枯草杆菌启动子—信号肽序列的克隆及序列分析

枯草杆菌启动子—信号肽序列的克隆及序列分析 枯草杆菌启动子—信号肽序列的克隆及序 列分析 amHI酶切的质粒pGPB14连接,转化大肠杆 菌C600.筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质柱井经酶切 分析,显示克隆的DNA片段在0.27—1.5kb之间.用SAnger的双脱氧链终止法测定了tO 个克隆片段的DNA顺序,结果表明,克隆的片殷都含有启动子,校塘体结合位点及信号肽序 列.克陛片段可以在大肠杆菌和枯草杆菌中恢复氨苄青霉素抗性的表型.卢一内酰胺酶活力 测定结果证明:大 外. 关键调枯草杆菌 分泌到胞 芽孢杆菌是传统的工业生产菌,能分泌大量的胞外蛋白而且安金,是研究蛋白质表达 和分泌机制的良好系统.利用它进行工业规模的外源基因表达和分泌.生产有用的蛋白类 产品,有重要的经济价值.80年代以来,国外一些 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 开始从事芽孢 杆菌启动子 妁克隆,并利用克隆的启动子组建表达载体,实现外源基因在枯草杆菌中的表达.为了探 索芽孢杆菌蛋白质分泌的机制和效率,构建分泌型表达载体,我们以信号赋序列探针质粒 ?GPB14为载体,用鸟枪法把枯草杆菌染色体的启动子一信号肽序列克隆到大肠杆菌,对 克隆序列进行了全序列分析井研究了其在大肠杆菌和枯草杆菌中的功能. 1材科和方法 1.1材料 1.1.1菌种及培养基枯草杆菌808是淀粉酶的生产菌,作为本研究的供体苗,由广 东省石龙酶制剂厂提供.枯草杆菌DB104,双蛋白酶缺陷变种.由美国Doi博士提供.太 扬杆菌C600来自法国Monod/Jacob研究所.大肠杆菌HB101(pGPB14)由Smith 博士惠赠.大肠杆菌C600(vsJ)由本实验构建.大肠杆菌JMIO1及ML3噬菌体来 自BRL公司的试剂盒. 大肠杆菌及枯草杆菌的培养基为L一肉汤培养基.枯草杆菌感受态细胞转化用GMI 及GMII培养基m.固体平板为L一肉汤培养基加1.5%琼脂及适量抗生素. 1.1.2主要试剂限制酶Xbal,BamH!为美国BRL公司产品,Sau3A为Promega 公司产品.EcoRI,T4DNA连接酶为华美生物工程公司产品,Sepharose4B为Pha rmacia产品,低熔点琼脂糖为Sigma公司产品,其余为国产试剂. ————一————, 一H 本文于1992年z月22日眭蓟.国家七五?重点科技攻关项目(75-71一om-o2)资助 期罗进贤等:枯草杆菌启动子一信号盐序列的克隆及序列分杌: I.2方法 t.2.1DNA的分离,纯化与酶解处理质粒DNA的分离主要按文献【7】的方法,得 到的粗抽提液通过Sepha~ose4B凝胶柱层析纯化.质粒的快速检测采用Doly的方 法.染色体DNA的提取按Marmur的方法.限制酶解反应按广家提供的配方和 方法. 1.2.2限制酶解片段的分离和回收限制酶解片段的分离采用低熔点 琼脂糖凝胶电泳 法,电泳完毕.在紫外光下切下所需片段.如2倍体积的TE缓冲液(10mraoI/LTrii pH$0,lmmo1]LEDTA),在65?保温5分钟.使凝跌熔解后在室温下用酚,酚一仿和 氯仿各抽提1次,酒精沉淀,溶于适量TE中. 1.2.3DNA的连接和转化DNA的连接和大肠杆菌的转化按文献[7]中介绍的方 法.枯草杆菌的转化参照Spizizen的方法II】. 【_2.4琼脂糖凝胶电泳与分子量测定琼脂糖凝胶-旅度为0.8《或1.4%.电泳缓冲液 为Tris一醋酸钠系统.分子量估算采用电泳法,以2DNA的Hind[1l酶切片段及|j)x174 RFDNA的HaeIII片段作为分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,根据电泳中DNA片段的迁移率与分子量的 对数成反比的原理,估算未知DNA片段的分子量. 1.2.5g-内酰胺酶活力的测定采用羟胺法. 1.2.6一内酰胺酶在胞内,周质空间及胞外的定位按Cornelis的方法. 1.2.7DNA序列分析将待测片段从pSJ质粒上切下,转移至Ml3双链DNA上, 转化大肠杆菌JM10l,提取重组的Ml3单链DNA作为模板,采用Sanger的双脱氧 链终止法进行DNA序列分析.所用试剂均来自BRL—GIBGO的M13克隆和序列 分析试剂盒,具体方法按厂方提供的说明书. 2结果与讨论 2.1枯草杆菌启动子一信号肽序列的克隆 信号肽序列的克隆过程如图l.pGPB14是能在大物杆菌和枯草杆菌中复制的双功 能载体.