大豆根部内生放线菌的筛选、鉴定及其活性代谢产物研究

大豆根部内生放线菌的筛选、鉴定及其活性代谢产物研究 大豆根部内生放线菌的筛选、鉴定及其活性代谢产物研 究 : : : 。 : :. : :: : 目 录 目 录 摘要.. 英文摘要?.. 前言 .植物内生放线菌的研究进展. ..植物内生放线菌的生态重要性.. 。。植物内生放线菌的多样性??.. ..植物内生放线菌代谢产物研究.. .大豆内生菌的研究现状??. .大豆疫霉根腐病的研究进展. ..大豆疫霉根腐病的起源、分布与危害.. ..大豆疫霉的分类地位?.. ..大豆疫霉根腐病的病害症状?.. ..大豆疫霉的致病规律?.. ..大豆疫霉根腐病的防治措施及面临的问题.课题来源和研究内容及意义.. ..课题来源.. ..研究内容和意义.. 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 .试验材料??. ..植株样品? ..供试菌株? ..供试大豆品种?.. .试剂与仪器?.. ..试剂??.. ..仪器?。 .主要培养基及制备方法..分离培养基 ..纯化培养基??.. ..发酵培养基..生测培养基..生理生化测定培养基? ..形态特征观察培养基? .大豆根部内生放线菌的分离及纯化 ..取样及预处理? ..根组织中放线菌的分离及纯化 。新属、种放线菌的分类学鉴定??东北农业大学理学博士学位论文 ..形态和培养特征鉴定? ..生理生化特性鉴定..化学分类学鉴定. ..分子水平鉴定? .所筛选放线菌的抗大豆疫霉活性 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 ..筛选菌株的发酵培养? ..抗大豆疫霉活性检测? .放线菌?抗大豆疫霉活性代谢产物的分离及鉴定..菌体的发酵..抗大豆疫 霉活性代谢产物的分离纯化 ..活性化合物的结构鉴定. ..勃利霉素的活性评估? 结果与讨论 .大豆内生放线菌的分离及初步鉴定 .菌株.的多相分类学鉴定结果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ?. .. 序列测定及系统进化分析? ..形态及培养特征 ..生理生化特性? ..细胞化学组分分析结果.. ..特征性核苷酸分析结果 ..%定结果?. .菌株.的多相分类学鉴定结果与分析.. .. 序列测定及系统进化分析? ..形态及培养特征 ..生理生化特性?. ..细胞化学组分分析结果 ..%、狈定结果?一 .. 同源性分析结果? .菌株.的多相分类学鉴定结果与分析? .. 序列测定及系统进化分析? ..形态及培养特征 ..生理生化特性? ..细胞化学组分分析结果 ..%、狈定结果?. .. 同源性分析结果? .菌株.抗大豆疫霉活性评估结果 .抗大豆疫霉活性化合物的结构鉴定 .勃利霉素抗大豆疫霉活性测定结果与分析 目 录 ..体外活性实验结果..体内活性实验结果结论??. .本研究的主要结论? 。本研究的主要创新? 致谢 参考文献?., 附录??.. 攻读博士期间发表的学术论文?..??..?.?.?..??..??...??..??..?. ..??..?.? .?。? 。。 .... .. ....?.??.??..??.??.??,. ’??. .. ,??. ..?. ....?...?..??...?. ..?..?,,..? ..??.?. 。.,. . ..?.??. .?.??..?,. ....?... ...?...??,?。?。 .?.??..?....?. ...?..?... ...?..??..?..??.?.??..?. .. ?,,??...?, .. ..??. ...??. . ..??.?..?. ..?.??。.。.?..?.. 东北农业大学理学博士学位论文 ... ..??.. ..??. ..?...?. .。?.?。。??。??。?.. .. ..脚??.. . ?. .. ..?. ...... .??... ?. ... . .。。?. ..??.. .. ..??.... .. %??.. ..??. ... .... ..?. .. 。 %??。。..?.. ..??.. ..??....? ..??.. :;.. ..??. .. %??.. .... .?.. .尸砂。 砂 ...??. ...??.....??.. .??...??....??...?. .?..??.?.??...??..??..??......??..??.....?....??..??...??...??... ?..??..?...??..??..?.??..?....??.?.?. 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独 创 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得?????????? 篷麴逛查墓丝盏蔓签型壹塑丝奎拦互窒或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 . ,.