[doc格式] 泰山四叶参石蜡制片的实验研究

[doc格式] 泰山四叶参石蜡制片的实验研究 泰山四叶参石蜡制片的实验研究 2009年4月第6卷第1O期 泰山四叶参石蜡制片的实验研究 ? 实验研究? 段瑞.封玲玲,王艾,苏雪慧,李同德 (1.泰山医学院药学院,山东泰安271016;2.泰山医学院医学系,山东泰安271016) [摘要】目的:研究泰山四叶参的石蜡制片方法,为其组织显微鉴定特征的研究奠定基础.方法:应用石蜡制片技术制 作泰山四叶参的组织切片.结果:建立了泰山四叶参的石蜡制片方法.结论:泰山四叶参的石蜡制片方法可靠,为进 一 步的研究奠定了基础. 【关键词】泰山四叶参;石蜡制片;实验研究 【中图分类号1R931.5【文献标识码】A【文章编号11673—7210(2009)04(a)一041—03 ExperimentalstudyonparaffinmethodforCodonopsisLanceolataofMoun? tainTai DUANRui1,FENGLinglin~,WANGASUXuehui1,LITongde (1.PharmacologicalCoHegeofTaishanMedicalUniversity,Tai’an271016,China;2.MedicineDepartmentofTaishanMed— iealUniversity,Tai’an271016,China) 【Abstract]Objective:TostudytheparaffinmethodofCodonopsisLanceolataofMountainTai,andprovidebasisforits microscopiccharacteristics.Methods:PreparedtheCroSSsectionsofCodonopsisLaneeolataofMountainTaiusingparaffin sectioningmethod.Results:TheparaffinmethodofCodonops~LanceolataofMountainTaiwasestablishcd.ConclusiOn: TheparaffinmethodofCodonopsisLanceolataofMountaJnTaicanbeusedasthebasisforitsmicroscopiccharacteristics. 【l’eywords]CodonopsisLaneeolataofMountmnTai;Paraffinmethod;Experimentalstudy 五岳独尊的泰山不仅是世界自然文化遗产,而且蕴藏着 丰富的中药资源.野生于泰山深处的泰山四叶参(Codonpsis LanccDlataofMountainTai1,是桔梗科党参属植物四叶参的根, 别名山海螺,奶参,羊乳,轮叶党参,系草质缠绕藤本,有白色 液汁.生于山地,灌木,林下,沟旁或林中『l-21,被誉为”泰山之 宝”.与泰山何首乌,黄精,紫草并称为”泰山四大名药”[31.四 叶参以根入药,具有补气通乳,养阴润肺,清热解毒,消肿排 脓等功效问.现代研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,四叶参具有抗氧化,抗突变,抗肿 瘤,调节中枢神经系统,调节血脂,保肝醒酒等作用[41.野生于 泰山深处的泰山四叶参不仅具有四叶参的一般特征,而且具 有明显的地域特征,其效能也与其他产区的有所不同.