全血胆碱酯酶活性测定
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实验五 全血胆碱酯酶活性测定
全血胆碱脂酶活性分光光度测定方法WS/T67—1996
[原理] 胆碱脂酶水解硫代乙酰胆碱（ASCH，acetyl-thilcholine）,生成硫代乙酰胆碱和乙酸。硫代胆碱与硫基现色几剂，5,5-联硫代双-2-硝基苯甲酸[DTNB，dithio-bis-(nitribenzoic acid)]反应，形成黄色化合物5-巯基-2-硝基苯甲酸（TNB）。在412nm长下比色定量。
[仪器]分光光度计，5mm比色杯；恒温水浴；离心机；血红蛋白吸管，20ul；刻度吸管，5.0ml, 2.0 ml；试管10ml；容量瓶，10ml。
[试剂]
1．1/15mol/L磷酸盐缓冲液（PH 7.4）；生理盐水：氯化钠0.85/100ml； 硫代乙酰胆碱（ASCh）溶液：称取ASCh 72.3mg，溶于生理盐水中并稀释成10ml。置冰箱中保存。临用时，以生理盐水稀释10倍；5,5-联硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB）溶液：称取DTMB19.8mg，滴加硫酸缓冲液并搅拌至完全溶解，溶液透
明（约2ml）。再用生理盐水稀释至10ml ，置冰箱中保存。临用时，用生理盐
水稀释10倍；出现黄色即弃取；毒扁豆碱溶液（抑制剂）：取毒扁豆碱约1mg，溶于1ml生理盐水中。临用时配制。严防污染其他试剂和器材。 2．巯基
标准
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溶液：准确称取还原型谷胱甘肽3.07mg，用水（经煮沸并冷却的水）
溶解并移入10ml容量瓶中，稀释至刻度。此溶液1ml相当于1μmol谷胱甘肽。因谷胱甘肽易氧化，故溶液应临用时配制。
[采样、运输和保存]取10ul末梢血滴入置有肝素钠或3ml磷酸缓冲液的小试管中，混匀，加塞。置冰瓶中运送，于4?冰箱内保存，尽快分析。 [分析步骤]
1．标准曲线的绘制：取5支试管，按实习10—6配制标准。
以水为参比测定吸光度。从各标准管的吸光度减去0管，以酶活性为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2．样品测定
实习表10—6 标准管的配制 管 号 0 1 2 3 4
巯基标准溶液，ml 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 水，ml 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 缓冲溶液，ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 DTNB溶液，ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 胆碱酯酶活性，μmol/ml 0.0 20 40 60 80 1．将样品从冰箱中取出，使恢复到室温，混匀待用。如果样品是采集到肝素钠
的吸管中，则加入3ml磷酸缓冲液，混匀后备用。
2．取样品液1.5ml置于另一支比色管，作为测定管。原样品管作为对照管。向
对照管中加入1滴抑制剂溶液。混匀，并将两管同置于37?水浴中预温5~10min。 3．向两管中分别加入0.5ml预先在37?水浴中保温过DTNB溶液和0.5mlASCh溶液，立即计时并混匀。在37?水浴中准确反应6min。
4．向测定管中加入1滴抑制剂溶液，混匀以终止反应。
5．离心除掉血细胞。取上清液放入5mm比色杯中，以水为参比测定管的吸光度
（A）和对照管的吸光度（A）。A减去ΔA‘，得吸光度差A，查标准曲线得全血胆碱脂酶活性单位。
6．测定人血样时，以每ml血样在37? 加温6min水解基质为1单位。1μmol谷胱甘肽能提供1μmol巯基，其显色效应相当于1μmol 硫代胆碱，也相当于酶
促1μmol基质（一酰硫代胆碱）的效应。现测定管取血量为0.005ml，在37?水浴中加热6min，每1ml巯基标准溶液含谷胱甘肽1μmol，故显色效应相当于0.1ml巯基标准溶液的酶活性单位为：
1μmol/ml×0.1ml×1/0.005ml=20单位
式中，0.1ml：巯基标准溶液的用量。如果试.2ml 巯基标准溶液，就相当
于40单位。余类推；0.005ml：血样量。
[注意事项]
1． 采样时，应注意不得溶血，否则将干扰测定。
2． 对照管的吸光度不得超过0.07～0.08，否则说明可能是溶血或DNTB自然分解，会使测定结果偏低。
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