厶 日期山膨年石月岁日 学位论文作者签名:泪乌 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授 权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本授权 书 学位论文作者签名: 日期:厶膨年,月日 汨墨 导师 导师 签名:弋刁之爿~ 签名:、可气爿~ 日期:山务;月岁曰 日期:幽饵月岁曰摘要 摘 要 大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉引起的全球性大豆病害。而在某些大豆疫霉发病的大田中 会发现在已发病的植株邻近会有健康成活的植株。这一现象是否与植物内生 放线菌协助植物 抗病有关因此本研究以这种健康大豆植株的根部作为分离对象,进行内生放线菌分离。对 己筛选的菌株进行新属、种鉴定及抗大豆疫霉活性评估,并利用活性追踪的方法对其活性代 谢产物进行了研究,结果如下: 从健康的大豆根部分离得到内生放线菌株,其中包括链霉菌属株,小单孢菌 属株,链孢囊菌属株,野野村氏菌属株和王氏放线菌属株。 利用多相性分类对菌株.进行分类学鉴定。 基因序列分析显示该 菌属于小单孢菌科。菌株细胞壁氨基酸为内消旋二氨基庚二酸,细胞水解糖为半乳 糖、核糖和葡萄糖,醌组主要为和一,磷酸类脂为磷脂酰胆碱和磷脂酰乙 , 醇胺,脂肪酸主要为:,: :,:,: ,.:,: 和】:, 基因组 %为.%。通过形态特征、化学分类学分析、系统分类学分析及 特征性核苷酸分析确定菌株.属于小单孢菌科的~个新属,命名为 ,保藏在中国科学院微生物研究所和德国不伦瑞克市德国菌种保藏中心 . 。 利用多相性分类对菌株进行分类学鉴定。 基因序列分析显示 .。%, 该菌属于链霉菌属。菌株.与..%, .%的 基因序列相似性最高, .%和 与链霉菌属的其它模式菌株的相似性均低于%。通过邻位连接法和最大似然 法将菌株 与同源性高的链霉菌菌株构建系统发育树,我们发现,两种方法得到的拓扑 结构 . 十分一致,菌株与 ,&括.‘及&形成独立分支,其所显示高的靴值支持了这个 分支。通过形态 特征、生理生化特性、系统分类学分析及杂交分析确定.属于链霉菌的一个 新种,命名为,保藏在中国科学院微生物研究所和德国不伦瑞克市德 . ’。 国菌种保藏中心 利用多相性分类对菌株.进行分类学鉴定。菌株.具有典型的链 %为.%。 基因序列分析显示 霉菌形态和化学分类学特征。基因组 ‘.%形成独立的分 该菌株与其相似性最高的 支,而杂交显示它们的基因组同源性只有.%。此外,菌株.可以与. ‘及其他相似性高的链霉菌菌株%以及产勃利霉素的其他 菌株在形态和生理生化特性上进行明显区分。通过形态特征、生理生化特性、 系统分类学分 析及杂交分析确定.属于链霉菌的一个新种,命名为 ,并保藏在在中国科学院微生物研究所,美国模式培养物集存库和德国不伦 .一。 瑞克市德国菌种保藏中心 体外活性评估实验显示,新种.具有极强的抗大豆疫霉活性。通过活性东北农业大学理学博士学位论文 、 追踪法对菌株.所产抗大豆疫霉活性化合物进行分离,并通过、、‘ 、.和.对活性化合物的结构进行表征,鉴定该活性化合物为勃利 霉素。在对勃利霉素抗大豆疫霉活性评估时,勃利霉素对大豆疫霉号生理小种的和 值分别为.和. ,该值比商品化的抗大豆疫霉药剂甲霜灵分别低了. 和.倍。研究者进一步对大豆疫霉生理小种进行活体内活性评估,在浓度为/时, 其对大豆疫霉的防效达到了.%,比在同样有效浓度时的%甲霜灵可湿性粉剂的防效要 高。以上研究说明了勃利霉素很有希望成为新一代大豆疫霉杀菌剂。 ; 关键词植物内生放线菌;勃利霉素; 括;多相分类学;大豆疫霉 , 尸 ,. ?, . . .. , . ?.. . , ,, . 。 . ?.? . ,.. . .一 ..:,: . ,:,: ,:,:,: :, %. , , ? ,, ..,... . 。 .一‘.%, , 东北农业大学理学博士学位论文 ‘.% .%, .%. , & .‘ . . . ? ., .... ...‘. . . %. ’ . %. ‘. 以 .%. . . . %, . .., ... . . .. ?, . . . 尸 , . . . / .. .. , ,..%/., 尸. ; : ;; ; ; ’; : : :. 刚 舌 前言 放线菌一直是天然活性物质的重要来源,目前约有%的微生物来源的生物活性物质是 由放线菌产生的。然而,由于长期在天然产物的筛选过程中使用传统的菌种分离和鉴定技术, 结果导致大量的产生已知活性物质的菌株被重复分离,严重地影响着新的生物活性物质的筛 选效率:一个新的抗生素的发现至少要分离千万株菌【’】。于是人们将目光投向栖息于特殊 生境的放线菌。特殊生境往往拥有具有特殊代谢途径的新型放线菌资源。新物种通常都会有 新的功能基因,而新基因又意味着新的天然产物【】。 .植物内生放线菌的研究进展 ..植物内生放线菌的生态重要性 年等【】和等【】分别在上报道了对拟南芥根部的微生物菌 群结构的研究。他们对来自于不同地域、不同土壤类型、不同基因型的拟南 芥根部进行 宏基因组测序,发现一个共同的现象:拟南芥根部的主要微生物菌群为变形 菌门 和放线菌门图.。 土壤 根际 根内 础。戳坼料 纠掣啦搿社世傩;;虹警笛笛芦譬?》 .一一‘誓;;;叠彳 博静?。搴蝌譬茹,. 删珏础 茹茹:? 舔?《酊鳓矗;;裔‘;:?鼙茹誓;毒 ?谢高;;;蔷?算;;;硝赫;;;;盈’ 岛?矿矿‖矿‖ 矿妒拶矿‖毽?扩矿毋矿矿 沁?白删科诵 船罐牟靠 蝻’鑫尊壤 糟心磅啊埔懈垃四毋口。蕾? 黼甜口;母母? 习确制燃 舯诵 .嚣轴鼬《蝴 舛跬烈船灞 图.