近年 来针对泰山四叶参的开发,应用研究逐渐增多,但其生药学 鉴定的研究较少见,本实验应用经典的石蜡制片法制备了泰 山四叶参的永久性横切片,为其生药学显微鉴定的研究奠定 了基础. 1仪器与试药 1.1仪器 BMJ-1生物组织包埋机(天津航空机电有限公司);QPJ-lB 生物病理旋转式切片机(天津天利航空机电有限公司);202-2AB 型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司):MP300D电 子天平(上海恒平科学仪器有限公司);显微镜(O1ympusSys. ternMicroscopesModelsBX52);700万像素奥林巴斯数码照相 机;SHB—B95A型循环水式多用真空泵;调温型电热套. 1.2试药 泰山四叶参,采集于泰山,经泰山医学院药学院生药学 【作者简介】段瑞(1974一),男,硕士,讲师,主要从事中药研究. 实验室鉴定;无水乙醇,二甲苯,氯仿,甲醛,冰乙酸,均为分 析纯;番红O,固绿FCF,中性树胶,高效切片石蜡. 1.3溶液配制 1-3.1FAA固定液按62.5%乙醇90m1,冰醋酸5Tnl,福尔 马林5Tnl比例配制. 1.3.2番红染液取番红0试剂1g溶于100ml50%乙醇 即可 1.3.3固绿染液取固绿试剂0.1g溶于100ml95%乙醇中 即可 2方法与结果 石蜡制片的步骤及操作基本过程如下:取材一固定一冲 洗一脱水一透明一浸蜡一包埋一切片一贴片一脱蜡一染 色一透明一封藏[5-. 2.1取材 取四叶参根鲜品(干品需先用水浸软),洗净泥土,用锐 利刀片横向切割成0.3,0.5em长的小段,其中,直径在1cm 以上的纵向分为二等份,选择的 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 要少而精,应有代表性 和完整性,注意取材的时间,部位,方向.切取材料时一般应 用锐利刀片,不可来回切制,更不可用剪刀剪取,以防损伤组 织. 2.2固定 将取材后的四叶参小块立即投入预先配好的FAA固定 液中进行固定,固定时间为1O,12h. 固定前将药材于抽滤瓶中用真空泵抽滤约10min,以抽 净药材中空气,使药材能在固定液中立即下沉.以便固定液 的渗入.材料投入固定液中若不能立即下沉.其中必定含有 CHINAMEDICALHERALD巾蕾医药弓掘41 ? 实验研究? 空气,应采用间歇抽气法驱除空气,否则固定液难以渗入:如 抽气数次后材料仍不下沉,则以后渗蜡亦难完全,故应将其 弃去不用. 固定材料与固定液的比例一般为l:20.固定剂的用量不 可太少,以免被材料中的水分过度稀释.固定的目的是使植 物细胞立刻停止生命活动,杀死其原生质,以保持其原来的 微细结构,即保持组织中各细胞的形态结构与生活时相似;同 时,还可以凝固和沉淀各种蛋白质使组织变硬,以利于切片 2.3冲洗 将四叶参自固定液中取出,移入50%,60%,70%的乙醇 中,逐级洗涤,每次2h,然后在70%乙醇中洗涤lh.将固定 液全部除净,最后置70%乙醇中过夜. 经固定的材料,必须洗去材料内部及外部的固定液及其 沉淀物,以利于材料的保存和染色.洗涤剂可根据固定液的 性质不同而选用水或与固定液浓度相近的乙醇.洗涤次数与 时问的长短依组织块的大小,性质和固定时间而定 2.4脱水 将冲洗后的四叶参依次移入80%,90%,100%,100%浓 度的乙醇,逐级进行脱水,每级脱水时间为2,1,1,1h. 材料经冲洗后.组织中含大量水分,不能直接进入透明 剂和石蜡中,故需脱水.脱水的目的在于使组织中的水分完 全除去,使透明剂和石蜡能够顺利地渗入组织中,并和细胞 壁亲密结合,也可使材料变硬,以便于切片及封藏时形状不 变. 