毕赤酵母表达实验手册（中文）

毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。 然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰 胺化及 蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制， 不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二 硫键并折叠成 高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠， 是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活 性，为了得到有活 性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比 较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业 化的基因 工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。 但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的 加工 修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才 能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠 杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简 单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰， 合理 的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系 统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和 利 用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调 控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae） 在 分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。 1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一 系列外 源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵 母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人 鼓舞， 但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷 贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高 效表 达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产 量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以 甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以 Pichia.pastoris（毕 赤巴斯德酵母） 为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系 统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外， 还有以下 几个优点［1、9、11］； ⑴ 具有醇氧化酶 AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子 之一。 ⑵ 表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。 ⑶ 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 ⑷ 毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解， 而且减少对细胞的毒害作用。 Pichia.pastoris 基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表 达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中， 能使产物 有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子 AOX1， 已高效表达了 HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素 C 片段、基因工程抗体等多种 外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保 持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系 统，而且非常适宜扩大为工业 规模［14］。目前美国 FDA已能 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 来自该系统的基因工程产品，最近来自该系 统的 Cephelon 制剂已获得 FDA 批准，所 以该系统被认为是安全 的． Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更 多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品［9、 11］。 近年来，Invitrogon 公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年已经有 300 多种外源蛋自在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系 统。 毕 赤酵母宿主菌常用的有 GS115和 KM71两种，都具有 HIS4营养缺陷标记。 其中，GS115 茵株具有 AOX1 基因，是 Mut＋，即甲醇利用正常型；而 KM71 菌株的 AOX1位点彼 ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 菌株都适用于一般的酵母转化 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。 Pichia.pastoris 酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源 重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达［15］，包括 启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。表达载体都是穿梭质粒， 先在大肠杆菌复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞。为使产物分泌胞外，表达载 体还需带有信号肽序列。 毕 赤酵母表达系统有多种分泌型表达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效 分泌表达。胞外表达需要在外源蛋白的 N 末端加上一段信号肽序列，引导重组 蛋白进入分 泌途径，可使蛋白蛋白质在分泌到胞外之后获得准确的构型。毕赤 酵母对外源蛋白自身的信号序列识别能力差，在本试验中所使用 pPICZαA质粒， 其信号肽来 自酿酒酵母的 α-交配因子（α-factor），能很好的达到以上的要求。 并且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是其具有 Zeocin 抗性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利［1、9］。 pPICZαA质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它的主要特点简介如下： ⑴ 具有强效可调控启动子 AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶）； ⑵ 具有 Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用 Zeocin进行筛选，即在 YPDZ平板上生长的转化子中，100％都有外源基因的整合，大大简化 了重组转 化酵母的筛选过程［15］。在操作过程中，Zeocin 也可用来筛选含表达载体 pPICZαA的大肠杆菌转化子，不必另外使用 Amp，经济而又简 便；。 ⑶ 在表达载体 A0X1 5’端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点， 多克隆位点下游有 A0X1 3’端终止序列； ⑷ 分泌效率强的信号肽 α-factor. Invitrogen 公司开发的毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前被应用为最为广泛 的酵母表达系统，其主要的优点有：醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵， 重组蛋白表达量高。外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在。同时，高效 分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细 胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且．有利于产物的纯化。 一． 毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制 1．1 各种母液的配制 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight 10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的 13.4%酵母基础氮源培养基） 4℃保存。 34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于 1000ml水中，过 滤除菌。 500*B （0.02%生物素 Biotin） 4℃保存 保存期为 1年。20mg的生物素溶 于 100ml水中，过滤除菌。 100*H （0.4%Histidine 组氨酸） 4℃保存 保存期为 1年。400mg的 L-组氨 酸溶于 100ml水中，（加热至 50℃以促进溶解），过滤除菌。 10*D （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期为 1年。200g葡萄糖溶于 1000ml水 中，灭菌 15min或过滤除菌。 10*M （5%Methanol 甲醇） 保存期为 2个月。将 5ml的甲醇与 95ml水混 匀，过滤除菌。 10*GY （10%Glycerol 甘油） 保存期为 1年以上。将 100ml甘油和 900ml 水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。 100*AA （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸） 4℃保存 保存期为 1年。 分别将 500mg 的 L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和 L-异亮氨酸 溶于 100ml水中，过滤除菌。 