【doc】异源四倍体鲫鲤雌雄差异的RAPD标记

【doc】异源四倍体鲫鲤雌雄差异的RAPD标记 异源四倍体鲫鲤雌雄差异的RAPD标记 第28卷第6期 2004年11月 水生生物 ACTAHYDR0B10L0GICASINICA Vo1.28,No.6 Nov.,2004 t,,,,1 ;研究简报; 异源四倍体鲫鲤雌雄差异的RAPD标记 李建中刘少军张轩杰刘筠 (湖南师范大学生命科学学院;蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室,长沙 410081) RAPD?RKERoFTHEDIFFERENCEBET,VEENTHEMALE ANDFEIALEOlFALLoTETRAPLoII)CRUCIAN.CARP LIJian-Zhong,LIUShao-Jun,ZHANGXuan-JieandLIUYun (CollegeofLifeScience,HunanNormalUnivers;KeyLabofnChemistry andDevelopmenta1日】=0如gy,l~nlstryofEducation,Changsha410081) 关键词:异源四倍体鲫鲤;RAPD;性别标记 Keywords:Allotetraploidcrucian-carp;RAPD;Sex-linkedmarker 中图分类号:Q319文献标识码:A文章编号:1000.3207(2004)06.0674.03 异源四倍体鲫鲤是从红鲫和湘江野鲤的杂交后代选育 出来的,已经形成了一个遗传性状稳定的四倍体鱼新种 群_1J.用异源四倍体鲫鲤(雄性)和二倍体白鲫(雌性)生 产的三倍体湘云鲫已经在全国推广应用.因此,如果能够了 解异源四倍体鲫鲤的性别分化机制,人为地控制异源四倍体 鲫鲤的性别分化,生产出大量的"超雄鱼",这对于三倍体湘 云鲫的产业化生产有重要的意义.刘少军等_3j对异源四倍 体鲫鲤的染色体组型进行了分析,并没有发现异源四倍体鲫 鲤有明显的特化的性染色体,这说明通过细胞遗传学研究异 源四倍体鲫鲤的性别遗传机制是有困难的. 寻找性别特异的DNA片段,作为性别决定遗传基础的 分子标记是一种简捷的鉴别方法.RAPD技术由于具有操作 简便,实验成本低,快速等优势,是研究性别特异性标记的一 种极其重要的工具[7-s].应用RAPD技术来寻找性别特异性 片段的研究工作在中华绒螯蟹,鸟类,鱼类已经有一些成功 的报道_9叫.而在国内虽然有不少学者应用RAPD技术来 寻找鱼类的性别标记_1,但是到目前为止,尚未见到成功 的报道.作者利用RAPD分子标记对雌雄异源四倍体鲫鲤 进行了研究,发现了一条与雄性有关的特异性标记.本研究 发现的雌雄差异的RAPD标记,为进一步探讨异源四倍体鲫 鲤的性别决定机制奠定了基础;同时,还可以作为分子遗传 标记,用于异源四倍体鲫鲤早期性别鉴定的研究. 1材料和方法 1.1实验材料异源四倍体鲫鲤取自于湖南师范大学国家 四倍体鱼种质资源保护基地,为红鲫和湘江野鲤的杂交后代 F1.,经染色体检测,其染色体均为4n=200.雌雄异源四倍体 鲫鲤各取10尾,均要达到性成熟.实验鱼取来以后,先从实 验鱼的尾静脉中取新鲜血液,作为基因组DNA抽提的实验 材料;然后解剖活鱼,查看性腺,确定异源四倍体鲫鲤的性 别,并做好标记. 1.2基因组DNA的提取,RAPD扩增及产物的检测雌雄 异源四倍体鲫鲤基因组DNA的提取和浓度,纯度及分子量 的检测以及RAPD反应体系,扩增条件和RAPD扩增产物的 检测同以前的报道_5J. 1.3引物的筛选采用120个随机引物(G,c含量一般为 60%一70%),以雌,雄性异源四倍体鲫鲤10个个体的DNA 分别等量混合构成的雌,雄性DNA池为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ,同时进行 RAPD扩增,筛选出重复性好,带型清晰明亮且雌,雄性DNA 池有差异的随机引物,对雌性和雄性异源四倍体鲫鲤群体的 每个个体进行RAPD扩增,验证这种差异是由雌雄性别差异 引起的还是由于异源四倍体鲫鲤的个体多态性引起的. 