实验四 氨基酸的纸层析法
中国海洋大学试验报告 2013年11月13日
姓名:郭沈杰 年级专业:2012级生物科学 同组者:蔡萍萍
学号:12050011012
实验四 氨基酸的纸层析法
一、实验目的
了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。
二、实验原理
以滤纸为支持物的层析法,称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时,水为固定相,它不滤纸纤维亲和力强;有机溶剂为流动相,它不滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的,称为上行法;有上向下移动的,称为下行法。
将样品在滤纸上确定的原点处展层,由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配,且他们的分离系数各不相同,所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同,于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来,形成距原点不等的层析点。
在一定条件下,室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变,,不同的氨基酸有固定的移动速率,R值, f
R=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 f
混合氨基酸做样品时,如果只用一种溶剂展层,由于某些氨基酸的移动速率相同或相近,就不能将它们分开,为此,当用一种溶剂展层后,可将滤纸旋转90度,以第一次所的层析点为原点,在用另一溶剂展层,从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。
氨基酸无色,利用茚三酮反应,可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。
本实验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、苯丙氨酸。
中国海洋大学试验报告 2013年11月13日
三、实验仪器
1、 新华滤纸
2、 层析缸
3、 细线
点样管 4、
5、 橡皮筋
6、 电吹风
7、 喷雾器
8、铅笔
9、直尺
四、实验试剂
1、精氨酸、 苯丙氨酸、 混合氨基酸,精氨酸、苯丙氨酸, 2、展层剂:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸馏水=13:3:3:1,v:v, 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液:0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮,贮于棕色瓶中
五、实验步骤
1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张,在一端打孔,系一根细线,在另一端2~3cm处用铅笔画一横线,在上面相同间隔画3圆点,原圈直径约5mm,。 2、取毛细管3支,分别吸取精氨酸、苯丙氨酸、氨基酸混合液少许,在原圈处点样,样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干,点2~3次为佳。
中国海洋大学试验报告 2013年11月13日
3、点样后将滤纸放入层析缸中展层,注意点样线要高于层析液面,滤纸不要贴在层析缸璧上,当展层至另一端1~2cm处时,停止展层,大约2~3小时,。
4、取出滤纸,用铅笔记下溶剂前沿,然后用热风吹干,或烘箱60?,烘干。 5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液,注意使溶液不倒流,不间断。
6、用吹风机吹干,观察层析点,确定其几何中心。
7、量取数值,计算各自的Rf值,不
表
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中
标准
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氨基酸Rf值比较,确定样品氨基酸种类。,书上图谱横着看,
六、实验结果
实验数据
组数 谷氨酸 苯丙氨酸 混合氨基酸 原点到溶剂前沿的距7.90 7.90 7.90 离(cm)
原点到层析点中心的4.55 1.35 4.55 距离(cm) 1.35
0.5759 Rf 0.1709 0.5759 0.1709 不表中标准氨基酸Rf值比较,可知混合氨基酸是1:1混合的谷氨酸和苯丙氨酸的混合物。
原始数据
中国海洋大学试验报告 2013年11月13日
七、实验分析
1、纸层析法是利用各种氨基酸在两相中不断进行分配,分离系数不同,导致氨基酸随流动相的速率不同,在滤纸上相互分离形成距原点不等的层析点,而且在一定条件下,不同的氨基酸有固定的移动速率的原理。由于分离时间,室温等条件的限制,分离会出现误差,可以通过计算相对的R值,减少实验误差。 f
2、根据各个氨基酸的Rf值,知道要分离的氨基酸是否能被分开,分的有多开。 就是说如果知道每个氨基酸的Rf值,没做实验,基本上就知道各个氨基酸在纸层析后的相对位置,及氨基酸谱带。
3、纸上分配层析所出现的拖尾现象原因是在点样品后,样品点吹的太干燥所致。
中国海洋大学试验报告 2013年11月13日
八、问题讨论
1. Rf的影响因素:
室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等
2. 注意事项:
1,样点直径不宜超过5mm,且应边吹边点。
2,点样线要高于层析液面,滤纸不要贴在层析缸璧上,当展层至另一端1~2cm处时,停止展层。
3,喷茚三酮—无水丙酮液时要均匀,注意使溶液不倒流,不间断。
4,观察层析点时要多等一段时间,使得显色点更清楚,更有利于几何中心的确定。
5,操作时要带手套,一定不要直接用手接触滤纸已层析过的部分。因为手上的油脂汗液等会影响展层剂,影响氨基酸的溶解度