null聚合酶链反应
聚合酶链反应
（一）PCR技术（聚合酶链反应）
⒈原理：PCR技术实际上是DNA体外扩增技术，其原理为：
①以提取的DNA为
模板
个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载
，在94℃解链变性后提供单链DNA模板（模板变性）
②将特定设计的与待扩增DNA模板两端序列互补的两个引物（短链互补DNA引物）经低温退火使引物与模板DNA互补结合（模板与引物退火连接）
③在PCR反应中，在Taq酶（DNA聚合酶）作用下，使加入的游离单核苷酸（dNTPs）由引物5′ 3′方向按碱基配对原则，沿DNA模板形成两条互补DNA链。（引物沿模板互补延伸）如图
新合成的DNA链又可作为下一轮PCR反应的模板，这种经热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，经反复多次循环可产生2n的指数扩增，使微量模板达可见量用于实验。
其引物设计、 PCR反应条件、仪器稳定性、技术性强，对环境要求严，以防假阳性产生。
null⒉PCR种类：种类多、用途多而广泛，列举常用法
⑴逆转录PCR（RT-PCR）：又称RNA-PCR
先将从细胞总提取的总RNA，在逆转录酶的作用下合成cDNA（序列用mRNA）以提供PCR模板。然后以cDNA为模板在互补的两个引物的引导下，在Taq酶作用下，将加入的dNTPs按碱基配对原则，沿cDNA 模板扩增DNA（见上图）
优点：①只需少量mRNA 模板cDNA
②cDNA中已不含内含子
③对构建cDNA文库非常有利
⑵锚定PCR：当mRNA cDNA后，用末端转移酶在cDNA3′末端加上poly(dG)作锚位，然后用带有酶切位点的poly(dC)作锚定引物 ，进行PCR扩增。
优点：可克隆和扩增未知的DNA/RNA、基因序列，便于组装，免受基因两端序列限制。null⒊反向PCR：能将位于已知基因序列两侧的未知序列（转座子、插入序列、易位整合的插入基因）扩增获得。
方法：选择已知序列内部没有该酶切位点的内切酶，对DNA进行酶切，经环化后，将环化分子用与已知序列两端的互补反向引物进行PCR扩增，可获大量的未知DNA片段，进一步测序。（图）
反向PCR 对研究转座子、反转录病毒插入序列以及所有可以整合或转位到基因组（已知序列）中的插入序列DNA片段（如原癌基因）。null⒋随机引物PCR
以合成一系列不同随机排列的寡核苷酸链（通常为10聚体）为引物，对基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物经丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳，EB染色显条，分析DNA多态性。
此法可通过扩增产物DNA片段多态性，可分析基因组相应区域的DNA多态性，被命名为随机扩增的多态性DNA(RAPD)。 RAPD可用于基因组指纹图的构建，可应用于系统进化研究、物种鉴定和亲缘关系分析，法医可用来作亲子鉴定。null⑸单链构象多态性PCR（SSCP）
不同肿瘤由于单链DNA分子中因单一核苷酸不同，其DNA的二级结构的构象有差异。 PCR产物电泳后的DNA迁移率不同，其电泳条带上有差异。通过比较DNA的电泳类型，即可测出基因的点突变、插入、缺失突变等。
此时若用Southern印迹杂交更为精确。
⑹其他PCR技术
①差异显示RT-PCR：复杂、引物多、费用大、操作技术要求高、假阳性高，不常用。
②俘获PCR：技术复杂，不常用。核酸分子杂交核酸分子杂交
⒈Southern blot（又称Southern印迹杂交）
提取基因组DNA，经酶切后电泳分离，将分离定位在凝胶上不同分子量DNA条带，用碱变性处理，使双链拆开，再如图转移到硝酸纤维素膜上，用标记的目的DNA探针进行同源DNA杂交。带有核素标记的DNA探针结合后，经洗涤仍留在膜上，经X-光片显影定影，根据标记信号，证实基因组DNA靶分子上是否含有目的基因探针的基因片段。
方法：①虹吸印迹法：利用毛细管虹吸作用将凝胶上DNA片段转移到膜片上，转移时间长，需过夜或在12~18h之间，探针与膜杂交。
②真空转移法：采用抽真空技术将凝胶上缓冲液引流至下槽中，可快速将凝胶上DNA片段转移到膜片上。方法①凝胶在下，膜片在上，方法②凝胶在上，膜片在下。如图 null⒉Northern-blot（又称Northern印迹杂交）
Sorthern杂交样品是DNA，而Northern杂交样品是RNA。 RNA样品的变性、电泳转移方法与Southern杂交法相同，其标记的杂交探针可以是DNA，也可以用RNA特异探针。
本法可从RNA水平研究基因的表达。
⒊斑点杂交
是Sorthern-blot 法衍生而来的快速、简便的鉴定微量DNA样品的技术。
可直接将样品DNA点于硝酸纤维素膜上，固定后先预杂交，再用核素标记的特异探针在密封袋中进行杂交，有斑点产生者为阳性。还可根据斑点大小，进行相对定量分析。
具有快速、简便、只需微量样品、反应体积小、无需转膜及其相关设备。
缺点：难于确定被测基因片段的分子位置。null⒋原位杂交：用标记已知DNA序列的探针，使其与细胞或组织切片中核酸进行杂交。此法因基因组DNA各基因位置未发生改变，故称原位杂交。
有两种方法：
①核素标记的DNA探针滴在细胞涂片或组织切片上，43℃作用18h。经洗涤干燥后，涂核4乳胶，于4℃自显影，定影，Giemsa染色。计算镜下的银色颗粒数。也可用图像仪进行灰度分析，可定点、定量分析。
②地高辛标记DNA探针的原位杂交
方法与上述基本相同，只是探针不用核素标记该用地高辛标记，杂交后经洗涤再加入酶标记的抗地高辛抗体，作用20min洗涤，并用EDTA液终止反应，再加入相应底物显色，镜检。nullnullnull感谢您的浏览感谢您的浏览需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎:http://www.fantibody.com
fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台
需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网http://www.biomean.com进行咨询，期待您的加入
浙公网安备 33021202002483