芥等 B 5 DE" 插入诱变的突变群
体，从而为克隆基因创造了条件。此法的基本程序
为：首先进行突变体的诱变和鉴定工作，然后以转座
子或 B! DE"作为标签 DE"制成探针或引物，筛
选突变体基因组文库，用反义 G#H（IG#H）技术分离
出标签 DE"两侧目的基因部分序列，再依据序列设
计探针或引物筛选野生型基因组文库，即可分离出
完整的基因，最后用基因互补测验
检测
工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训
其功能。在
植物中利用的转座子系统有："; J DK、L2 J 8M9、>,.+N
.1*等，其中以 "; J DK双因子系统利用最多。O1<+4和
!*)-PK利用转座子标签法克隆到玉米抗圆斑病基因
789［%:］，这是第 %个克隆的功能产物未知的植物抗
病基因。O123K等利用 "; J DK 系统克隆了番茄抗叶
霉病的基因 4: ! &［%$］，"+*.K等利用 L2 J 8M9系统克
隆了拟南芥的 % 个雄性不育基因［%0］，#,) 等利用
>,.+.1*转座子克隆了玉米 B!胞质 %个核恢复基因
":’［%6］。%&&7年 @+21=KQR等利用 B! DE"标签法克
隆到 %个调节花器官（柱头和雄蕊）发育基因的转录
因子的基因 !;［%&］。%&&&年 G,S)1等则用 B! DE"
标签法从拟南芥中分离到 % 个与抗线虫有关的基
因［’7］。
由于有些植物存在内源转座子，像金鱼草、玉
米、拟南芥，因而利用和植物本身同源的转座子转座
就不能区分真正标签基因的转座子，所以转座子标
:6:第 $
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
期 周国岭等：基因克隆技术
签多用异源植物。另外大多数转座子转座频率不
高，拷贝数过多，导致诱变频率很低，这使大多数植
物很难获得转座子突变体，而且亲本之一必须含有
转座子或要通过转基因或杂交进行转座子引入，从
而限制了它的应用。而对于那些要在特定环境或特
定发育阶段才能有突变表型的基因，往往由于看不
到明显的突变表型而被忽略，大基因组中以基因家
族形式存在的基因，由于基因的功能补偿，若 !个或
一部分基因家族成员发生了插入突变，也可能看不
到突变表型，因而转座子或 " # $%&标签仅限于分
离克隆那些有明显插入突变表型的基因。鉴于此，
现在又发展了一种转座子捕捉（’()*+,-+-* ’(),+）［.!］
的手段来捕捉那些无表型突变的基因，包括有增强
子捕捉和基因捕捉 .种类型。
由于 $%&测序技术飞速发展，大量的基因序列
信息展现在人们面前，新的未知功能的基因不断被
发现，利用转座子或 " # $%&标签鉴定基因的生物
学功能得到越来越广泛的应用。但它的一个突出问
题
快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题
是要进行大量突变体的筛选［..，./］，以前所用的
012［.3，.4］虽然很容易鉴定突变体，但要对数以千计
的材料进行 012，工作量仍很大。!556年78*9:;(等
采用 $%&混合池和杂交策略进行突变体筛选［.<］，
大大减少了 012次数，从而使工作量减轻很多。另
外要对如此之多的突变体进行生产繁殖也是一件花
费人力物力的事。
图 ! 转座子或 "# $%&标签法示意图
’()* ! "+,-./0.0- 0+ "1$%& 2,))(-) 342506
7 同源序列法（503080)91:,.46 ;,-1
6(6,24 )4-4 342506）
随着人们对基因认识的不断深入，人们发现几
乎所有的基因与其它的基因都有一定的联系。人们
将功能相似来自相同始祖的基因归为一个家族，基
因家族的成员往往成簇存在，几个基因家族组成一
个超基因家族，超基因家族各成员之间既有高度同
源区域，也有高度趋异区域，如原癌基因（-*=->;*;）、
同源异型（?-@;-’8=）基因、肌球蛋白（@A-+8*）基因等。
人们根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有
保守氨基酸序列的特点，发展了一条快捷克隆基因
家族成员的新途径———基于同源序列的侯选基因
法。其基本思路为：首先根据基因家族各成员间保