其上有完整的红霉素抗性基因及缺失了基园表达和产物分泌所需的启动子和信 号肽序列的一内酰胺酶基因片殷,在该基因的5.端有一小段的多克隆垃点,供外源DNA 插入.若插入片段含启动子,信号肽序列而且读码正确时,一内酰胺酶基因即可表达并 分泌一内酰胺酶,受体菌表现为氨苄青霉素及红霉素抗性.我们将经Sau3A酶解的枯 草杆菌染色体DNA与BamH[酶切的载体pGPBI4DNA以5:I的比例连接后转化 大肠杆菌C600,在台50~xg/ml氨苄青霉素和100ugLml红霉素的LB平板上筛选双抗性 转化子.从3,ag重组DNA中获得I8个抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子.将部分转 化子进行质粒快速检测(图2).从图2中可见,这些重组质粒都比载体 pGPB14大,经 用插入位点两侧的EcoRI,Xbal酶切后,经电泳分析,估算插入片髓在0.27一I,5kb之间 (表I,图3),将这些重组质植重新转化大肠杆菌C600,办获得抗氨苄青霉素的转化子, 表明氨苄青霉素抗性是由重组质枝编码的,将这些重组子命名为pSJ系列.挑选部分 重组子点布在台不同浓度氨苄青霉素的LB平板上,溯定这些重组子的抗性水平.表1显 示它们的抗性永平在l1)0--750~g]ml之间,这是不同的克隆片段中启动子和信号肢序列 的强度不同?【起的. 遗传 Tf;~,1060 EcoRlSadBamHIXbalSatld爿州? 1BamHI On o舯 目I枯草扦菌启动于一信号肽序刊的克隆 Fig.1Cloningofpromoterandsignalsequencecodingregion.fzomBacilluss ub,ilia 2.2克隆的启动子一信号肽序列在枯草杆菌中的功能表达 为了研究克隆在大肠杆菌中的信号肤序列是否在枯草杆菌的蛋白质分泌中起作用, 将从大肠杆菌中提取的部分重组质粒转化枯草杆菌DB104的感受态细胞,在台lOpg/ml 氨苄青霉紊及5~g4O0 pSJ1Ol5001DO 口SJi?3l2500 pGPBlIO 罗进贤等:枯草杆菌启动子一信号肢序列的克搀及序列分析77 转化子都能表达和分泌内酰胺酶(表2),这表明在大肠杆菌中克隆的启动子一信号肤 序列在大脑杆菌和枯草杆菌甲鄙具有启动基因表达和蛋白质分泌的功能. 围2H走肠杆菌转札于中提取聍萝组质牲电法国 l,8是载体pGPBI4其他是重组质拉. Pig20?B%~garoBgeteleotr.phor…iof rc?bh??tpi~smidsDSjsft0mE…liC6OO L4ne1andlaDeBafeveclorpGPBI4,othefs 0ftpIa*mid* 图3黾组质粒的酶讶电泳图 2,6是分子量对照,1D是载体FGPB14,其他是重 组质粒 Fig.s.4%aga~osegellec【r0PhofeEot 6a1-EcoRIdoubledigestionpa【tei-ns口ffe— COrnbinan【p】*smldt.z.加NA/Hind1I1;6. x17}RFDNAfH~~Uh,O.pGPB1/bI+ 占f0Rhother50rpSJt/Xbal+百?dRI 2.3重组质粒在大肠杆菌和枯草杆菌中产生的一内酰胺酶的活力 将收集的大肠杆菌及枯草杆菌细胞洗涤后,悬浮于冰水中,4屯摇动1o分钟,离心收 集上清液,沉淀再悬浮于10mmol/LTris-HCl,pH7.5中,超声波破碎细胞,再离心收集 上清液.用羟胺法分别?测定培养液和洗涤液,冰永低渗处理后的上清液及经超声波处理 表z各种克搓菌株产生的一内酰胺酶的话力及定位 Table2AmountsaDd pSJ70.443l.0961.052 .,5I|??,DBl04 口GPB】4000 t)$233.3821.248112} pSJ}1.90.0870.11 9S356.OO3O.674O.4S6 PSJ64.8240.2840.568 口SJ7j.5,20.014D.}8 总活力(Olm1) T0tj1 0 5.E3l 3.i92 7.2S7 5.326 2.59i 0 ,.654 2.144 „.13; 5.679 pSJ2GAAGAACCGAAAACGAAAGATC-3 arghrgly日erhisa1aglugluprolysthrlysasp pSJ5 i 5?TTTGATCATCATTAAT从GGACTATATCAAGTGTATCACGAGAGTGAAAACCT 从GC%TTACTTAATTGTTA从TTGAAACCGTTTTT从 TGAAGAAATAATACGTG TGACAACTTCGGCCGCCGATGTG眦CA从 GGCACATTTGTTTTTCGTGAG_AGCGCTGT .j? pSJ7 5.