土壤、根际及根内主要菌门的相对丰度酗】, .一 宏 等进一步对在同样培养条件下的无新陈代谢能力的两种木条进行 基因组测序,发现出现在拟南芥根部的变形菌门同样也存在于木条中,而 放线菌门却很少,说明了放线菌门会与拟南芥形成特异性互作图?。东北农业大学理学博士学位论文 囝 ,。。豢;爹 ?嚣冀 糍:岵 .懈叶 图.拟南芥根内特异微生物群【 :根内富集微生物群;:根内和木条中共有微生物群::木条内富 集微生物群。 : . ? ;:;: . 在比较土壤、根际及根内的菌群结构时,发现土壤和根际微生物种群结构、丰度相近, 而根内生菌种群明显减少,一些根际微生物不进入根内,但根内放线菌门的丰度明显高于土 壤和根际的。拟南芥根部对某些放线菌起到了筛选和富集的作用,如珊瑚放线菌属 在拟南芥根部的数量明显高于土壤、根际及木条中的图.。?。’‰ .‘。一羁 图.拟南芥根内特异放线菌属【】 .以上的发现也预示着植物内生放线菌对植物的生理和生态等方面具有重要作用。 ..植物内生放线菌的多样性 植物内生放线菌几乎存在于所有已研究过得植物中,分布广,种类多。弗兰克氏菌属 是最早被发现的植物内生放线菌。近年来,人们依据不同的研究目的和地方特色, 从大量的经济作物、药用植物或土著植物中分离到了大量的非弗兰克氏菌属的内生放线菌菌 株,这些菌株分布在放线菌目的不同属,其中链霉菌为目前分离得到最多的 植物内生放线菌,而其他稀有放线菌属的内生放线菌如:小单孢菌属、小 双孢菌属、诺克氏菌属、类诺卡氏菌属、链孢囊 菌属、假诺卡氏菌属、糖多孢菌属、 野野村氏菌属等几个属也陆续分离得到?训。 地球上的植物物种极为丰富,他们所生长的环境各不相同,其内部的微环境更是存在差 前言 异。因而,不难想象植物内生放线菌中蕴藏着大量未知的微生物物种。目前的研究也证实了 在内生放线菌资源中不断有新的分类单元被发现。自年以来,已发表鉴定非弗兰克氏菌 属的内生放线菌新属、种就达到了个,并呈现逐年上升趋势图?。这些发现充 分说 明了植物内生环境是发掘放线菌新物种资源的重要来源。 图 至今发表的新属、种植物内生放线菌数目. ..植物内生放线菌代谢产物研究 研究者们发现,特殊生态环境下的微生物与特殊次生代谢产物有着紧密的联系?。因此, 人们对新的或有活性的天然产物开发的注意力集中在分布于特殊生境的生物上。化石研究的 证据表明,植物与其内生菌间的共生关系早在高等植物出现在地球上的时候就己存在。植物 内生菌长期生活在植物体细胞内或细胞间隙的特殊环境中,并与宿主植物协同进化。这种紧 密的关系使得植物内生菌的生理遗传特性较之植物体外环境的微生物有所不同。植物内生菌 作为一类相对未开发的微生物资源,种类和数量庞大,分布的宿主植物范围广,所处的微生 态系统多样性极为丰富,加上宿主植物本身所处的生态环境多样性,不难想象它们也蕴含着 大量的新物种资源,而新物种通常都会有新的功能基因,而新基因又意味着新的天然产物。 目前在植物内生菌的代谓产物中发现了多种具有抗肿瘤、抗病毒、抗糖尿病 活性的化合 物以及多种农用和医用抗生素。在对植物内生放线菌的研究中也发现了许多具有抗肿瘤、抗 菌、杀虫、除草及植物生长促进活性的物质,其中有些具有新的化学结构。 ...杀虫、杀菌活性物质 研究小组从澳大利亚北部的一种有叶蕨类植物 中分离到 . ,它能产一种被称为的新型抗菌素,其对炭疽芽 孢杆菌、疟原虫有明显的抑杀活性【。等从蛇藤植物 妇中分离 、、、, ,它能产生四种新的广谱抗生素 到 . 对耐药性细菌及疟原虫有抑制作用【引。等从多种栽培和野生植物中分离到株放 线菌,其中.%的发酵产物对植物病原真菌和细菌有抗性,其中分离自韭菜 的一株链霉菌.的发酵提取物能抑制甘蓝链格孢菌东北农业大学理学博士学位论文 对中国卷心菜幼苗的感染【引。等从生长于秘鲁的蓬莱蕉中分离到一株链霉 菌,该菌株产生的新的多肽类抗生素,对植物病原真菌终极腐霉菌 、螺壳状丝囊霉菌 、樟疫霉菌 、新型隐球菌 及疟原虫具有抑制活性【。等从 卫矛科植物中分离到一株桑氏链霉菌 能产生一种新的 抗生素,对多种耐药性细菌和分支杆菌有很强的抑制作用【】。等从广西山的 红树植物 一产生新抗生素 木榄叶片分离到 ,具有非常好的抗真菌活性【。 ...抗肿瘤活性物质 年美国学者等首次从短叶紫杉 的树皮中分离出一株能产 这一发 生紫杉醇和其他紫杉烷类化合物的内生真菌安德紫杉菌 现为利用微生物发酵法生产紫杉醇,以解决紫杉醇药源危机提供了一共新途 径,并掀起了从 植物内生菌中分离抗肿瘤活性物质的热潮。等发现一些植物内生放线菌也能 够产生紫 杉烷类物质,它们分别属于北里孢菌属、小单孢菌属和 链霉菌属【 。鲁春华等发现一株云南美登木内生茵 .可产 生具有抗肿瘤活性的新多羟基环己烷衍生物【 。等从蓖麻 分离到一 株内生链霉菌 可产生对人乳癌细胞株具有细胞毒性的 ?中分离到对人类 和【。等从二株内生链霉菌 多种肿瘤细胞具有细胞毒性的 。年,等又从羽扇豆 疗淞分离到小单孢属的一个新种 可产生对结肠癌.细胞 和。 有抑制作用的两个新的蒽醌类化合物 ...植物生长促进剂 . , 从蕨类植物 分离得到内生链霉菌 、具有植物生长促进的功能,在浓度为时,能够促进芸豆下 其产生的 胚轴须根的形成制。等从冬季黑麦中分离得到几株内生链霉菌,其产生的 对冬季黑麦苗期的生长具有极大的促进作用【习。等从杜鹃花 .. 分离的 .一能明显缩短杜鹃花组织培养幼苗对温 度及潮湿环境的适应周期,推测其可能释放了促进植物生长的某种激素。 ...植物生长抑制剂 等从后穗狗尾草 分离的 .产生除莠菌 ,其产生的 素;从土脉苔草伽纵幻川卿分离到 . 在植物体内能够转换成强除草活性的蛋氨酸亚砜 ;从狗筋蔓属 植物中分离的能产生抑制甘蓝型油菜 萌发的植物生长抑制四。 前言 .大豆内生菌的研究现状 大豆是我国的一种传统的、重要的经济作物,具有较高的经济价值。目前对大豆内生菌 的研究主要集中在内生细菌和内生真菌,对内生放线菌的研究还未见报道。年,张淑梅 等从黑龙江省大豆品种合丰的根、茎、叶和种子中分离得到内生细菌株,其中的 株对大豆根腐病菌 ..具有较强抑制作用【引。王玉霞等从黑 龙江省不同地点采集大豆,从不同组织中分离得到内生细菌株,其中株对多种植物病 原真菌具有拮抗作用,初步鉴定这两株菌为芽孢杆菌 .【抄】。赵宇枢从大豆根瘤 中分离得到内生细菌株,其中费氏中华根瘤菌加和大豆慢 生根瘤菌 具有较强的杀线虫活性。周怡等从不同产 地不同品种的大豆种子中分离到株内生芽孢杆菌,其中巨大芽孢杆菌 对大豆植株具有促生作用【。韩祥东等从大豆根部筛选得到株内 生细菌,其中假单胞菌 .,芽孢杆菌 .、和对大 豆疫霉根腐病具有较强的抑制活性。郑丹丹等从大豆根瘤中分离得到内生细 菌株,其 中 和对病原真菌拮抗性较强 。等从不同生长阶段的大豆根、茎及叶中分离得到株内生细菌,它们分属于假 单胞菌属,芽孢杆菌属,肠杆菌属,克雷伯菌属 触凰抬妇,醋杆菌属,伯霍尔德杆菌属,根瘤菌属 和黄单胞菌属.年,等从健康的大豆叶片中得到个属的内 生真菌【。等从大豆茎部分离得到内生真菌,其中最有效的分离属为分支孢子菌属 ,链格孢属,和附球菌属【】。 .大豆疫霉根腐病的研究进展 ..大豆疫霉根腐病的起源、分布与危害 。该病 大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉 引起的大豆的毁灭性病害 于年首次在美国印第安纳州东北部发现,此后不断蔓延。现已广泛分布亚、非、欧、南 北美洲的近个国家的大豆主要产区。该病于年正式报导,年在美国发病面积约 。年世界大豆生产 有万公吲。据资料查证,该病已在美国的个州发生病害 居前位的国家因该病而损失.吨大豆?,年损失达到.吨,造成经济 损失.亿美元?。 由于分离技术上的原因,我国直到年才由沈崇尧首次在东北的大豆产区分离到大豆 疫霉,证实了该病在我国存在。随后多位研究人员在黑龙江、辽宁、吉林、内蒙古、新疆、 北京、安徽、山东、安徽、河南、江苏、浙江、福建等省市分离到了大豆疫霉列引。近年来, 在我国大豆主产区由大豆疫霉引起的根腐病发生范围逐渐扩大,年发生面积为万亩, 年为万亩,年达到万亩,平均每年以倍的速度扩展。仅在黑龙江省, 东北农业大学理学博士学位论文 年就有个县市和个国营农场发生该病,发病面积达万亩四。年黑龙江省 得个县和个国营农场的万亩大豆田出现该病害‘。大豆疫霉根腐病已成为黑龙江 省大豆生产上的严重病害。 ..大豆疫霉的分类地位 大豆疫霉属假菌界、卵菌门 、霜霉目、腐 目前采用的学名是 ,简称 霉科的疫霉属尸砂。 .. ..大豆疫霉根腐病的病害症状 大豆疫霉可以侵染任何生育阶段的大豆,包括幼苗出土前的烂种、烂苗和出 土后的幼苗 的猝死,造成幼苗断垄及成熟前的侵染,或植株矮化甚至枯萎死亡。一般苗期是大豆最易感 病的时期。苗期症状表现为近地表植株茎部出现水浸状病斑,渐变为褐色,细缩,子叶上出 现褐色略显凹陷的病斑。叶片开始也表现为水浸状病斑,后变黄萎蔫,叶柄下垂不脱落,感 病严重时猝倒死亡。成株期植株受感染后往往在分支基部发病,出现黑褐色病斑,并不同程 节位,茎的皮层及髓变褐色,中空易折断。 度地延至主茎和侧枝并向上扩展,可延伸至~ 发病植株下部叶片变黄,随后上部叶片逐渐变黄并很快萎蔫,根腐烂,根系极少;未死亡病 株荚数明显减少,空荚、瘪英较多,籽粒皱缩,豆荚基部初成水渍状,逐渐向端部扩展,致 使整个豆荚变褐干枯,空气湿度较大时,荚皮出现黑色霉层,此为腐生菌二次侵染。成株期 感病植株的病茎节位也有病荚产生,其症状为绿色,豆荚基部初期出现水渍状病斑,病斑逐 渐变褐并从夹柄向上蔓延至荚尖,最后整个豆荚变枯呈黄褐色,种子失水干瘪,种皮、肝和 子叶均可带菌,完全失去使用价值。这种症状一般成条或成块发病,很少单株 发病。 图.大豆疫霉的生活史循环 .? 前言 ..大豆疫霉的致病规律 大豆疫霉是土传卵菌,寄生性强,卵孢子在作物病残体和土壤内能存活多年,但菌丝、 游动孢子囊和游动孢子均不能在低温下?存活。在无寄主的情况下,卵孢子在土壤中能 存活数年。卵孢子萌发产生孢子囊及游动孢子的释放是导致病害发生的必要条件。对卵孢子 萌发的温度、土壤含水量及卵孢子萌发时间的研究结果表明,在土壤温度为 ?、土壤 含水量高于%时,大豆疫霉卵孢子就可以萌发。萌发的最适温度为?,最适土壤含水量 为%。在?条件下,卵孢子萌发所需要的最短时间为.~。国内外研究结果表明,土 壤温湿度是影响大豆疫霉根腐病发生的关键因素。在感病品种和耐病品种的根部和茎部可以 形成大量的卵孢子,当土壤绝对湿度为~.%之间时,发病率从%增至%,递 增趋势明显。土壤温度在?时,大豆疫霉根腐病的发病率从最低升至最高?。当春天 温湿度适宜时卵孢子打破休眠开始萌发,长出芽管发育成菌丝体和孢子囊,孢子囊在土壤中 不断形成、积累。当土壤中水分饱和时,孢子囊产生并释放出大量的游动孢子,通过土壤中 的水流传播到较远距离,成为初次侵染。游动孢子囊也可以在被侵染的大豆根表上形成,产 生再次侵染源。