毕赤酵母表达系统的应用研究

毕赤酵母 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达系统的应用研究 在DNA体外重组和异源表达技术中.酵母表 达系统是重要的一个组成部分.对于它的优势,大 量中外文献用实例证明用综述 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 酵母菌是最 简单的真核模式生物,兼有原核,真核两种表达系 统的优点: 1.全基因组测序完成.基因表达调控的机制比 较清楚,遗传操作相对简便: 2.生长繁殖速度迅速.能够耐受较高的流体静 压.类似于原核生物的快速繁殖并能达到很高的浓 度(130g干物质/L培养基): 3.有完整的亚细胞结构和类似于高等真核生 物的控制严密的基因表达调控机制.具有原核生物 所不具备的蛋白质翻译后的加工和修饰功能.如信 号肽剪切,糖基化,蛋白的折叠,二硫键的形成等, 性质较原核表达的蛋白质更加稳定.表达的外源蛋 白与天然蛋白相似.抗原性低.有利于应用,特别适 合于表达真核生物基因和制备有功能的蛋白质: 4.某些酵母表达系统具有外分泌信号序列.能 够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外.因此相对 利于后续的纯化: 5.不存在原核表达系统难以除去的内毒素.也 不存在哺乳动物细胞表达系统的特异性病毒和支 原体污染等.对人体和环境较安全 自然界中酵母种类繁多.目前被开发出来用于 表达外源基因的只是极少数酿酒酵母(Saccha— romyces.Cerevisiae)在分子遗传学方面被人们的认 识最早,也是最先作为外源基因表达的酵母宿主. 但由于酿酒酵母的局限.1983年美国Wegner等人 刘春凤 最先发展了以甲基营养型酵母(methylotrophic yeast)为代表的第二代酵母表达系统.其中毕赤酵 母(p.pastoris)是继S.cerevisiae之后被迅速推广的 一 种外源基因表达的宿主菌. P.pastoris表达异源蛋白的应用.主要从上游 设计,表述和纯化三个模块进行阐述. 上游设计 外源蛋白表达前的分析是相当重要的.好的开 始是成功的一半.在上游设计中人为控制的因素比 较多.要做足准备功课蛋白质高级结构是由其一 级结构即氨基酸序列所决定的.确定重组蛋白的氨 基酸序列是第一步.氨基酸序列由mRNA序列编 码.但由于遗传密码的简并性.mlKNA的编码序列 与相应的氨基酸并非一一对应关系.而是多对一的 关系.因此,核酸编码序列包含比氨基酸序列更多 的信息.基因的最佳化表达可以通过对基因的重新 设计和合成来实现有很多很好的软件和在线设计 软件根据目的蛋白的氨基酸序列.给予合适的参数 就可以自动给出该蛋白的优化核酸序列但单个软 件都会有其长处和短处.最好的办法是使用多个优 化软件分别进行优化切莫只依靠单一的软件优化 结果. 翻译效率在蛋白生产和积累中起着重要作用. 翻译过程分为起始,延伸和终止三个期.对于翻译 的起始,在真核细胞,有效的起始依赖于围绕在起 始密码子ATG上下游的一段叫Kozak的序列如 果用的是载体上的信号肽.只要保证阅读框正确就 可.密码子利用或偏爱对延伸有深刻的影响目的 蛋白基因使用的密码子可能不是你所选择的蛋白 生产系统进行高水平表达所偏爱的密码子.这种情 况是可能存在的例如,如果许多高A+T含量的基 因可能提前终止转录.得不到全长蛋白质产物:如 果mRNA有很多成簇的稀有密码子.这可能对核 糖体的运动速度造成负面影响.大大减低了蛋白表 达水平.利用偏爱密码子(preferredcodons)并避免 使用率低的或稀有的密码子合成基因.实现基因重 新设计的密码子最佳化.翻译终止是蛋白生产必须 的一步.更有效的翻译终止导致更好的蛋白表达 如果终止密码子附近序列没有最佳化.可能发生明 显增加的翻译通读.