1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将 1mol/L的 K2HPO4 溶液 132ml与 1mol/L的 KH2PO4溶液 868ml混匀，其 pH为 6.0，如需调节 pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节 pH。 1.2 常用溶液及缓冲夜 1.2.1 碱裂解法抽提质粒 DNA所用溶液： 溶液Ⅰ：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA，25mmol / L Tris－HCI (pH 8.0) 溶液Ⅱ：0.2mol／L NaOH，1％ SDS（临用时配制） 溶液Ⅲ：29.44g KAc，11.5ml Acetic acid，加 ddH2O至 100 ml。 4℃保存。 1.2.2 10% 甘油 （Glycerol）： 将 100ml甘油和 900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。保存期为 1年以上。 1.2.3 Rnase-H2O： Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Administrator Highlight Administrator Highlight 1ul Rnase 加入 1ml 灭菌 dd H2O。4℃保存。 1.2.4 TE缓冲液： 10mmol / Tris-CI（pH 8．0）， lmmol / L EDTA（pH 8.0） 1.2.5 STE缓冲液： 0.1mol / L, 10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0) 1.2.6 SCE缓冲液： 1mol / L Sorbitol (山梨醇), 10mmol / L 柠檬酸钠 ， 10mmol / L EDTA 1.2.7 1M potassium phosphate buffer （pH 6.0）： 132 ml 1M K2HPO4 868 ml 1M KH2PO4 1.2.8 50X TAE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液，pH 8.0（1L）： 242 g Tris 57.1 ml Acetic Acid 37.2 g EDTA 二． 毕赤酵母表达的培养基配制［5］ 2.1 LB（Luria－Bertani）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％ NaCl l％ PH 7.0 制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于 培养 pPICZαA原核宿主菌 TOP10F’时可加入 Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB（Low Salt LB）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％ NaCl 0.5％ PH 7.0 制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存数月。 用于培养 pPICZαA原核宿主菌 TOP10F’时，加入 Zeocin 25ug / ml，可以 4℃ Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Squiggly Administrator Highlight 条件下保存 1～2周。 2.3 YPD （又称 YEPD） Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基） Trypton 2% dextrose (glucose) 2% +agar 2% +Zeocin 100 μg/ml 液体 YPD培养基可常温保存；琼脂 YPD平板在 4℃可保存几个月。加入 Zeocin 100ug / ml，成为 YPDZ培养基，可以 4℃条件下保存 1～2周。 2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）： yeast extract 1% peptone 2% dextrose (glucose) 2% sorbitol 1 M +agar 2% + Zeocin 100 μg/ml 不管是液体 YPDS培养基，还是 YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放 4℃条件下， 有效期 1～2周。 2.5 MGY Minimal Glycerol Medium （最小甘油培养基） （34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将 800ml 灭菌水、100ml 的 10*YNB 母液、2ml的 500*B母液和 100ml的 10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为 2个月。 2.6 MGYH Minimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸） 在 1000ml的MGY培养基中加入 10ml的 100*H母液混匀，4℃保存，保存期为 2个月。 2.7 RD Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight 错误£¬ 应加入1%酵母粉 Administrator Highlight Administrator Squiggly Administrator Highlight Administrator Highlight Regeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基） （含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨 基酸） 1. 