概括来讲,土壤含水量、感病品种和大豆疫霉生理小种的变化是决定大豆疫 霉根腐病发生的关键因子。大量降雨、黏重土壤、免耕地、平作、密植、重茬有利于大豆疫 霉根腐病的发生引。 ..大豆疫霉根腐病的防治措施及面』临的问题 作为一种土传病原菌,大豆疫霉可以危害各个生长期的大豆,因此大豆疫霉根腐病的防 治非常困难引。研究表明,利用抗、耐病品种是最为有效的方法,而且抗病品种可以完全控 制病害,但是,由于该病的病原菌和大豆品种间存在基因对基因的关系,而大豆疫霉菌具有 较高的变异性,新小种的出现速度很快,目前世界上己发现生理小种至少有个,我国 的黑龙江省也已发现了个生理小种,,所以品种的抗性不可能持续。生物防治是控制大 豆疫霉根腐病的一个重要途径,制剂是年引进的一种生物活性制剂,具有抗菌活性。 并具有化学免疫功能,可诱导植物产生抗病性,提高被害植株的抗病性。但是,生物防治制 剂研究进展缓慢,而且大田实验效果也不太理想。在化学防治方面,目前生产上使用最多的 防治大豆疫霉根腐病的化学药剂是甲霜灵,商品名为,但由于其作用位 点单一和多年的使用,现已产生了广泛的抗药性,部分地区该药剂甚至已失去了防治效果 】,因此开发新型的抗真菌剂在控制大豆疫霉根腐病上显得尤为重要。 .课题来源和研究内容及意义 ..课题来源 国家重点基础研究项目 ;国家杰出青年基金:国家自 东北农业大学理学博士学位论文 然基金;;黑龙江省自然基金:黑龙江省研究生创新基 . 金 ..研究内容和意义 新物种通常都会有新的功能基因,而新基因又意味着新的天然产物。植物内生放线菌作 为一类特境微生物,往往拥有具有特殊代谢途径的新型放线菌资源。此外,植物内生放线菌 在与宿主植物的协同进化过程中,其与宿主植物形成特性性互作,对植物的防病、抗病具有 重要意义。大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉引起的毁灭性病害,目前生产上使用最多的防治大 豆疫霉根腐病的化学药剂是甲霜灵,但由于其作用位点单一和多年的使用,现已产生了广泛 的抗药性,部分地区该药剂甚至已失去了防治效果,因此开发新型的抗大豆疫病药剂势在必 行。 本研究在大豆疫霉发病的地块,取邻近病变植株的健康植株根部作为放线菌的分离对象, 进行内生放线菌的分离。实验中得到分布在五个属的共株放线菌,其中包括一个小单孢菌 科的新属和两个链霉菌属的新种。在进行体外活性评估时,发现新种?的大豆疫霉 具有极强抗性。通过活性追踪法分离得到活性化合物勃利霉素,并对此化合物进行了活体外 和活体内抗大豆疫霉活性测定,结果显示该化合物是目前抗大豆疫霉活性最好的化合物。 材料与方法 材料与方法 .试验材料 ..植株样品 大豆植株样品采自巴彦县的四个大豆疫霉发病地块,取样原则是在大豆疫霉 发病植株邻 近的健康植株作为内生放线菌的分离源。 ..供试菌株 大豆疫霉病菌、、、、、、和号生理小种由东北农业 大学大豆研究所提供,所有菌株均保存于胡萝卜培养基。 ..供试大豆品种 合丰由东北农业大学大豆研究所提供。 .试剂与仪器 ..试剂 %甲霜灵原药温州鹿城农药厂;%甲霜灵可湿性粉剂河北双吉农化有限公司: 萘啶酮酸钠盐;放线菌酮;溶菌酶;蛋白酶:胰 聚 蛋白酶;.乙酰.,半胱氨酸:二氨基庚二酸: 合酶大连公司;胶回收试剂盒上海生物工程;分子: 高效薄层硅胶板烟台化工研究院;凝胶.上海安马西亚;树猖.日 本三菱;苯酚、乙酸乙酯、无水乙醇、氯仿、无水甲醇、丙酮等试剂均为分 析纯,色谱纯 甲醇购白迪马公司美国。 ..仪器 日本三洋 高压蒸汽灭菌锅 上海天能科技有限公司 凝胶成像仪 宁波新芝生物科技有限公司 ..超声波细胞破碎机高速冷冻离心机 东北农业大学理学博士学位论文 梯度仪 己 漩涡振荡器 美国 . 超净工作台 苏净集团安泰公司 电泳仪 北京智源通生物技术研究所 恒温恒湿培养箱 德国公司 摇床 高效液相色谱仪 美国安捷伦 美国 超高效液相色谱仪 美国 半制备高效液相色谱仪 .超纯水 美国公司 日本岛津 紫外可见分光光度计. 瑞士 旋转蒸发仪 美国 紫外光/可见光吸收光谱仪 美国公司 傅立叶变换红外光谱仪 瑞士 核磁共振仪. 质谱仪 美国 日立 紫外.可见分光光度计 美国 分析天平 .主要培养基及制备方法 ..分离培养基 .%, 腐植酸.%, .%,? .%,. .%,硫胺素.%,核黄素.%,肌醇.%,泛酸.%, .%, .%,烟酸.%,菌多糖 对氨基苯甲酸.%,生物素.%,维生素 .~.。 %, .~ .精氨酸.%,丙氨酸.%,丝氨酸.%,苏氨酸.%,菌多糖%, .。 :葡萄糖.%,半乳糖.%,木糖.%,阿拉伯糖.%,菌多糖‰ 。一。。 .~.。 :羧甲基纤维素钠.%,菌多糖%, .%, .%, 高氏一号培养基:可溶性淀粉%, .%, .~.。.%,。 .%,琼脂%, 材料与方法 。.纯化培养基 .%, .%, 高氏一号培养基:可溶性淀粉%, .%, .~.。 .%,.%,琼脂%, 燕麦片培养基:燕麦片加水煮分钟,然后用离心或过滤得澄清 .微量盐溶液:? 滤液并补足,微量盐溶液, .,? .,? .,蒸馏水。 ..发酵培养基 .~.。 种子培养基:酵母粉.‰麦芽浸粉‰葡萄糖.%, .%, 发酵培养基:可溶性淀粉%,黄豆饼粉.%,蛋白胨.%,葡萄糖%, .%, .%,’ .%,‘ .%,‘ .%, ’ %,? .。 ’ .%. ..生测培养基 胡萝卜琼脂培养基:榨汁,过滤,加入琼脂,加热至熔化,定容至。 ..生理生化测定培养基 .。 柴斯纳琼脂:蛋白胨%,柠檬酸铁.%, .%,琼脂.‰ ..。 明胶液化培养基:蛋白胨.‰葡萄糖‰明胶%, ., 淀粉水解培养基:可溶性淀粉%, .%, .%, ..。 .%,琼脂.%, 碘液制备:碘化钾.,碘片.,去离子水。 纤维素酶检测培养基:庐? .%, .%, .%, .%, ..,滤纸条×.。 唯一碳源利用培养基: ,%, .%, .%,? . .%,? %,。 .%,‘ .%,? . .,每种碳源用灭菌后,按糖醇类%/,其他.%/的比例加入到 , 培养基中。 .%, .%,. 唯一氮源利用培养基:葡萄糖.%,. .%, .,各种氮源用灭菌后,按.%/加入到培养基中。 .%, .%, .%, .%, .%, 硝酸盐还原培养基:? .%,溶液:对氨基苯磺酸.,醋酸%醋酸倍水稀释:溶液:二 。 苯胺.,蒸馏水。东北农业大学理学博士学位论文 格里斯氏试剂:液:对氨基苯磺酸。,稀醋酸%左右;液:苯胺., 蒸馏水,稀醋酸%左右。 浓硫酸中,再用蒸馏水稀释。 二苯胺试剂:将.二苯胺溶于 葡萄糖一酵母粉培养基:葡萄糖%,酵母粉%,? .%, .。 .%, 琼脂培养基:葡萄糖%,酵母浸膏.%,牛肉浸膏.%,酶水解酪素.%,琼 脂粉.%。 .。 七叶甘培养基:七叶甘.%,柠檬酸铁.%,蛋白胨%, .%, 马尿酸盐培养基:胰蛋白胨%,牛肉膏.%,酵母粉.%,葡萄糖.%,马尿酸钠 .%。 %, .%, 生物酸类物质培养基: .%, .%, .%, 生物酸类物质.%,琼脂.%,.%酚红溶液%。 ..形态特征观察培养基 .%。 微量盐溶液: .%,? .%,’ 麦芽浸粉一酵母膏琼脂培养基:酵母膏.%,葡萄糖.%,麦芽浸粉%,微量 盐溶 .~.。 液.,琼脂%, 燕麦琼脂培养基:燕麦片加水煮,然后用过滤得到滤液, .。 并补足,微量盐溶液.%, .‰ 无机盐淀粉琼脂培养基:可溶性淀粉】‰ .‰? .。 .%, .%,微量盐溶液.%, .%,微 甘油.天冬酰胺琼脂培养基:.天冬酰胺.%,甘油‰ .~.。 量元素溶液.%,琼脂%, .~ 蛋白胨.酵母粉铁琼脂粉培养基:蛋白胨铁琼脂粉.%,酵母粉.‰ .。 .‰硫代硫酸钠.%, 蛋白胨铁琼脂粉:? .‰ .%,琼脂.%。 柠檬酸铵铁.%, 酪氨酸琼脂培养基:甘油%,.天冬酰胺.%,一酪氨酸.%,.%, .~ .%, .%,微量元素.%,琼脂%, .%, 。 材料与方法 .大豆根部内生放线菌的分离及纯化 ..取样及预处理 在大豆疫霉发病的地块,取邻近病变植株的健康植株根部。将取回的样品室 温干燥, 然后超声波,.,禾创处理,用以去除表面泥土及附着细菌。然 后将超声波后的样品用灭菌滤纸吸去表殛水分,以备后用。 ..根组织中放线菌的分离及纯化 将预处理后的样品切成左右的小段,然后进行以下七步的表面消毒:用含放 线菌 和萘啶酮酸 的水溶液冲洗。用无菌水冲洗遍。用% 酮 冲洗。用,%冲洗。用%乙醇冲洗。无菌水冲洗遍。 %冲洗。将表面消毒后的样品放入烘箱。干燥。每样 品与水混合,用研钵研磨成水溶液,冰箱沉降.,将上清液涂布于含有放线 菌酮 。和萘啶酮酸 的分离培养基上,。培养周时,对早期长出的 放线菌转移到燕麦琼脂培养基上,然后继续培养至周,这期间不断对新长出 的放线菌进行 转移和记录。 .新属、种放线菌的分类学鉴定 ..形态和培养特征鉴定 ...形态特征鉴定 将待鉴定的菌株用培养基进行插片培养,培养 ,通过光学显微镜 定期取插片观察是否形成气生菌丝及孢子丝,孢子丝的形态,基内菌丝有无 断裂,有无孢囊或游动孢子产生。通过扫描电镜 观察孢子形态。 扫描电镜样品的制备方法; 取材:将样品用双面刀切成的小条; 固定:加入,%.戊二醛固定并置于冰箱牢固定,以上; 冲洗:用. .磷酸缓冲液冲洗两次,每次 脱水:分别用%、%、%乙醇进行脱水各一次,每次.;再用%醇 ; 脱水两次,每次, 置换:%乙醇:叔丁醇;纯叔丁醇加后放入烘箱中,各洗一次,每次; 用冷冻干燥仪对样品进行冷冻干燥,大约;东北农业大学理学博士学位论文 粘样:将样品观察面朝上,并用导电胶带将样品粘在扫描电镜样品台上: 镀膜:用一离子溅射镀膜仪将样品表面镀上一层约.的金 属膜金或铂膜; 将处理完的样品放入样品盒中待检。 ...培养特征鉴定 将待鉴定的菌株点接到 系歹培养基., 培养.周,记录菌株的培养状态气生菌丝及基内菌丝的颜色和生长状态以及是否有可溶 性色素产生。 ..生理生化特性鉴定】 ...碳源利用实验 其基础培养基是普戈二氏推荐的无碳源基础培养基。不同碳源按不同浓度糖醇类为%, 其他类为.%加入基础培养基。设溺性对照。 ...氮源利用实验 不同氮源按.%的浓度加入基础培养基。培养两周后,加每种氮源与不加氮源的基础培 养基的生长情况做比较。设阴性对照。 ... ,温度和耐受实验 这些实验均用琼脂培养基或培养基作为基础培养基。在或?培养. 记录结果。值耐受实验:值的选择?。温度耐受实验:温度的选择、。、、 ?、?、?、?。耐受实验:浓度选择/%、.%、%、%、%、 %、%、%。 ...淀粉水解实验 用来测定待测菌种产生淀粉酶的能力。将菌种点接于淀粉琼脂平板上,待菌种长好后, 在菌落边缘滴加碘液检测。如菌落周围遇到碘液形成透明圈,则该菌能够产生淀粉酶,圈的 大小表示该菌种产生淀粉酶强弱;如菌落周围遇碘时仍然呈现蓝色,则说明该菌种不产生淀 粉酶。 ...硫化氢产生实验 将待测菌种接秘于柴斯纳琼脂培养基上,在。