1.4目的片段的克隆和序列测定切下琼脂糖凝胶板上的 目的片段,用DNAGelPurification试剂盒(上海生物工程公 收稿日期:2003.12.29;修订日期:2004.02.12 基金项目:国家自然科学基金资助(30170733) 作者简介:李建中(1969一),男,湖南湘乡人;副教授,博士;主要从事鱼类生殖生理的 研究 通讯作者:刘筠(1929一),男,湖南武冈人;中国工程院院 士;E-mail:liuyun@hunnu.edu.CII 6期李建中等:异源四俯体鲫鲤雌雄差异的I~adJD标记 司)纯化回收PcR产物;纯化后的产物用pMD18一T载体进行 连叠反应.连接产物转化大肠杆菌DH5a的感受态细胞后,涂 布于含IP'T'G和X-gaI的选择平板卜,倒置培养过夜挑白 斑.纯化质粒,经s且lI,sI双酶切鉴定.并以质杖为模板 进行PcR扩增检测,将F'CR扩增获得阳性结果的重组质粒 送往上海生物工程公司测序: 2结果 2.1RAPD筛选 本实验共采用了120个随机引物,雌堆匪异源西倍 体鲫鲤DNA池为模板.同时进行RAPD扩增.其中能明显扩 增出DNA带的引物有【12个.在能够扩增出DNA条带的 bP 2】227 5148 2027 1584 947 564 675 112个随机引勘中.发现有l4个重复性好带型清晰明亮且 雌雄群体有差异.但用这些引物对雌雄各10个个体进行验 正时,除引物$129以外,均找不到雌雄个体的特征差异带 由于RAPD技术可以得副太量的个体多志性.用等量的混台 个体DNA掏建DNA池的方癌米筛选引物时,一些个体差异 会升为群体差异.这是造成这种群体差异能发现较多性别 差异的原固. 如图1昕示,引物SI29所扩增的DA条带在雎,雄眭异 源四倍体鲫鲤的个体之间具有明显的性别差异,10个雄性个 体都有一条片段大小约为56~1bp的特异带t白箭头所示).而 lO个雌性十津昔5没有这条带因此进条特异陛的DNA带可 以作为异源四倍体鲫鲤性别差异的分子标记 CA1目1物sl29刮雌lII?】,砖cI…10异狼吲竹博脚各1O个十体的扩增电图谱 ' Elects)philn…{f咖血H【i【l?IDNA,【uLfs_~m~ma/e(jl如 andI(I--IO)allotetraploidcmciamc~rpu~ingprimSI29 2.2测序结果及序列分析珊序结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 叫,浚片段生长 551bp(将设序列在GenBank上登录.登录号灯AY5l2656).其 中^T含量(533%)大于G.c古量(467%).在CBI同站 (hup://ncbimnihP0J上.利用BLZSq'分析软件对所 得序列进行查询.结果显示该序列与GenBankL噩记的其他 序列同源性均小于20%.这和8atazsKet日】在非制鲶 鱼中发现的两个雄眭RAPD标记与GenBank上登记的其他帛 列的同源性较低的结皋星一致的. 3讨论 大多数学者认为一,鲫鲤鱼类的睦jjIl决定类型属于 雌性异配型即XX—XY型一刘少军等通过雌棱发育的方溘, 得到了全雌的异源四倍体鲫鲤后代(XXXXj.表明异源四倍 体鲫鲤的性剐决定类型属于雌性同从乖实验的研究结 果来看.引物S129所扩增出来的雄性特异性片段由于在雌 性中空缺.所以该片段很有可能是与异配性别紧密庄锁的 DNA片段从丹子水平支特异源四倍体辫鲤的胜别决定机制 ).XXYY【)世,这与刘少军等的 为雄性异配型,即xll阜 研究结罘是一致的 如皋异谭四倍体鲫鲤的性别砍定类型足XXXX.(旱)一 XXYY-(J型,那么雄眭妊太可能产生三种比例分剐为xx: 4XY:YY的精于,但是XY的精于是否能产生?