将 186g的山梨醇定容至 700ml，高压灭菌； 2. 冷却后于 45℃水浴； 3. 将 100ml的 10*D、100ml的 10*YNB；2ml的 500*B；10ml的 100*AA等母 液和 88ml无菌水混匀，预热至 45℃后，与步骤 2的山梨醇溶液混合。4℃保存。 2.8 RDH Regeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸） 在 RD培养基配制的第三步中，在加入 10ml的 100*H母液，同时无菌水的体积 减少至 78ml即可，其余配制方法与 RD相同。4℃保存。 2.9 RD及 RDH平板的制备 1. 将 186g 的山梨醇和 15-20g 琼脂粉定容至 700ml，高压灭菌；冷却后于 60℃ 水浴； 2. 参照RD/RDH液体培养基配制的步骤 4，将 100ml的 10*D、100ml的 10*YNB； 2ml的 500*B；10ml的 100*AA等母液、（10ml的 100*H母液）和 88（78）ml 无菌水混匀，预热至 45℃后，与步骤 1的山梨醇/琼脂液混匀； 3. 迅速制备平板。4℃可保存数月。 2.10 RD及 RDH 的 TOP 琼脂的制备（常用于酵母菌的包被） 1.将 186g的山梨醇和 7.5~10g琼脂粉定容至 700ml，高压灭菌；冷却后于 60℃水 浴； 2.参照 RD/RDH液体培养基配制的步骤 4，将 100ml的 10*D、100ml的 10*YNB； 2ml的 500*B；10ml的 100*AA等母液、（10ml的 100*H母液）和 88（78）ml 无菌水混匀，预热至 45℃后，与步骤 1的山梨醇/琼脂液混匀； 3.将该 TOP琼脂置于 45℃水浴冷却、保温，备用。 2.11 MD与MDH Minimal Dextrose Medium +（Histidine） 最小葡萄糖培养基 +（ 0.004 %组氨酸） （含有：1.34%YNB；；4*10-5% 生物素；2%葡萄糖） 1. 100ml的 10*YNB；2ml的 500*B和 100ml10*D母液，用 800ml的无菌水定容 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 至 1000ml即可； 2. 如配制MDH，可在上述的MD中加入 10ml的 100*H即可； 3. 如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入 15~20g的琼脂。4℃可保存数月。 2.12 SOC培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％ NaCl 0.05％ Glucose (1mol / L) 2% 121℃高压灭菌 20min，冷却后，4℃保存 三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 接种 GS115于 5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板， 30℃培养 48 小时，用 YNB基本培养基和含 His的补充培养基作点种分离纯化， 挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划 YPD平板，4℃ 保存。 3.2 pPICZαA原核宿主菌 TOP10F’的活化培养 TOP10F’做为菌种保存在－70 ℃条件下，在进行扩大培养抽提质粒之前，先要进 行活化培养。 接种 TOP10F’于 5ml LLB（加入 25ug / ml Zeocin）中，37℃，200 rpm ，培养 16～18小时。 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.3.1线状质粒 DNA的脱磷酸化处理 为了防止载体质粒 DNA的自身环化，用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理酶切后 的质粒 DNA，具体操作如下： ⑴ 建立反应体系： 线性化的质粒 35ul 10x CIP buffer 4ul CIP 1ul ddH2O 5ul Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. ——————————— total 45ul ⑵ 在 PCR仪上控制反应温度（加石蜡油封闭），37℃，15 min ；50℃，15 min； 56℃，30 min（灭活）。 ⑶ 在 56℃未开始前停止，加入 proteinse K ，用于灭活 CIP，加入试剂如下： 反应物 45ul 10x 5％ SDS 7ul 10x EDTA （pH 8.0） 7ul proteinse K 5ul ddH2O 6ul ————————————— total 70ul ⑷ 纯化使用 QIAquick spin kit ，按照 2.2.3.3步骤进行，20 ul 灭菌 ddH2O洗脱 纯化产物。进行 1％琼脂糖凝胶电泳，120 V， 观察纯化结果，并大约估计 DNA 浓度。 3.3.2 E.coli TOP10F’ 感受态细胞的制备及转化 ⑴ 取 10 ul TOP10F’ 菌液，接种于 200ml LB液体培养基中活化培养，37 ℃ ， 200 rpm，16～18小时。取 100 ul菌液接种于 200 ml 液体 LB培养基中。 37 ⑵ ℃ ，200 rpm，培养 16～18小时。 ⑶ 灭菌 500 ml 离心管，4℃，4000 rpm，20 min 。得菌体沉淀。弃上清，菌体 用 10％甘油重悬并洗涤。重复洗涤 3次。 ⑷ 第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约 1ml 液体用于重悬菌体。 ⑸ 从制得得感受态细胞中，取 200 ul于灭菌 EP管中，加入连接反应产物 5ul ， 混匀，不要产生气泡，在冰上放置 5 min。 ⑹ 将混匀后得 200ul菌液移入电击杯中。 ⑺ 使用电击穿孔仪进行转化，设置为 电压 2500 V，时间 5 ms。 ⑻ 电击后，往电击杯中加入 800ul SOC培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌 1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，轻摇 45～60 min。 ⑼ 取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的 LLB－Zeocin平板上，正放，待涂 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 布液不在流动，37 ℃ 培养 12～16小时。 *注：设空载体做对照。 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.4.1 菌体的准备： 1. 挑取酵母单菌落，接种至含有 5ml YPD培养基的 50ml三角瓶中，30℃、 250-300r/min培养过夜； 2. 取 100-500μl的培养物接种至含有 500ml新鲜培养基的 2L三角摇瓶中， 28~30℃、250-300r/min培养过夜，至 OD600达到 1.3~1.5； 3. 将细胞培养物于 4℃，1500g离心 5min，用 500ml的冰预冷的无菌水将菌体 沉淀重悬； 4. 按步骤 3离心，用 250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； 5. 按步骤 3离心，用 20ml的冰预冷的 1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬； 6. 按步骤 3离心，用 1ml的冰预冷的 1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终 体积约为 1.5ml； 7. 备注：可将其分装为 80μl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周 之内）。 3.4.2 电击转化： 8. 将 5~20μg的线性化 DNA溶解在 5~10μl TE溶液中，与 80μl的上述步骤 6所 得的菌体混匀，转至 0.2cm冰预冷的电转化杯中； 9. 将电转化杯冰浴 5min； 10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电 流、电容等参数，按优化的参数，进行电击； 11. 电击完毕后，加入 1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至 1.5ml的 EP 管中； 12. 将菌体悬液涂布于MD或 RDB平板上，每 200~600μl涂布一块平板； 13. 将平板置于 30℃培养，直至单个菌落出现。 推荐：电压 1.5kV；电容 25μF；电阻 200Ω。电击时间为 4～10msec。 3.5 Pichia酵母表达直接 PCR鉴定重组子的方法 3.5.1 模板的处理： Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 1. 平板上的菌落长到肉眼可见时（约 12小时）； 2. 将除了模板之外的其它 PCR 反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用 Kit 中已有的检测专用的引物，或者或者一条使用载体上的引物，一条使用基因 的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）； 3. 用半根灭菌的牙签（节约，而且好用）挑取菌落，在 PCR管中涮以下，放入 一个灭菌的 1.5毫升离心管，对 PCR管和 1.5毫升离心管编号； 4. PCR扩增，1％ agarose电泳； 5. 对于 PCR扩增显现特异性条带的克隆，把置于 1.5毫升离心管中的半截牙签 扔到 5毫升 YPDZ培养基中，30度培养，8－12小时后提质粒，酶切鉴定确认。 注意：本试验方法应用在需要挑取的克隆较多（也就是克隆效率低），使用 PCR 初筛可以使工作量大为降低。 3.5.2 PCR反应体系： 以 TaKaRa Taq DNA聚合酶反应为例： 3.5.3 PCR反应条件： Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 ⑴ 接种重组和空质粒转化子于 5ml YPDZ培养基， GS115菌于 YPD培养基作 对照，30℃，培养 16～18小时。 ⑵ 室温下，1500 g离心 5-10min收集菌体 100 ulTE⑶ （pH 7.0）重悬，加入 300 ul EDTA（pH 8.0），0.07M Tris－HCl，3 ulβ- 巯基乙醇，1ul Lyticase ，37℃水浴 30 min。 10000g⑷ 离心 5~10min，取沉淀，加 90ul TE重悬。 200ul ⑸ 饱和酚，200ul氯仿，混匀，离心 30s ，取上层水相。 ⑹ 加入两倍体积无水乙醇以及 1/10体积的 NaAC，-20℃放置 30min； 10000g⑺ 离心 20min，弃上清；75%乙醇漂洗沉淀一次； ⑻ 干燥后，加入 15 μl的 TE或 H2O溶解，-20℃备用。 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验 1. 挑选一单菌落，置于装有 25ml MGY、BMG或 BMGY培养基的 250ml摇瓶 中，于 28-30°C/250-300 rpm培养至 OD600 = 2-6 (~16-18 h)； 2. 室温下 1500~3000g离心 5min，收集菌体，用MM、BMM或 BMMY重悬菌 体，使 OD600 =1.0左右（约 100~200ml）； 3. 将步骤 2 所得的菌液置于 1L 的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于 28-30°C/250-300 rpm的摇床上继续生长； 4. 