守氨基酸序列设计简并引物，并用简并引物对含有
目的基因的 $%&文库进行 012扩增，再对 012扩
增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。如植物抗病基
因具有以下保守氨基酸序列：核苷酸结合位点（*BC
=:;-’8D; E8*D8*> +8’;，%FG），富亮氨酸重复序列
（:;B=8*; (8=? (;,;)’，H22），丝氨酸苏氨酸蛋白激酶
（+;(8*; # ’?(;-(8*; 98*)+;，G"I），亮氨酸拉链（ :;B=8*;
J8,,;(，HK），跨膜结构（’()*+@;@E()*;，"L）等。国内
不少学者根据抗性基因的保守序列设计简并引物扩
增植物 $%&文库，从获得的抗性克隆中找到了一些
新的抗性侯选基因［.M，.6，.5］。0)N;+8等根据谷氨酸脱
氢酶基因（!"#）结构中某些序列在物种中的保守性
设计简并引物进行 2" # 012，利用扩增产物制备探
针筛选龙须菜 =$%& 文库，得到 !"# 的全长 =$C
%&［/O］。对于同源性很高的基因，可以直接用作探针
进行非严谨性杂交筛选另一物种的 $%&文库。如
P)-等用豌豆淀粉合成酶基因（ $$!）的 =$%&作探
针筛选小麦的 =$%&文库，得到小麦 $$! % 的 =$C
%&［/!］。QB*9;*+’;8*等用红海鲷和红鳟鱼的生长激
素（!#）基因的 =$%& 筛选 >+E 的 =$%& 文库，得到
>+E!#的 =$%&克隆［/.］。&:@B:A等用 >+E!# 的 =$C
%&筛选 >+E的基因组文库，进一步克隆了 >+E!# 基
因［//］。
该方法自提出以来，引起了国内外学者的广泛
重视，发展很迅速，但有些问题是值得重视和思考
的："由于密码子的简并性和不同同源序列间同源
程度的差异，简并引物的特异性要设计得当。#由
于某些同源序列并不专属于某一基因家族，因而扩
增产物不一定是某一基因家族成员。$基因家族成
员往往成簇存在，克隆的基因片段是否为目的基因
尚需进一步判断。因此对 012 扩增产物和克隆产
物，有必要进行基因与性状共分离分析，插入失活或
<64 华 中 农 业 大 学 学 报 第 .O
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
卷
遗传转化等功能鉴定工作，以便最终筛选到目的基
因。
! 表达序列标签法（"#$%"&&"’ &"(
)*"+," -.//0+/ 1"-23’，456）
!""# 年以来的人类基因组计划和其它模式生
物的基因组计划在基因序列、定位、表达和功能研究
上积累了大量的数据，怎样利用它们更快捷，更经济
地克隆基因，一直吸引着人们的视线，利用计算机协
助克隆基因（$%&%’() ’&()%)*）逐渐成为克隆基因中不
可缺少的部分，如同源性比较、计算机辅助结构、功
能分析、引物设计等。+,-是完整基因上能够特异
性标记基因的一部分序列，通常包含了基因足够的
结构信息区，从而与其它基因相区分，大规模 +,-
克隆和 +,-资料库的建立［./，.0］，为利用生物信息学
克隆基因提供了条件。该方法的基本过程为：!对
已知的部分序列进行数据库分析，筛选出代表新基
因的 +,-及相应的重叠群，定位信息等，根据所得
信息设计引物，制备探针。"用探针进行 ’123文
库筛选，得 ’123阳性克隆，接着用设计引物与所得
’123阳性克隆载体臂进行巢式 456 和 0’、.’7
635+，得 0’端和 .’端部分序列（约 /## 89）。#对
所得阳性克隆和末端序列进行测序。$通过数据库
对新序列进行分析，包括与已知基因的同源性分析、
拼接延伸、:6;识别、结构分析、翻译蛋白质分析等。
%若第一步有新 +,-的定位信息，即可对基因进行
定位和结构分析；若无定位信息，还要筛选基因组文
库，进行测序和 ;<,=定位等工作。&最后对发现的
新基因进行突变检测和表达分析。
该方法是建立在大量已有的生物信息资源基础
上的，同时结合了目前的新技术，为大规模克隆基因
提供了捷径，但前提是手头要有已知的序列。目前，
国际上相当数量的基因分离是从分析同源 +,- 开
始的。如田芳等探讨了如何用 +,-法发现、克隆肿
瘤基因［.>］，:?@)(等利用此法克隆到一族新的哺乳
动物的 123 0 !胞苷甲基转移酶基因［.A］。1BC(’?