脱水用的乙醇浓度须由低到高逐渐增加.以免发生原生 质收缩和细胞壁变形的现象.脱水用的第一级乙醇浓度,应 按材料的含水量来定.例如材料是用FAA固定液固定的,而 FAA的乙醇含量是60%,冲洗时亦用60%乙醇开始脱水;若 材料经水浸或水洗.则须用50%乙醇开始脱水,下一级用 10%乙醇,以后各级含量均差10%:供组织学研究的坚硬木 质中药可直接用50%乙醇脱水.梯度乙醇的用量,般为材料 的2,3倍.材料可在70%,95%乙醇中过夜,但在无水乙醇中 时间不宜过长,以免材料变脆,难以切片. 2.5透明 四叶参经脱水后,依次移入1/3氯仿+2/3无水乙醇,2/3 氯仿+1/3无水乙醇,纯氯仿,纯氯仿中进行透明,每个浓度透 明时间为2,2,1.5,1h. 透明的目的在于引入石蜡充满整个细胞,常用的透明剂 为二甲苯.但易使组织收缩,变脆.氯仿不易燃烧.而且不易 使组织变脆.故此次采用氯仿作透明剂.在透明过程中,为防 止材料收缩变脆,应由低浓度到高浓度分级进行.进入纯氯 仿时,需要更换一次试剂,以便除净材料中的乙醇,至材料完 全透明,当细胞内均充满氯仿时即可浸蜡.如材料尚未透明 干净,则需重新透明. 2.6浸蜡 2.6.1低温浸蜡在以上纯氯仿中轻轻倒上一层约2/3的已 融化的石蜡约20ml,倒入的石蜡即成固体,然后将小烧杯放 在50qC的温箱内.经一天到石蜡不再继续融化为止,倾出1/2 蜡液,再倒入熔融石蜡约20ml,放人53?的温箱中继续浸蜡 一 天. 2.6.2高温浸蜡清除全部蜡液,倒入新鲜纯蜡液约20ml, 放入63?的温箱中继续浸蜡.约4h后,再用纯石蜡置换一 42田国医药写报CHINAMEDICALHERALD 2009年4月第6卷第lO期 次,约2h后,即可准备包埋.如此反复2次后,即可将氯仿 全部除去 浸蜡时,蜡液浓度必须逐渐增加,使其缓慢地浸入.若蜡 液浓度增加过快,可导致浸蜡不彻底,切片发生困难.低温浸 蜡时,石蜡不融化,而是缓慢地溶解在氯仿中,向下渗入材料 组织内,此步骤即使时间稍久,组织亦不会受损,所以必要时 时间可延长;高温浸蜡时,将小烧杯移入较高温度温箱中,此 温度不宜过高,以防引起组织变硬,变脆,收缩等.影响切片. 2.7包埋 将熔融石蜡倒在铜模内,立即用预热的镊子将已浸透石 蜡的四叶参小块放在铜模内,并固定好位置.待纸盒内的石 蜡表面凝结后,慢慢地平放在盆内的水面上.待纸盒内的石 蜡表面已凝固,立即沉入水底,使其迅速冷却成硬块,等蜡全 部凝固后取出,贴上标签编号,存放备用.蜡块的迅速冷却极 为重要,如慢慢冷却,则石蜡容易析出结晶.导致不能切片. 补救方法是融化后重新包埋. 2.8切片 包埋完成后,即可将蜡块放在切片机上进行切片.先用 小刀整修蜡块至四叶参根即将露出,再将蜡块置切片机的蜡 块固定器内,用螺钉固定.装好切片刀,调好刀的角度倾斜约 10.角,拧紧旋钮,松开刀座锁紧旋钮并调节刀座进退旋钮. 使刀口接近蜡块面,并锁紧.用手摇动手轮切平蜡面,在调节 所需切片的厚度为8m,试切几次至切片均匀,材料完整并 连接成蜡带时开始连续切片,将切下的蜡带用毛笔移到温水 (约56oC)中,蜡片底面(刀切的一面,较光滑)靠在水面上. 2.9贴片 取洁净的载玻片,从水中捞起蜡片于其一端.其中蜡片 底面贴于载玻片,用洁净的镊子调节好蜡片位置.将载玻片 放在50?温箱中进行烤片.将烧杯中装适量蒸馏水放在载玻 片下面,1h后取出载玻片于蒸馏水中湿润一下,立即取出继 续烤片,约10h. 载玻片用前必须用玻璃清洁液洗净.清洁时可将载玻 片用自来水冲洗后,沥去多余的水,再放入清洁液中,浸泡 30min,然后把清洁液倒回原瓶.