每 24h向培养基中添加 100％ 甲醇至终浓度为 0.5～1.0%； 5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为 1ml，置于 1.5ml EP管中，最大转速离 心 2~3min，分别收集上清和菌体， 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和 96h； 6. 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检 测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用； 7. 可以用 SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。 3.7 Muts表型重组酵母的诱导表达实验 1. 挑选一单菌落，置于装有 25ml MGY、BMG或 BMGY培养基的 250ml摇瓶 中，于 28-30°C/250-300 rpm培养至 OD600 = 2-6 (~16-18 h)； 2. 室温下 1500~3000g离心 5min，收集菌体，用 1/5到 1/10原培养体积的MM、 BMM或 BMMY重悬菌体（约 10~20ml）； 3. 将步骤 2 所得的菌液置于 100ml 的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置 于 28-30°C/250-300 rpm的摇床上继续生长； 4. 每 24h向培养基中添加 100％ 甲醇至终浓度为 0.5～1.0%； 5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为 1ml，置于 1.5ml EP管中，最大转速离 心 2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。 时间点一般取：0、24、48、72、96和 120h； 6. 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检 测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用； 7. 可以用 SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。 4. 试验的注意事项 4.1信号肽识别位点的设计 以 质粒 pPICZαA为例。在利用 PCR 反应在外源基因两端引入酶切位点的试验 中。如果质粒 pPICZαA双酶切中丢失了 KEX2蛋白酶的酶切位点 Lys－Arg，应 该在上游中，增加了编码 Lys、Arg的密码子 AAA、AGA 。酵母细胞膜中中的 KEX2蛋白酶是 α-factor信号肽的切割酶，它能有效识别酶切位点 Lys－Arg，通 过对信号肽的切割使基因表达产物释放至胞 外。 4.2 PCR产物酶切保护碱基的设计 利用 PCR转换酶切位点，通过 P3、P4两引物的扩增在 rhEGF的两端加上 XhoⅠ、 XbaⅠ的识别位点和 5个保护碱基。 根 据限制性核酸内切酶的工作原理，内切酶首先需要结合到核苷酸序列上，并 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 在上面进行滑行，直至识别到酶切位点，为了能使内切酶有效的结合到序列上以 利于其的 有效加工。在利用 PCR进行酶切位点转换的时候，通常应在 5'端限制 酶位点外再加 3 个保护碱基 GC［16］，防止引物合成中因为合成效率和纯化问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 而导致 的酶切位点的残缺。 核苷酸保护碱基之为了保证限制型内切酶的工作效率，在其识别位点的两侧应该 保证一定的旁侧序列，换言之，识别位点是限制型内切 酶识别并特异性切割底 物的必要而不充分的条件。鉴于 NEB(New England Biolabs)公司在限制酶领域的 总体研究水平和对保护碱基方面的独到理解，在设计引物时可以参照 NEB公司 的产品目录后面的附录：Cleavage to the end of DNA fragments进行［17］，但是， 一些不常用的酶或虽有推荐的保护碱基序列但酶切效率仍不高的酶还是很难设 计保护碱基。本次实验中，根据美国基因动 力实验室文献的报道［18］；XbaI、 NheI和 SpeI位点 5’端保护碱基须在 5个左右才容易被酶切割，以及一些前人的 经验总结，我们在设计引物时在 识别位点 5’端，设计了 5个保护碱基。以保证 较高的酶切效率。 4.3高保真 DNA聚合酶的使用 Vent DNA聚合酶是从高温嗜热菌中分高出的高保真（High Fidelity）耐高温 DNA 聚合酶，能纠正 DNA扩增中产生的错误，而传统的 Taq DNA聚合酶，Tth DNA 聚合酶及其变体 AmpliTaq，KlenTaq 等都无 3’至 5’纠错功能，因此在扩增时出 现碱基错配的机率为 2.1x104。这对于大批量的 PCR 产物而言，并不是十分严 重的问题，因为又同样错误的 DNA分子仅占全部合成的 DNA分子群体的极少 一部分。但是，如 果 PCR扩增的 DNA片段是用于分子克隆，那么这就是件值 得重视的事情，因为此种分子含有一个或数个错误掺入的核苷酸，那么在该克隆 中的所有克隆 DNA都将带有同样的“突变”。将会导致严重的后果［19］。 具有校正功能的 DNA聚合酶还有 Pfu，Deep Vent，Pwo，UlTma等，Pfu是其 中出错率最低的，比 Taq DNA聚合酶低 10倍。在本 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 中，为了减少 hEGF 在 PCR过程的错误扩增，在人工合成 hEGF的过程中使用了 Vent DNA聚合酶。 