等通过 +,-数据库分析克隆到细胞分裂素的 !个跨
膜受体基因 !"#!［.D］。E@$C@FG%$等通过 +,-数据库
分析发现了 .个在前列腺中特异表达的基因，可以
用于前列腺癌的基因治疗［."］。
7 差异表达基因的分离方法（’088"%"+(
-0.99: "#$%"&&"’ /"+" ,93+0+/ 1"-23’&）
生物体的生长发育衰老过程是遗传信息有序的
时空表达的结果，因而分离差异表达基因将是认识
生命活动过程的入手点，只有以此为基础，才能深入
理解基因的结构、功能、表达与调控。而差异表达基
因的分离方法也伴随分子生物学技术的发展由单一
化发展为多元化，而且呈各种方法互相结合的趋势。
分离差异表达基因的 .种基本方法为：差式筛
选（H%IIJKJ)F%@& $’KJJ)%)*［/#］）、扣除杂交（$L8FK@’F%() MBN
8K%H%G@F%()［/!，/O，/.］）、差异展示反转录 456（H%IIJKJ)F%@&
H%$9&@B KJPJK$J FK@)$’K%9F%() 456，116- 7 456［//］）。
差式筛选法是分别从有特异表达基因的目标样（F@KN
*JF $@C9&J，-,，以下简称 -,）和无特异表达基因的参
照样（KJIJKJ)’J $@C9&J，6,，以下简称 6,）中提取 C6N
23，反转录为 ’123，并构建 -$的 ’123文库，分别
将从 -,和 6,中提取 C623制成 ’123探针，分别
用 -,和 6,的 ’123探针与 -$ ’123文库的菌落或
噬菌斑作原位杂交，选出只与 -,杂交，而不与 6,杂
交的克隆即为 -$特异表达的克隆。此法常要经过
多轮菌斑杂交，不仅费力费钱，重复性差，而且灵敏
度很低。扣除杂交则是用 -,提取的 C623反转录
成 ’123探针与 6,的过量 C623或 ’123杂交，经
两轮充分杂交后，移去杂交分子和过量的 6,的 C6N
23或 ’123，将不形成杂交体的 -,的 ’123纯化富
集，扩增，建立相应 ’123 文库即为差异表达基因
’123文库。但此法回收 ’123量有限，重复性差，
灵敏度低。116- 7 456则是分别用 -,和 6,的总
C623作模板，利用 !O个可能的锚定引物 -!!Q2锚
定 C623的 9(&B3末端，借助逆转录酶合成 ’123第
一链，得 C623 R ’123，再用相同的 .’锚定引物和 0’
端随机引物分别扩增 -,、6, 的 C623 R ’123，扩增
产物用序列胶电泳分析差异表达情况，将差异带
123回收，可进一步鉴定分析，最终获得差异表达
基因。它与前二者相比，速度快，易操作，可以鉴定
低丰度差异表达的 C623，分析 O 种以上样品基因
的差异表达等优点，但仍存在假阳性率高、重复性
差、扩增片段短等问题。116- 7 456自提出以来，
也在不断地加以改进和发展，力求不断完善［/0，/>］。
456技术的发展和新技术的出现为差异表达基
因的分离方法注入了新的活力。如在差式筛选中引
AD0第 >
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
期 周国岭等：基因克隆技术
入 !"#［$%，$&］，不仅提高了效率，还降低了假阳性率。
’(()年 *+,+-,./等将 !"# 引入扣除杂交，发展了扣
除扩增方案。同时用特异引物结合法在 !"# 中主
动选择扩增差异 0123，形成了代表性差示分析法
（45645,5/-7-+8/79 :+;;545/05 7/79.,+,，#13）［$( 5/?8等采用抑制性 !"#选择性扩增差异基
因片段，即利用 123链内退火优先于链间退火，使
非目的序列在退火时产生发夹式互补结构，无法与
引物配对，从而选择性抑制非目的基因片段的扩增，
由此提出了抑制性差减杂交 !"#法（,@6645,,+8/ ,@AB
-470-+8/ >.A4+:+C7-+8/，DDE）［FG］。另外也有人就在主动
选择差异基因片段上动脑筋，如采用粘性限制性酶
切位点［F’］，抗生蛋白链菌素包被磁珠分离和酶切保
护［FH］等方法主动选择差异片段。D-47@,等受 0123
扣除杂交的启发，提出了基因组扣除方案［F)］，若研
究的基因存在该基因缺失的突变体，就可以用变性
的野生型基因组 123与缺失基因组 123进行扣除
杂交，纯化出“多出来的那个片段”。然后设计接头
引物进行扩增富集，制备探针筛选基因组 123 文
库。只是基因组 123为双链，存在自我复性问题，
降低了每轮杂交中对差异片段的富集速度，因而需
经多轮扣除杂交。以上这些方法在具体操作中，也
会将其中 H种结合使用，如差式筛选和扣除杂交，先
通过扣除杂交，找出大部分单链差异基因片段，对这
