高内涵筛选优势及其应用

高内涵筛选优势及其应用 高内涵筛选 (一) 高内涵筛选的定义 高内涵筛选是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号传导等方面的影响，在单一实验中获取大量与基因、蛋白质及其他细胞成分相关的信息，确定被筛样品生物活性和潜在毒性的过程。高内涵筛选应用高分辨率的荧光数码影像系统获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信 ，[12] 息，对其多角度分析。 (二) 高内涵筛选的优势 高通量筛选是按照发现药物的基本规律，应用药理学、生物化学、细胞生物学、分子生物学、计算机科学、药物化学、组合化学等多种学科，快速、高特异性、高灵敏度地对样品进行筛选的过程。高通量筛选模型主要建立在分子水平之上，针对单一药物靶点对被筛样品的活性进行评价，仅能够得到有限的活性数据，无法全面反映出被筛样品的生物活性特征，因此初筛得到的阳性结果仍需要进一步确认。 高内涵筛选则能够以细胞为单位实现同时获取对多靶点的活性数据，其中涉及的靶点包括细胞膜受体、细胞器以及其他胞内成分。通过同步应用 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因、荧光标记、酶学反应和细胞可视化等常规检测技术，研究人员可以由细胞个体和群体的各种反应信息全面分析被筛样品，在新药研究的早期阶段既能够获得其对细胞产生多重效应的详细数据，如细胞毒性、代谢调节和 非特异性作用等，从而显著提高发现先导化合物的效率，增加开发的成功率。[3] (三) 高内涵筛选系统的组成 1(荧光显微系统 许多化合物只能引起细胞形态、细胞器形态和分子分布等微弱的改变，因此必须使用高分辨率的荧光显微系统才能够检测出来。细胞与荧光标记物 结合后，其生理状态的改变即可被荧光显微系统的荧光探针捕获。 2(自动化荧光图像获取系统 在观察到荧光标记的细胞变化后，可用高分辨率CCD相机将图像拍摄下来。自动化荧光图像获取系统可快速并精确地移动细胞培养板或载玻片，自由转换各种波长的激光及散射滤光片以满足多种研究需要。若同步使用激光共聚焦技术则可以与多种细胞培养板匹配，在较短时间内完成96孔板或384孔板样品分析。另外，还可添加温度控制系统以维持细胞活性，以及添加自动加样系统和白光系统等。 3(检测仪器 观察并获取图像只是高内涵筛选技术的第一步，为了有效完成分析工作，必须利用检测仪器从图像中提取有价值的信息。目前，一些国外医药公司开发了应用变化终点检测和动态活细胞检测相结合分析方法的检测仪器以拓展检测范围。例如美国Cellomics公司开发出的ArrayScan HCS Reader和 TMKineticScan HCS Reader等。 4(图像处理分析软件 随着高内涵筛选系统的升级，需要一种新型的高内涵筛选软件简化和自动化其操作,从而更加准确地测定基于形态学和荧光标记的细胞特征参数。例如Cellomics公司开发的BioApplication软件可将多种来源的图像数据转化为生物学信息，包括来自荧光检测、激光共聚焦、扫描流式细胞检测及其他高内涵筛选检测仪器的图像数据。 5(结果分析和数据管理系统 上述应用软件可用于追踪分析多种细胞变化过程，如信号分子转位、受体内源化、钙离子化、酶活化、细胞凋亡、细胞周期以及神经突触生长等，通过分析个体和群体细胞水平的多种特征获取有意义的生物信息。数据管理系统用来储存和管理已获取的图像和定量分析结果，并能够将这些结果以图像、表格等多种形式在个体和群体细胞水平输出，使研究人员能够系统地进 行 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 并作出决策。 6.其他 除上述这些主要组成外，生物信息学工具、新型细胞株和选择性试剂也是高内涵筛选系统的重要组成部分。 (四) 高内涵筛选的应用 1(研究细胞运动 细胞的运动特性影响细胞的很多生理和病理学过程，如癌细胞转移、炎症、血管形成、创伤修复和胚胎发育等。高内涵筛选能够通过测定迁移细胞的运动轨迹分析细胞的运动能力。实验在铺满标记荧光珠子的毯状结构上进行，随着细胞移动，珠子不断被吞噬而记录下其运动轨迹，轨迹面积与细胞运动能力大小是成比例的。 2(细胞毒性检测 细胞毒性检测是发现先导化合物的重要方法，如可利用肿瘤细胞毒性作用筛选抗肿瘤药物先导化合物。多数针对细胞增殖的高通量筛选方法是基于细胞蛋白量、酶活性、受体活性等单一指标的，如SRB (sulforhodamine B)法、MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide)法、5-溴脱氧 3尿嘧啶(bromodeoxyuridine, BrdU)参入法、H参入法等。最常用的方法是 MTT法，其原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将氮唑化合物(MTT)还原为甲臜(formazan)，甲臜产量与活细胞数成正比，即通过检测活细胞内的线粒体脱氢酶活性间接反映细胞的生长情况。