随着 PCR技术的不断发展成熟（扩增长度、保证性、产量和特异性等），质粒构 建过程的大多数细胞内的 DNA复制将被 PCR这一细胞外的 DNA复制所代替， 质粒构建效率将有质的飞跃。 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 4.4密码子的偏好性的原则 酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。了解表达系统宿主在 密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析外源基因表达的规律有重要意义,也为 改造外源基因或改造宿主细胞提供依据［20、21］。 4.5线性化及采用电转化的原因： 在 pPICZαA-EGF电转整合入 GS115的时候，因为需要比较高的转染率，我们对 其用限制性内切酶 SacⅠ进行线性化的处理。 细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程的难点。因为未线性化的环状质粒之 间发生同源重组的几率非常低，所以重组转移载体必须用特定的限制性内切酶进 行线性化处理。这种处理的目的： ⑴ 防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活； ⑵ 让同源重组以指定的方式发生。 4.5 乙醇沉淀法的问题 主要步骤如下： 1）酶切体系（80ul）中 2倍体积的无水乙醇加 1/10体积的 PH5.2 NaAC，混匀 2)-20 20℃ 分钟沉淀 3)13200rpm，20min，离心后弃上清 4)75%乙醇 300ul轻轻洗，同上离心 5min，弃上清 5)37度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。 6)20ul ddH2O重溶 如果想提高转化效率，可以稍微做一些改进： 1. 还是用酚抽一下，去除内切酶； 2. 75%乙醇应洗两遍，尽可能去除盐离子，防止电转化杯被击穿，同时可提高效 率； 3. 在沉淀时，如用终浓度 2.5M的醋酸钠+2.5倍体积的无水乙醇，可沉淀几乎所 有的 DNA，但需要用 75%的乙醇认真的洗两遍。 4.6 酶切的总结 影响重组质粒构建效率的最关键步骤在于酶切，不管是否是定向克隆还是非定向 克隆。酶切的关键在于切干净，彻底的酶切反应是成功的一半，特别是载体的酶 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 切，尤其是双酶切。 双 酶切一般是先反应低盐 buffer 的、后反应高盐 buffer 的，如果低盐 buffer 的 酶在高盐 buffer的酶的反应条件下有低活性（一般来讲在 NEB的手册上都有标 示），最好就先纯化（酚/氯仿抽提、乙醇沉淀）过，再进行第二次酶切反应。注 意：有相同功能（如：切同一序列，并产生相同末端）的 酶，不一定是相同的 酶（结构、性质不同）。 双酶切失败有很多原因，先要看你抽的质粒有没有问题，你可以用 2—3种确定 单酶切的酶分别切质粒，如果都只有一条带就没问题； 再 看你的双酶切的缓冲液是不是合适，如果你的双酶切条件不对，就会有大小 不同的片断。有时后提供给你的缓冲液的理论值与实际有很大的差别。建议你回 头检查一 下你的质粒超螺旋是不是很好，酶切实在不行的话，就分开来切，顺 便检查你的那一个酶，或者那一个酶切有问题。抽提质粒要注意溶液 Ⅱ 处理时 间不要超过 5分钟，太长会有部分质粒不能复性，而且酶切不动。 酶切反应成功的前提是对质粒载体的大致定量，太多的载体用量对酶切效率有负 面影响，而太少的质粒载体不能保证实验的需要。 4.7线性化及采用电转化的原因： 在重组质粒电转整合入酵母的时候，因为需要比较高的转染率，我们对其用限制 性内切酶进行线性化的处理。 细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程的难点。因为未线性化的环状质粒之 间发生同源重组的几率非常低，所以重组转移载体必须用特定的限制性内切酶进 行线性化处理。这种处理的目的： ⑴ 防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活； ⑵ 让同源重组以指定的方式发生。 4.8构建分泌型表达载体的必要性 外 源基因表达产物分泌到酵母细胞外，是表达外源基因的一种理想方式。相当 一部分有药理学作用的蛋白质本身就是分泌蛋白质，在分泌过程中通过一系列细 胞器，使 蛋白质得以加工、修饰、折叠，形成与天然结构更为相似，具有高度 生物活性的蛋白质．外源基因若以非分泌形式表达，不通过分泌途径，必然会失 去一些对蛋白质 进一步加工和修饰的机会，从而影响产物的空间结构和生物活 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 性［23］。 毕赤酵母自身分泌内源性蛋白很少，诱导培养基皆由小分子物质组成，成分简单， 这为分泌至培养基中的外源基因表达产物纯化提供了极大方便，使纯化工艺变的 简单易行，有助于提高表达量。 4.9 如何减少 PCR反应中的引物二聚体 减少引物形成二聚体的可能性： 1.退火温度设置不对，导致引物与模板的结合率降低。 2.引物设计不好，很容易形成二聚体。 如果碰到这种情况，可以尝试从以下几个方面解决： 1设计引物的时候 首先要熟悉引物设计的一般的原理，参考一些资料，积累经验。如果条件允许的 话，可以用比较靠得住的引物设计软件验证我的引物，如果没问题，则进行下一 步。 2 改变退火温度 一 般引物合成后厂家会提供其 Tm值，可以根据这个温度为基准来做温度实验。 如果你设计的引物里头有酶切位点和保护碱基，则此方法不行，可以用比较靠得 住的引 物设计软件来计算你引物中与模板结合部分的 Tm值，然后以此为基准 做温度实验。也可以根据自己的实际操作经验来解决问题。 3最后 建议换一下 Taq酶，某些进口的 Taq酶太严谨，导致引物二聚体的形成，这也 是可能的。我们试验中一直都是使用某国产的 Taq酶，效果挺理想。 参 考 文 献 1. 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