些单链差异基因片段再建 0123文库，通过对这种
文库的差式筛选，找到差异表达基因，不仅减少了工
作量，也提高了灵敏度。I7/J等利用扣除杂交后的
#23或 123样品进行 11#K L !"#，发展了交互式
差减差异 #23 显示（ 450+648079 ,@A-470-+8/ :+;;545/-+79
#23 :+,697.，#D11）技术［F$］。它结合了扣除杂交和
11#KL !"#的优点，成为一种高效、快速分离差异
表达基因的方法。而为了适应于对大量基因进行全
面、系统的差异分析，0123 微列阵（0123 M+04874B
47.）、123 芯片（123 0>+6）［FF，F=，F%］和综合性基因鉴
定（N/-5J47-5: 64805:@45 ;84 J5/5 +:5/-+;+07-+8/，N!ON）［F&］
技术也开始建立起来。下面对 #13、DDE、#D11)种
方法作一下详细介绍。
!"# 代表性差示分析法（$%&）
#13的操作过程如图 )所示。
’）制备扩增子。提取 KD和 #D的 M#23并反转
录制备双链 0123即 -5,-54 0123和 :4+P54 0123。然
后用限制性内切酶切，将酶切片段装上接头，末端补
平后，加入接头引物进行 !"#扩增。
H）扣除杂交。去除接头后仅对 -5,-54片段加上
新的接头，用过量的 :4+P54 0123与之杂交退火，将
形成三种产物：-5,-54 Q -5,-54、-5,-54 Q :4+P54、:4+P54 Q :4+PB
54。
)）特异性片段的扩增。末端补平后，加入新接
头引物进行 !"#。) 种产物中仅自身退火形成的
-5,-54 Q -5,-54两端均能和新引物配对而呈指数扩增，
-5,-54 Q :4+P54仅一端可和新引物配对而呈线性扩增，
14+P54 Q :4+P54无引物配对不扩增。然后用绿豆核酸
酶去除单链 123 分子，再进行 !"# 富集特异表达
0123片段。
$）对特异片段进行克隆，通过 RNDE等技术进一
步分离特异表达基因。
该法可用于分离与生理条件改变相关的基因及
不同发育阶段差异表达的基因。E@A7/?等利用 01B
23 #13技术找到了激活 S（1）T重组的基因 !"# "
’和 !"# " H，并在 !45BU细胞系 ’&中分离到一些
在咖啡因作用下上调表达的克隆［F(］。朱玉贤等用
0123 #13法比较 O3处理和未经 O3 处理的豌豆
细胞内基因表达差异，发现该豌豆细胞内有数个被
O3特异性抑制的 M#23，并克隆了其中分子量最大
的片段 $#"%’ " )［=G］。湛凤凰等应用 0123 #13
法分离到 $个在鼻咽癌中缺失的片段，可能为具抑
癌功能的已知基因或新基因［=’］。R@等用此法克隆
到一在巨噬细胞中上调表达的新基因 &’( " ’［=H］。
此法具有高效、敏感、阳性率高的特点。但两处理样
间若存在较大差异，或某些基因在 KD中存在上调表
达，效果则不十分理想。
!"’ 抑制性差减杂交 ()$法（**+）
DDE的基本流程如图 $所示。
’）第 ’次杂交。提取 KD和 #D的 M#23反转录
为 -5,-54 0123和 :4+P54 0123，用 #,7N或 E75!酶切
成平头末端 0123，分成均等 H份，分别加不同的接
头，再分别与过量的 :4+P54 0123杂交，将形成 $ 种
产物：7，单链 -5,-54 0123、A，自身退火的 -5,-54 Q -5,-54
双链、0，异源退火 -5,-54 Q :4+P54 双链、:，:4+P54 0123。
H）第 H次杂交。合并 H 份杂交产物，加入新的
变性 :4+P54 0123退火、杂交，这次除了 7、A、0、: $种
产物外还形成产物 5，5是 -5,-54自身退火形成，
&&F 华 中 农 业 大 学 学 报 第 HG
##############################################################
卷
但两端带不同接头。
!）特异性片段的扩增。末端补平后，先后加接
头的内、外侧引物扩增，"和 #无扩增，$由于两端接
头互补形成发夹结构也无扩增，% 仅一端有引物结
合呈线性扩增，仅 &两端可配不同引物而呈指数扩
增。
’）特异性片段 &克隆，并进一步分离差异表达
基因。
该法通过 ( 次杂交和 ( 次 )*+，使假阳性率可
降到 ,-［,!］，且灵敏度高。用 ../可一次同时分离
012第 ,
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期 周国岭等：基因克隆技术
几十至几百个差异基因，使效率大增。但由于 !!"