因此减少了蛋白表达总的来 说.翻译起始框架,翻译终止序列框架和密码子利 用应该仔细选择,以利于蛋白的最优水平表达 密码子的改造对某些蛋白会造成产量上的大 突破,也不是对于每个蛋白都有积极意义的.当然 在上游设计时,我们只能尽力进行密码子优化.实 现良好的开始.在设计过程中要注意一些细节: ?克隆酶切位点不能出现在目的DNA片段 中——如果片段长无法避免.可以采用平末端连 接: ?在设计表达的时候.如果在N.C端不能出 现任何多余的aa(比如药物蛋白表达).需要特别留 意: ?在设计克隆的时候要反复确定自己的读码 框是否正确,这可是致命的问题: ?克隆菌株需要有recA,endA 追求设计的完美是前提.在分子克隆实验操作 中我们还会遇到一些出乎常规的现象.但总会发现 是细节没注意造成了自己实验的失败实验操作不 是死板程序化的,是有一定相关的基础理论.作为 一 种工具.我们也要清楚它的理论源头.这些内容 无疑对专业工作者是相当必要的.遇到难点.分析 原因时就觉得不甚方便. 表达衣 优化重组基因后,克隆表达质粒.交给相应的 表达宿主菌.这时有些事情就不全是你想怎样就怎 样了.蛋白有没有表达就要看运气了.首先在外源 蛋白表达研究中.要注意选择合适的表达载体和宿 主系统.更要注意二者最佳匹配的问题.当然如果 没有表达,我们也会做很多努力.市面上有很多商 业化载体,菌株和多系统表达体系,我们进行不断 的尝试和寻找.然而同样的载体,同样的系统,很可 能表达这个蛋白表达量奇高,但是另外一个就是做 不出来.所以没有万能的载体.在多年工作实践中 碰到了很多现象.在大鼠干扰素a重组表达时,看 到了几种现象的一个小缩影. EasySe1ectPichiaExpressionSystem是被誉为最 简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒,在大鼠干扰素 a重组蛋白表达时.本人选择了试剂盒中的表达载 体pPICZot和表达宿主菌x一33.同时在目的基因 c端加了组氨酸标签.由于它的存在,不用考虑蛋 白的理化性质,轻松的捕获到目的蛋白,当然这是 在有表达的前提下.但当看到以下SDS—PAGE凝 胶时,发现情况不妙!图谱如图1: 确】 g了蛋? 66KD 45卫? 30?) 20.1l口口 14.4助 1 2 34 5,6 图13L发酵液超滤亲和柱捕获结果 挖取胶上的蛋白点.胶上胰酶酶切处理,然后 使用Bruker公司的AutoFlexIIIMALDI—TOF/ TOF质谱仪进行鉴定结合肽指纹图谱及TOF/ TOF串联质谱.经Mascot数据库搜索匹配.确认所 挖取的蛋白1—6均为大鼠干扰素a重组蛋白!这种 情况比没有表达还头疼!一般重复2—3次实验都没 有表达.这个蛋白就放弃表达了但在给予我们希 望的时候.我们不能放弃.需要做更多的实验来解 决这个麻烦针对多年实践中得到的数据进行一些 总结.我们应该能直观的确定挖取的蛋白1—6存在 N端不齐.降解带,理论分子量蛋白,糖基化蛋白和 过度糖基化蛋白等.由于生物制品的生产过程非常 复杂.实际上并不存在真正完全一样的生物制品. 但还是要求制品在某些理化性质上要一致下面进 行一些分析.对以后再次碰到问题有一个理性的帮 助. 1.N端不齐 对编号3,4的蛋白进行进一步精纯.由于二者 性质相近难以在常规技术上分离.用4.6X250mm AgilentC18在HPLC上做分离.3,4蛋白可以很 好的分开.分别对其进行N端测序.胰酶酶切肽段 质谱鉴定.分子量小的蛋白是符合理论分子量的. 而分子量大的蛋白N端多了以下氨基酸A— KEEGVSLEKR.其分子量1244.672刚好是二者的 差值.也是载体信号肽上的片段.说明在此位点上 也发生了切割.造成了制备蛋白的N端不齐.收获 表达蛋白质的肽链长短不齐.出现明显的不均一现 象.