再用自来水冲洗30rain,用 蒸馏水洗2次,再用70%乙醇浸洗或浸泡24h,最后用干净 的纱布擦干.新的载玻片可以直接用清洁液清洗;盖玻片的 清洁方法与载玻片相同,但处理时需特N/I,心,以免破碎. 2.10脱蜡 将烘干的粘有材料的玻片浸于纯二甲苯中,30rain,以 溶去渗入材料组织中的石蜡:再移入二甲苯与无水乙醇的等 量混合液中,浸5,10rain;最后再移入无水乙醇中,浸5,10rain, 以除尽石蜡及余下的二甲苯. 2.11染色,透明 为使植物组织分化情况显现出来,以便于观察研究,植 物切片必须用染色剂染色.因多数染料对被染组织有一定的 选择作用,固可借此将各种组织区分开.在植物制片中应用 的染色剂种类很多,对高等植物的根茎叶等组织的切片一般 采用番红和固绿二重染色法.其染色结果是:木质化细胞壁, 细胞核,核仁及染色体为红色;纤维素细胞壁,细胞质及纺锤 丝为绿色.具体操作过程如下: 95%乙醇一80%乙醇0%乙醇0%乙醇(每级l,2min) 一番红染液『浓度为1%(溶媒为50%乙醇),1h卜+50%乙醇一 2009年4月第6卷第l0期 60%乙醇一70%乙醇一80%乙醇一95%乙醇(每级2rain)一 固绿溶液『浓度为0.5%(溶媒为95%乙醇),2min卜+5%乙 醇一纯乙醇(1,2min)一50%二甲苯(3min)一二甲苯(3min) 二甲苯(3,5rain). 番红和固绿在纯乙醇中易掉色,因此,在纯乙醇中停留 时间不宜过长,1,2min即可.在用固绿染色前必须检查染色 是否合适:番红染色应深一些,因脱水时番红的颜色会褪去 一 部分.如过浅,应退回重染. 2.12封藏,贴标签 将染色片擦净残留液,滴加1,2滴中性树脂后,轻轻盖 上清洁的盖玻片,需防止盖人气泡,然后置恒温箱中,40?左 右干燥2h以上.取出于载玻片左边贴上标签,即为四叶参 根的永久制片. 3讨论 虽然石蜡制片法已经是一种较为成熟的经典方法,但在 具体制作某一材料时,尚需反复试验以确定最佳条件.本实 验中,四叶参的固定,冲洗,脱水,透明,浸蜡等步骤中的试剂 浓度,用量,时间等都是影响结果的重要因素,每一步处理不 佳都会影响到后续的切片,染色. 所制切片能否进行显微鉴定组织结构的关键,取决于切 片和染色,本实验中切片的厚度,染色剂的种类,浓度,染色 时间等均是在反复试验后确定的最佳 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 .切片厚度从5, 6,7,8,10,12Ixm中确定为8m最合适,易切片,切片后不 易破碎.染色后观察细胞也不会重叠.染色剂中碱性品红染 色时间长且不适合二重染色,在第二次染色后易退色;番红 ? 实验研究? 0的浓度应为0.8%,1%(溶媒为50%乙醇),番红浓度降低, 染色时间将会延长.且染的颜色也将变浅;O.1%(溶媒为95% 乙醇)的固绿染色剂不易着色,0.5%(溶媒为95%乙醇)的固 绿染色剂不仅可着色,且染色时间短,还能防止已染的番红 被洗掉. 本实验研究也提示现在通用的石蜡制片方法只是一个 总体框架,在具体应用时还需反复试验才能确定最佳条件, 因此.有必要根据不同类型材料对该方法进行进一步的规 范. 【参考文献】 【l1中国药科大学主编.中药辞海【M】.北京:中国医药科技出版社,1993: 516. 【2】胡伟建,马水利,高冬梅.大有开发利用价值的轮叶党参【J1.中 国野生植 物资源,2002,21(2):25. 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