这种精于与 xx的卵子结合产生的XXXY个体是香能存活?这些问题现 在还足键情楚.如粜是Y染色体决定雄性的话.1椰幺 X)LXY个体血博是雌性,从理论上米说.异四倍体鲫鲤的后 代中雄l生应该多千雌性.但是从刘少军等随机柱删的结 果来看,3225尾异源四惜体鲫鲤中,雄性蛆有1020尾,而雌 性有2102尾.雌雄比例约为2:1即雌性远远多于雄性,这个 结果与Y染色件决定雄性似平有矛盾如『6J噼释这种现象 呢'怍者认为异源四倍体鲫鲤的性别礁迮还cj能与暂染色 悼有关.Hammemmn和Avtalkml【979提出鱼类的常染色体 别性别的决定起一定的作用,性别是由雄性和雌性的基困产 物数量优势柬宅的如果雄性决定目素超过雌性决定 素.则雄性比恻较高反之.雌眭决定圆素超过雄性决定固 素,则雌lF土E例较高过一理论是性嗣节基因定位于性 染色体cx,Y,W)和常染色伴lA.aj的假没为基础的故卫称 为"常染色体平衡理论"当然,异源四倍悼鲫鲤的常染色棒 是否存在睦别决定的因素还有待于今后连步的研究米证 实.. 本研究结阜表明,雌雄异源四倍体鲫鲤基因组中确实存 在差异.这一差异是否与两眭的形态,行为差异十日关,尚需要 进一步研究.许多工作,例如把这个雄性特异性的DNA片 段作为搛针进行souIhem杂交,进一步证实过个片段是否为 雄眭所特有;或者通过荧光原位杂交(FISH技术)把这个特异 性的片段定位在染色体上,进一步确定这个雄性特异性的 DNA片段是否与Y染色体紧密连锁等等.这些工作还有待于 676水生生物28卷 今后深入的研究. 参考文献: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] LiuY,ZhouGJ.CytologicalstudyonthegonadaldevelopmentofF1: hybridproducebycrossingCarassiusa~atll$L.(旱)withCyprinus carpio()[J].ActaHydrobiolSin,1986,10(2):lO1一l07[刘筠, 周工健.红鲫(旱)×湘江野鲤()杂交一代生殖腺的细胞学 研究.水生生物,1986,10(2):lOl—l07] LiuSJ,CaoYC,HeXX.eta1.Theforalationoftetraploidhybrids ofconunoncarpwithredcruclancarpandtheevdutionarysignificance oftetraploidizationinve~ebrme[J].Engineeringscience,2001,3 (12):33—4l[刘少军,曹运长,何晓晓,等.异源四倍体鲫鲤群 体的形成及四倍体化在脊椎动物中的作用.中国工程科学, 2001,3(12):33—41] LiuSI,UuY,ZhouGJ,eta/.Theformationoftetraploidstocksof redcruciancarp×conunoncarphybridsasaneffectofinterspecific hybridization[Jj.Aquaculture,2001.192:171—186 "JZ,ZhangXJ,UuSJ,eta1.Studiesonthegonadaldevelopment inanotetraploihybridsCarassiusaur~tusL.(旱)withCyprinuscarpio ()[J].ActaHydrobiolSin,2002,26(2):1l6一l22[李建中,张 轩杰,刘少军,等.异源四倍体鲫鲤的性腺发育[J].水生生物 ,2002,26(2):1l6一l22] UJZ,LuSQ,UusJ,eta1.RAPDanalysisofgeneticvariationbe 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