信号肽具有选择性,选择合适的信号肽对于提 高某种重组蛋白质的表达量是非常重要的.我们可 以试用标准的分泌信号肽或合成分泌信号肽使重 组蛋白的表达量大大提高 2.蛋白降解带 从产率,纯化.活性等等要素考虑,降解确实给 制备重组蛋白带来了困难.但蛋白酶降解是酵母表 达系统的一个共有缺陷.几乎所有在酵母中表达的 重组蛋白都或多或少地存在表达蛋白降解问题.只 是程度不同而已要是常规的分离 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 能将其与目 的蛋白轻松分离.产量可接受,就不去纠结这个问 题.有很多工作者的策略提供给我们参考,但应用 时发现不能绝对解决降解问题.只是降低了降解的 程度.甚至对于个别重组蛋白没有任何效果当降 解问题成为你制备目的蛋白的主要障碍时.我们需 要考虑造成降解存在的原因蛋白发生降解的原因 可能形形色色.我们可以先追查序列排除目的基因 本身的缘故这里要提到目的基因中最好不要含有 pro—glu—serT-thr这样的序列.因为这个序列是激活 蛋白水解酶的作用底物.会影响表达.另外也不要 含有x—phe—X—arg—gln和gln—arg—X—phe—Xj样 的序列(x=任何氨基酸),因为这些序列容易受到 溶酶体的切割.当然这要在我们确定目的基因氨基 酸序列时,就需要注意的.没有单一的策略可以解 决所有降解的问题.我们需要尝试不同的策略,也 许会找到合适的 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 .但没有得到解决的也是存在 的下面说说我们常规应用的一些策略: (1)改变培养基的pH值改善分泌蛋白的稳定 性.P.pastoris的pH值适应范围比较广,可以在 pH2.0,7.5的范围内生长不同的蛋白酶有不同的 最佳pH值作用范围.而且不同的重组蛋白对不同 的蛋白酶的耐受性有差异.选择适当的发酵pH值 可以不影响细胞的生长,降低蛋白酶活性或者使之 灭活.减少目的蛋白的降解. (2)温度是影响细胞生长和目的蛋白产率及稳 定性的一个重要因素.低温能影响目的蛋白的产 量.主要是由于温度较高时,重组蛋白不稳定.以及 死细胞释放的蛋白酶的活性增强.温度降到20? 也不影响细胞的生长.降温可得到更高浓度的目的 蛋白.同时细胞死亡率和蛋白酶活性都降低. (3)通过添加蛋白酶抑制剂也可减少目的蛋白 的降解.有广谱的也有特异性的,总之大规模表达 外源蛋白时添加蛋白酶抑制剂使生产成本大幅度 上升. (4)在培养基中补加一些富含氨基酸和多肽的 组分.如酪蛋白水解物(Casaminoacids),蛋白胨 (veastpeptone),胃蛋白酶水解物等,为蛋白水解酶 提供过量的底物.以减少目的蛋白的降解.直接添 加氨基酸如甲硫氨酸也能有效防止目的蛋白被降 解Won—AChoi等认为O.3ML—Arg和L—Lys能 够有效地防止目的蛋白被胞内蛋白酶酶解. (5)发酵时控制也是一个很关键的因素,控罐 好坏影响目的蛋白的降解.其中控制发酵时长.毕 赤酵母表达重组蛋白的降解可控制到最小程度. (6)产物的稳定性也可采用毕赤酵母表达宿主 的蛋白酶缺陷型菌株来提高.如SMD1168(his4, pep4),SMD1165(his4,prb1)和SMD1163(his4,pep4, prb1).这些菌株在编码蛋白酶A(pep4)和/或蛋白酶 B(PRB1)的基因中都有断裂.从而不能表达这些蛋 白酶.并且影响其他蛋白酶的加工与成熟.蛋白酶 减少对重组蛋白的降解.不过这些蛋白酶缺陷型菌 株表达重组蛋白效率不高.而且这些菌株活性差, 生长慢且难转化 (7)可将目的蛋白与一种在毕赤酵母中稳定的 蛋白伴侣融合表达,通过改变目的蛋白的性质来提 高稳定性.但这种改善会带来后期酶切的问题.有 利有弊. (8)酵母在发酵过程中会分泌羧肽酶,使某些 蛋白C端氨基酸降解,脱落,可以在C端加入一个 或几个氨基酸,防止蛋白降解,如谷氨酸等等.