恒温中培养左右视茵落生长成熟为 宜,若在菌落周围呈现黑褐色,表示试验结果为阳性反应。反之,不变色者为阴性反应。 ...纤维素水解实验 材料与方法 用来测定菌种产生纤维素酶的能力。将菌种接种到一半浸在无碳源合成培养基内的滤纸 条上,。恒温培养一个月后观察滤纸条是否被分解。 ...明胶液化实验 用来测定待测菌种产生蛋白酶的能力。将待测菌种接种于明胶液化检测培养基中, 恒温培养,分别在第、、观察。观察前应将菌种管置于。冰箱中约~。如 果菌落周围明胶表面呈现无凹陷且为稳定的凝块,则明胶水解为阴性;如果明胶凝块部分或 全部呈现可流动的液体,则明胶水解为阳性。 ...硝酸盐还原实验 用来测定待测菌种的硝酸盐还原能力。如果待测菌种能把培养基中的硝酸盐还原为亚硝 酸盐、氨或氮等,即当向培养液中加入格里氏试剂时,则溶液呈现粉红色、玫瑰红色、橙色 及棕色等。 操作步骤:将待测菌种接种于硝酸盐液体培养基中,培养和。取两支干净的 空试管或在白色瓷盘中加入少许培养和的培养液,再分别加入一滴液和液。在 对照管中同样/.液和液各一滴。滴入液和液后,若溶液变为粉红色、玫瑰红色、 橙色及棕色等,表示硝酸盐还原为阳性。如无红色出现,则可加~滴二苯胺试剂,若此时 呈现蓝色,则表示培养液中仍有硝酸盐而无亚硝酸盐存在,表示还原反应为阴性。若不呈现 蓝色,表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐都已被还原成其他物质,仍按阳性反应对待。 ...抗生素敏感性实验 本实验采用纸片法。将放线菌孢子悬液混匀涂布于生长培养基平板,同时用无菌镊子取 含抗生素的纸片于含菌平板,置。培养一周后,取出观察,出现抑菌圈者说明对该抗生素 敏感。 ..化学分类学鉴定 ...细胞壁氨基酸分析蚓 细胞壁氨基酸提取 %三氯乙酸,。煮沸: 称取冷冻干燥菌丝体,加入 离心弃上清,水洗两次,然后加.%胰蛋白酶磷酸盐缓冲液.; ?保温,离心弃上清,水洗两次; 加入. ?,?,离心取上清,用中和至中性; 微膜过滤,.。保存备用。 氨基酸衍生 试剂: :四硼酸钠溶于.水中东北农业大学理学博士学位论文 : 一乙酰一一半胱酰胺与邻苯二甲醛溶于.甲醇中 将、混合制成衍生试剂。 ~,将等量的或样品与衍生试剂混合。 ,一二氨基庚二酸 高效液相层析测定 用反相高效液相层析分析法进行细胞壁氨基酸的测定。高效液相层析仪为 ,反相高效液相柱为十八烷基硅烷×. ..,,流动相为乙腈:. .:溶液,流速为./,荧光检测波长,。 。磷酸盐缓冲液 ...全细胞水解糖分析【】 制版:把玻璃板洗干净,在研钵中按硅胶水:的比例充分混匀,每板 涂约成薄层,风干过夜,备用; 菌体制备:直接将培养好的菌丝体装入硬质安瓿管中,无水乙醇浸泡,弃去乙 醇, 倒置,晾干; 菌体水解:菌体加入. ~,封口,?水解,用于糖分析的水解液以 黄棕色为宜: 过滤:将水解后的菌体样品过滤: 点样:取用于糖分析的的水解液点样,标准品是同时含有%鼠李糖、木糖、核 糖、 甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖的混合液点样前将板活化,降至室温; 展层:用于全细胞水解糖分析的展层系统为乙酸乙酯:毗啶:冰乙酸:水:::. 厂: 显色:显色剂:苯胺. ‘,邻苯二甲酸.,水饱和正丁醇溶解; 喷雾:待展层结束后,将板放置。 烘干,喷雾。对照标准层析图谱仪记录结 果。 ...磷酸类脂分析【 抽提步骤 干菌体或湿菌体置于螺口离心管中 ?, .% 氯仿 振摇. 过滤,去残渣 .% 氯仿 上、下分层 收集下层 浓缩 材料与方法 用少量.氯仿:甲醇:溶解抽提物 转入样品瓶中,置于冰箱备用 硅胶板的制备:称取硅胶溶于含,%羧甲基纤维素溶液,置于摇床上进 行摇匀,放置过夜,用前再次摇匀。将的上述硅胶乳浊液倒在的玻璃板上, 然后用干净的玻璃棒将其涂成薄层或轻轻振荡玻璃板以使硅胶均匀地平铺 在板上,置于清洁 处,室温风干备用,使用前,在烘箱中活化。 展层系统:双向展层,第一次展层液为氯仿:甲醇:水::,?,第二次展层 为氯仿:乙酸:甲醇:水:::,/。 显色:展层完毕后,取出风干,并分区进行显色,与标准品对照确定样品中的 磷酸类 脂。 :试剂显色,不需加热,在黄色的背景上显现橘黄的斑点,对、、特异 性显色。 :试剂显色,需在~烘箱中加热~,和会与某些含有葡萄糖胺 未知结构的磷酸类脂显现红色,但不会与试剂反应。 :试剂显色,需在烘箱中加热~,此条件下显现黄绿色斑点为含糖 的磷酸类脂或,这些类脂的值会较小。 试剂显色,不需加热,所有的磷酸类脂和试剂均显现蓝色。 磷酸类脂显色剂的配制 试剂 %的冰乙酸中。 溶液:.次硝酸铋溶于 溶液:碘化钾溶于蒸馏水中。 向.溶液中依次加入冰乙酸、溶液和蒸馏水即为试剂。 试剂 将。茚三酮溶解于水饱和正丁醇中。 试剂 %乙醇,.茴香醛,浓硫酸,冰乙酸。 试剂 溶液:三氧化钼. 煮沸溶解于 中。 溶液:钼粉.溶于溶液中,煮沸,冷却后弃掉残渣。 将溶液与溶液进行混合,再加入蒸馏水制成试剂。 ...醌组分析【】 菌体收集制备 将待测菌种接于液体培养基中,培养~,离心收集菌丝体,用无菌水洗两次,然 后进行真空冷冻干燥。 东北农业大学理学博士学位论文 醌的提取及纯化 称取冻干菌体约,加入氯仿/甲醇:溶液,黑暗处磁力搅拌 左右: 在黑暗处用滤纸进行滤液收集: 用减压旋转蒸发仪。