但是细胞增殖可通过多条通路被激活，如蛋白激酶激活、DNA合成增加等，传统的方法并不能够反映样品产生细胞毒性时的作用机理。 [4]Vogt A等报道了一种高内涵细胞增殖筛选模型，可以直接反映细胞数目、线粒体聚集、核形态学变化等多个方面的信息。该模型采用三重荧光标记法，用MitoTracker(EX556/EM573)标记线粒体呈红色， Hoechst3334(EX350/EM461)标记细胞核呈蓝色，微管免疫印迹荧光反应二抗 标记物AlexaFluor488(EX494/EM519)标记微管呈绿色，样品与标记细胞作用后，即可通过高内涵筛选记数仪对细胞直接进行成像分析，红色荧光变化表明与线粒体聚集相关，蓝色荧光变化表明与细胞数目、核形态相关，这样就能够通过所得结果直接分析出被筛样品的细胞毒性作用机理。 3(筛选G蛋白偶联受体调节剂 应用荧光生物传感器如荧光染色、蛋白标记等方法对G蛋白偶联受体激动剂或抑制剂进行高内涵筛选，可得到G蛋白偶联受体或其下游蛋白在细胞的位置、数量等信息。其中使用最多的标记物是绿色荧光蛋白。绿色荧光蛋白是来源于JELLY(Aequoria Victoria)，其起始氨基酸序列包含发色团。绿色荧光蛋白发色团是65-67位的丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸三肽结构。绿色荧光蛋白可与G蛋白偶联受体的 C末端结合而检测其位置、数量变化。 [5]最近有pH敏感性花青苷(Cyaninedyes)染色法的报道出现。CypHer-5是一个pH敏感性的花青苷衍生物，其强烈的荧光只有在酸性环境(pKa 6.1)中才被检测到。G蛋白偶联受体细胞外的N末端表面决定簇可与标记有CypHer-5的表面决定簇抗体结合，抗体-G蛋白偶联受体复合物所在的细胞培养液pH为7.4，微弱的荧光不能被观察到;而G蛋白偶联受体被激活会引起细胞培养液pH降低，染色团荧光即能被观察到。 4(寻找凋亡诱导剂 HeLa细胞和淋巴瘤细胞U937在细胞毒化合物作用下培养后，加入 DNA 结合染料Hoechst3334，荧光连接探针结合活化caspases和甲氨基 –X-rosamine来检测线粒体膜电位 (MMP)，使用 ArrayScan仪器获取每孔一定细胞数的荧光成像。实验结果显示，caspase-3活化呈时间和浓度依赖性，线粒体膜电位降低，核分裂浓缩增加，因此该方法可用于筛选促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤药物。 5(临床应用 临床上一般通过测定生物标志物来评价一种疗法的有效性和毒性。高内 涵筛选基于图像检测生物标志物，具有直接反映新疗法效果的优势。目前， 肿瘤代谢、缺氧和及其他表型特征成像已有研究。除了应用于诊断，高内涵 筛选在代谢分析尤其是活体组织样本上也已得到应用。临床前高内涵筛选分 析可以评定在细胞或3D型培养系统等复杂模型上治疗的有效性。 (五) 推动高内涵筛选发展的关键因素 高内涵筛选的发展有赖于可检测靶标数量的增加和对图像数据信息处理 能力的提升， 主要包括开发特异性蛋白和细胞成分的标记试剂、更快更灵 活的成像分析模式以及解决数据管理问题。 (六) 高内涵筛选前景 高内涵药物筛选现已成为药物创新研究和开发领域中的一个重要组成部 分。由于高内涵筛选技术目前仍处在发展阶段，还有大量的技术难题需要研 究和解决，如靶标特异性作用、化合物毒性区分等。但是随着高内涵筛选技 术的日渐成熟，可预见其在药物发现过程中将显示更多的优势而成为新药研 发的重要平台。 参考文献: [1]GUILIANO KA,HASKINS JR,TAYOLOR DL.Advances in high content screening for drug discovery[J].Assay Drug Dev Technol,2003,1(4):565-577 [2]陈凯先,蒋华良,罗小民等.后基因组时代的药物发现趋势和实践[J]中国天然 药物, 2004,2(5):257-260 [3]孙婉,李敏.药物筛选技术的最新进展—高内涵筛选[J].中国药学杂 志,2006,1(5):12-16 [4]Vogt A,Kalb EN,Lazo JS.A scalable high-content cytotoxicity assay insensitive to changes in mitochondrial metabolic activity[J].Oncol Res,2004,14 (6):305-314 [5]Adie EJ,Kalinka S,Smith L,et al.A pH-sensitive fluor,CypHer5,used to monitor agonist-induced G Protein-coupled receptor internalization in live cells[J].B iotechniques,2002,33(5):1152-1154, 1156-1157 2008级药物化学专业硕士研究生 关鹏 2008年12月28日