谷氨 酸对羧肽酶特别敏感,极易降解,脱落,这样羧肽酶 主要作用于谷氨酸.而对其他C端的氨基酸残基 几乎没有作用,所以可在分子设计时特意加入c 端谷氨酸,起到保护和稳定作用 总之,为了最大限度减少蛋白质的降解.通过 将以上策略进行优化.使用可能的培养策略高效的 获得目的蛋白. 3.糖基化 在大鼠干扰素a重组蛋白制备时.糖基化才是 它的主要问题.毕赤酵母能对表达的蛋白质进行 N,和O一糖基化.酵母分泌表达的N糖基化是可 以预测的,有如下序列:N—X—S/T就是潜在的糖 基化位点,x为任意氨基酸.1个糖基化位点会加 上卜3KD左右的糖基.毕赤酵母能对蛋白质中苏 氨酸fn/或丝氨酸上的羟基进行糖基化.产生0一糖 基化,但是无法预测其位点.并非所有的潜在糖基 化位点均会发生糖基化.如果糖基化对于蛋白的活 性或蛋白表达时折叠和分泌是必需的.于你的重组 蛋白将有积极意义.但若影响目的蛋白产量和功 能,应进行解析,找到解决问题的缘由在这里更需 要提到的是过度糖基化的问题.与酿酒酵母相比. 毕赤酵母表达重组蛋白质的过度糖基化程度虽然 有所减轻,但与天然蛋白质相比,仍然存在着过度 糖基化.实际应用发现其只有弊端存在:首先.毕赤 酵母的过度糖基化会掩盖蛋白质的功能位点.会使 重组蛋白质功能发生改变,严重时造成缺失.其次. 过度糖基化会影响重组蛋白质的合成和分泌f产量 严重减少).最后,虽然毕赤酵母糖基化后的蛋白质 通常具有高度异质性.但还是保留了重组蛋白的特 性,这对下一步的蛋白质纯化不利.对于某些重组 蛋白.理论发生糖基化也会造成以上弊端时.避免 毕赤酵母糖基化的发生尤为重要.避免毕赤酵母表 达蛋白质糖基化的方法有: (1)基因定向突变去除糖基化位点.这对于 N一糖基化是有效的.而对于.一糖基化和过度糖 基化是不支持的 (2)在毕赤酵母中将目的蛋白质与糖苷酶共同 表达. (3)在体内用衣霉素抑制糖基化及用酶对重组 蛋白质去糖基化等.高浓度衣霉素对抑制蛋白质糖 基化产生部分有效,但明显降低了蛋白质的表达 量. (4)改变培养基.当用FBS培养基代替BMMY 培养毕赤酵母时.有些蛋白的过度.一糖基化有所 减少,也可能减少毕赤酵母过度糖基化 越来越多的外源基因在毕赤酵母中的成功表 达,目前毕赤酵母作为表达载体主要还是以生产非 糖蛋白为主.当不需要重组蛋白发生糖基化时.可 以采取以上传统方法减少或者抑制糖基化的发生 与目前重组糖蛋白的主要表达系统哺乳动物细胞 相比,毕赤酵母在成本和时间上具有明显的优势. 其表达蛋白质的糖基化总是一个研究热点随着应 用毕赤酵母表达人源化的末端为唾液酸的复杂型 糖蛋白的成功.经N糖基化改造的毕赤酵母也将 成为重组糖蛋白的表达体系 综上所述,以大鼠干扰素a重组蛋白为例.N 端不齐,降解带,糖基化蛋白等存在的问题能解决. 但过度糖基化仍是一个主导问题我们使用传统方 法抑制糖基化,发现问题并没有质的解决.关键还 是氨基酸性质决定了表达的行为目前只能将这个 蛋白交予大肠表达系统进行表达.相信随着对其糖 基化机制认识的深入,进行基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 改造使糖基化 为有利因素,毕赤酵母表达系统将更加完善相信 更加完美的毕赤酵母表达系统将能按我们的构造 思路表达大鼠干扰素a重组蛋白 纯化 随着基因重组技术的快速发展.基因工程产品 的利用越来越广泛.据统计重组蛋白分离纯化的成 本约占总成本的60%一70%.探索一些简单有效的 分离纯化方法降低成本比重尤为必要重组蛋白存 在物理和化学性质的差异,即分子的大小,形状,溶 解度,等电点,亲疏水性以及与其它分子的亲和性 等性质色谱法技术基于此性质差异建立起来的. 如表1: 表1依据蛋白特性 蛋白质特性 电荷 大小 疏水性 亲和十牛 电荷,特异性,亲和性 酵母表达重组蛋白的分离,纯化分为两种情 况:胞内表达蛋白质和分泌型蛋白质.