-TATTTCA从 TGCCGACTTCCCTTTTAAAAGCCTTTTCGTAGCGATTATCGAGCG CGGCGTTTTGCTTTCGGCTCCTTCATCCGGAAAAGAGCTGCGGGGCAA~TCAAAGCGA ATTGCAATTCAATTGAGGACACAATCAGACGGTTAAAAAGAGACGGAATGGCGCTT 一.一? metala1eu AAGGACCAGCTTGTCCAAACAGCGAAAG从 AGCGCCGAAGTCATT 1ysaspgin1euval6ginthralalysglusetalagluvallle 直从GAGGTAGGCGCA lysgluvalglyala GAGGAAATCAAGCCG „glugluAlelyspro 图?克旌的启动于信号肚序刊的棱苷酸顺序厦其编码的氨基酸顺序 (--35,一10”区以厦核糖体结告位点分别以一一和一-一.表示). Fig??Nucleot|de$~quen~caofclonedpromoter-~{gnal~equeae, ecodiagrtg.nd aminoacidsqmce.otsignalpeptlde~. (nc.一3,,一10regi.a胡ribosomebidingsites?indicatedby...d ——?——…1. GU,凹h Crp=;? Gn 0p.蛤 0g AS址 Ten Cr, GrTp们忱=暑 Gn0nn 甓 们抽 GgCh t期罗进贤等:枯草杆菌启动子一信号肽序硎的克隆及序列分析 所得的上清液中的一内酰胺酶的活力,分别称为”胞外酶,局质空间的酶和”胞内酶”? 测定结果如表2.表2结果显示:在大肠杆菌中.一内酰胺酶主要积累在周质空间,细胞 内及细胞外的酶活力都很低;而在枯草杆菌中,酶活力主要分泌到胞外.在周质空间和纽 胞内累积很少,这与大肠杆菌和枯草杆菌细胞壁结构的差异有关o 2.4克隆片段的DNA序列分析 采用Sanger的双脱氧链终止法对克隆的10个片段进行DNA序列分析(图4). 序列分析结果表明,】0个片段中实际上只存在4种不同的核瞢酸序列,如pSJ2,pSJ3, pSJ6和pSJ9以及pSJ4,pSJ12,pSJ13和pSJ14都是相同的DNA序列;每个片段 都台有启动子,信号肽序列,在它们之间,在起始密码子的上游都有明显的核糖体结合位 点,此位点与起始密码子之间的距离在4—2O多个bp之间.克隆片段编码的4个信号肽 都与目前已知的枯草杆菌蛋白质的信号肽不同;其中3个具有典型的信号肤特征:亲水 的N端及疏水的中央核心序列. 在枯草杆菌中有5种RNA聚台酶,负责个体发育不同阶段基因的转 录.这几种聚 合酶的差异在于其因子不同,它们负责识别和结合不同的启动子,即每种聚合酶都有自 .己对应的启动子.这5种酶是Eo4,E,E,E和E,阿拉伯数字表示因子 的分子量,E一表示此酶的因子的分子量为43000道尔顿.由于园子不同,它们识 别的DNA顺序即”--35”及一l0”区的碱基组成也不同.E是枯草杆菌中最主要的 RNA聚台酶,负责生长时期基因的表述,E则是在芽孢形成时期基因表达的酶.在 我们克隆的启动子片段中,pSd2,pSJ3,pSd6,pSJ9是E的启动子,它们的”一35”及 “ 一 10”区是TTGACA和TATAAT,这与大肠杆菌和大多数原核基因的启动子相同. pSJ7是E的启动子,其--35及”一lO区是TTCAAA和CCTTTT.另外,pSJ5 中有3个启动子,第一个启哥于的一l0区与第二个启动子的”--35区部分重叠,几个启 动子并存及重叠的现象.在枯草杆菌中常有发生,这有利于基因在不同时期表达. 参考文献 A口agnestop0ulosGaadJSpizizen,1961.J.Bacter|o1.,81.741 BifaoboimHCadJDol#,1979.Nuc1.Acid~lRes.7:I513 CoraelisPfd.I982.Mo1.Gcn.Genet..186:5(]7 DBl,JW,andJT$mith.1971BlocItem.J.,123:49j DoiRHandLFWang,1986.Microbio1.Rev..如:227 hanak4T,口j.19B1.J.Bicteriol_.147:716 M?iatiTf口1982in:M0lccul3rCloaing.CSHL.NewYork M4r?u【J口actcriol_169:3;21 l4WangLFandRHDo|,1987.Mo1.GenGenet..207:114 1234567B9O,