避光减压蒸馏滤液至干燥; 用少量氯仿/甲醇:,/重新溶解干燥物,以长条状点样在 硅胶板上; 以己烷亿醚:,/作展层剂进行展层约; 取出自然风干,在的紫外灯下观察。若.的位置在绿色荧光背景下呈 暗褐色的带即为甲基萘醌; 刮下.位置的硅胶带,用氯仿溶解,然后通过细菌滤器除去硅胶,收集滤 液,即得到甲基萘醌的氯仿溶液。放置于。冰箱中黑暗保存。 高效液相色谱分析 用反相高效液相色谱法进行甲基萘醌的测定。高效液相色谱仪为安捷伦,反 向 高效液相柱为十八烷基硅烷,流动相为乙腈/异丙醇:溶液,流速为/,柱 温为。,下紫外检测。 ...脂肪酸分析【】 脂肪酸的提取 分析所用的试剂有: 试剂皂化试剂:将溶解于甲醇及去离子水中,首先将水与 甲醇混合,然后在搅拌过程中加入,直至完全溶解。 试剂甲基化试剂: /盐酸,甲醇,在搅拌的过程中将盐酸加入甲 醇中。 试剂提取试剂:甲基正丁醚乙醚均匀混合,正己烷,在搅拌的过程中 将甲基正丁醚加入正丁烷中。 ,在搅拌过程中加入,直至颗粒完 试剂:去离子水,. 全溶解。 试剂:饱和溶液,加于重蒸水中。 脂肪酸的提取过程: 菌体收集:用接种铲从培养基表面刮取放线菌培养物约,置于螺玻璃管 中; 皂化:加入试剂,振荡~,拧紧螺盖,沸水浴约,取出振荡~,再拧 紧螺盖,继续沸水浴加热; 甲基化:待样品管冷却后,加入试剂,盖紧振荡~,随后精确控制在 ?水浴,在冰水浴中冷却。在此步骤中需严格控制时间和温度,以免环式脂 肪酸和羟基酸受到破坏; 提取:冷却的样品管,加入.试剂,缓慢振荡左右,加滴饱和的 材料与方法 溶液,弃下层水相; 碱洗:在剩余有机相中,加入试剂,缓慢振荡左右,加几滴饱和 溶液,吸取/上层有机相,置气相层析样品瓶中备用。 仪器分析方法 采用.分析法。 ...枝菌酸分析【】 全细胞甲基酯的提取 取冻干菌体 加入甲醇/甲苯/硫酸::,? 土 水浴过夜 加入石油醚并充分混合 /离心 取上层液过碳酸氢铵小柱预先用乙醚洗次 收集洗脱液于指形管中最后用乙醚进行洗脱 合并洗脱液,室温下真空干燥 甲基酯 制板:硅胶铺板,用前。活化; 展层剂配制:石油醚/丙酮:,?; 点样; 展层:双向展层; 显色:用碘熏蒸或%磷酸铝铵乙醇液喷雾现迹。 ..分子水平鉴定 ...放线菌基因组的提取【】 将待鉴定的放线菌转接于斜面培养基,待孢子或菌丝生长成熟后转接于相应 的液体 培养基中,置于。的培养箱中, /震荡培养~。离心收集菌丝体,用无菌水洗 涤次后保存于备用。 东北农业大学理学博士学位论文 重悬浮菌丝体在 缓冲液中,加溶菌酶溶液,。孵育~,溶菌 酶终浓度是/; 加蛋白酶缓冲液,混匀,加 %通过颠倒几次,蛋白酶终浓度是 ./,的终浓度为%,在?孵育: 加 ,颠倒混匀,冷却到?,的终浓度为.; 加氯仿,室温下颠倒混匀约; 离心,,在?: 移取上清到一个新的管中,加.倍体积异丙醇,颠倒混匀,后缠绕在玻璃 %乙醇冲洗,空干 棒上,用 重新溶解在 中,在?。 ... 的鉴定 的扩增【? 表. 筛选扩增体系. 使用量 试剂 上游引物 下游引物 聚合酶 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ,。吣。 去离子水 将提取的基因组作为模板进行扩增。正向引物为’广 .,,反向引物为’..’。扩增程序为:。预变性, 变性,‘复性,延伸.,个循环,最后?延伸。反应体 系见表.。 产物的电泳检测 电泳条件为:%的琼脂糖凝胶含 ./,电泳缓冲液,电压下运行 ,产物与?上样缓冲液混匀后点样,电泳结束后在紫外灯下观察结果。 产物的回收及测序 说明书进行,纯化后的产物 产物的回收按照 交由博仕生物测序。 的系统发育分析【. 产物测序后将序列提交至数据库, 应用 材料与方法 .软件进行手 ://.../网站进行序列相似性分析,随后用 动全局比对。最后将比对的序列文件通过 .软件进行建树使用 和.两种方法进行建树,把值设置为次重复。 ... 的%测定【】 以大肠埃希氏菌 为参比对照,操作步骤如下: 将待测样品用。×溶液稀释至值于。?.之间: 在波长首先记录?时的值,然后设定升温程序,从 开始到?,期 间每分钟升高?; 当值开始上升时,表示变性开始,此时,每隔?稳定,记录皿温度和 值,直至值不变,变性完毕; 以温度为横坐标,以为纵坐标作图,热变性曲线中点相对应的温度温度即为 熔炼 温度; 根据待测菌株和参比菌株的熔链温度,计算%含量。 在.×溶液中,脚的计算公式为: %撑车%.撑奉呱 %.% ... 同源性分析 采用液相复性速率法来测定.杂交‘。 样品的剪切 将待测样品用.调至为.左右,用.超声波细胞粉碎机剪切 样品,其输出功率为,以超声波剪切,间隔的模式剪切次,剪切完毕后将样品 反复颠倒几次混匀,再重复上述操作次。在剪切过程中样品应置于冰浴中。 避免超 声波剪切时产生的大量热量导致样品的降解。通过琼脂糖凝胶电泳检测样品 剪切质量, 一般要求片段大小集中在.约.。 同源性测定 变性 用沸水预热的缓冲液约.加入变性样本中,使终浓度为× 复性所需的离子强度,混匀,加塞。通过温度控制仪来控温,使样品在‘下 变性。 复性 将温控仪的温度改定为最适复性温度,. %,当变性样 品的温度迅速降至最适复性温度,稳定后开始复性反应,一般进行。计算机会 记 录下处吸光值随时间变化的复性反应曲线。并计算出该曲线的斜率,此斜率即为 样品的复性速率。 同源性计算 相似百分率一玉】/【××% 东北农业大学理学博士学位论文 式中,,分别为样本,的复性速率:为,混合样本的复性 速率。 .所筛选放线