胞内表达蛋 白的优势存在分选和区域化.增加了表达蛋白的稳 定性.减少表达产物对宿主菌的毒害作用:具有糖 基化程度低等多种优点但针对纯化思路探讨存 在一个很大的障碍.菌体蛋白的存在增加了纯化难 度.我们平常以蛋白分泌型为主.表达的外源蛋白 可分泌到胞外.分泌的内源蛋白少.外源蛋白分离 纯化相应简便.分泌型培养基.收集培养基就可以 进行下一步纯化了.当然它不是简单到只要收集发 酵液就好了.发酵液的成分还是复杂的,只能依据 目标蛋白的物理化学性质摸索一套综合的分离程 序,以获得较高纯度的蛋白产品.没有一个典型的 事例可以综合可能存在的问题.此文只提一些在平 日纯化中感触较深的现象. 1-His—Tag纯化标签结合金属螯合亲合层析的 应用 由于金属螯合亲合层析具有配体简单,吸附量 大,分离条件温和,通用性强等特点,所以可选择范 围广,在高盐,一定浓度的变性剂以及去垢剂的条 件下.带6His纯化标签的蛋白质都可以和亲合填 料特异性结合.在表达模块.提到大鼠干扰素a重 组蛋白表达时.应用了组氨酸标签.我们可以从图 谱很直观的看到它的优势.His—Tag非常小.不会 改变目的蛋白自身的理化性质.在纯化过程中.不 需要考虑目的蛋白自身的理化性质.可以用金属螯 合亲合层析轻松的纯化到带6His纯化标签的蛋白 质可以快速的鉴定表达系统是否适合表达所需求 teininthemethylotrophicyeastPichiapastoris.Gene, 1993.136:111—119 『5]YamadaM.Secretionofhumanintracellularaspartic proteinasecathepsinEexpressedinthemethylotrophic yeastandcharacterizationofproducedrecombinant cathepsinE.BBA,1994,12O(6):279,285 (6]10tvosLJ,KrivulkaGR,UrgeL,eta1.Comparisonof theeffectsofaminoacidsubstitutiOnsandbetaNVSal— phaOglycosylationontheTcellstimulatoryactivityand conformationofanepitopeontherabiesvirusglycopro— rein.BiochimBiophysActa1995,1267:55,64 [7]WaterhamHR,DiganME,KoutzPJ,eta1.Isolationof thePchiapastorisglyceraJdehyde3phosphatedehydro— genasegeneandregulationanduseofitspromoter. Gene,1997,186:37,44 [8]CereghineJL,CreggJM.Heterologousproteinex— pressioninthemethyIOtrOphicyeastPichiapastoris FEMSMicrobiolRev,2000,24(1):45,66 [9]ChoiBK,BobrowiczP,DavidsonRC,eta1.Useof combinatorialgeneticlibrariestohumanizeNlinkedgly— cosylationintheyeastPichiapastoris.ProcNatIAcadSci USA.2003.100:5022—5027 [10]GardeS,FraserJE,NematpoorN,eta1.ProteinEx— pressionandPurification,2007,54(2):193,203. (作者单位:厦门伯赛基因转录技术有限公司)