需 #$%&量大（几微克），对 #$%&来源困难的材料
不利。因为 !!"对不同材料或材料间存在小片段
缺失不能有效检测，所以研究材料的差异不能太大。
!!"主要集中在肿瘤基因的克隆上，也有用于细胞
凋亡研究的［’(］。)*+,-等用 !!"法克隆到人视网膜
簇状蛋白的 .个新基因———!"#"$ 基因［/0］。
!"# 交互差减差异 $%&显示（$’((）
$!11的主要过程如图 ’所示。
.）交互差减。分别提取具有差异表达的 2种组
织细胞 &、3的 #$%&，反转录为 41%&，并构建 41%&
文库。将这 2个文库进行交互差减得到 &减 3和 3
减 &的 2个差减 41%&文库，由于构建文库所用的
噬菌体载体上带有质粒载体的结构，载体进入宿主
后，其上质粒载体被切下，得质粒 41%&文库。
2）差异显示。用 5’!锚定引物和 ’’!随机引
物对 2个差减文库提取的 1%&分别进行 67$扩增，
将扩增产物用 ’8序列胶电泳，显示并分离差异条
带，回收差异 1%&，再次扩增后，获得富集的差异表
达片段。
5）表达分析。采用反向 %9:;*<:, 分析和 %9:;*=
<:,分析鉴定经再次扩增的差异 1%&片段的真伪。
反向 %9:;*<:,分析是将差异显示得到的扩增后 1%&
片段转膜，分别与来自 &、3细胞系的总 #$%&经反
转录制备的526标记的 41%&第一条链探针进行杂
交，只与亲本来源细胞系杂交，而不与另一细胞系杂
交的即为真正差异表达的基因。
0）对差异片段克隆、测序，并进一步分离获得差
异表达的基因。
$!!1可以有效快速地鉴定由于细胞生理变化
而在基因组中差异表达的基因，它结合了 11$> ?
67$和扣除杂交的优点，减少或消除了共有序列，使
序列胶上条带清晰度增加，并使低丰度序列得到富
集，降低了假阳性率，且 $!11仅用较少的引物进行
逆转录 67$就可分析全部差异表达基因，但 $!!1
并不能完全杜绝假阳性。@+,-等用 $!11法克隆并
证实了促进肿瘤发展的基因（%&’()(）和抑制肿瘤
发展的基因（%*’()(）［’0］。
基因克隆的技术发展很快，种类也越来越多，但
每一种方法都有它的优势和劣势及适用范围和限制
因素，因而我们必须根据所克隆基因的类型和实际
条件选择最佳的方案。随着各种知识的积累，克隆
基因的技术也逐步完善，速度效率也不断提高，相信
人类终将掌握大规模、快捷、经济基因克隆的技术。
参 考 文 献
. 李子银，陈受宜 A植物的功能—基因组学研究进展 A遗传，2(((，22
（.）：’B/(
2 解 涛，梁卫平，丁达夫 A后基因组时代的基因组功能注释 A生物
化学与生物物理进展，2(((，2B（2）：.//.B(
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(O’ 华 中 农 业 大 学 学 报 第 2(
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卷
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&( 荀德明，李文鑫，蒋达和等 :用改进的 33H;LKEH技术进行人胚
差异基因筛选 :生物化学与生物物理进展，’UUU，’)（’）：’UD’U%
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