【doc】硒化壳聚糖的制备及其硒含量测定的研究

【doc】硒化壳聚糖的制备及其硒含量测定的研究 硒化壳聚糖的制备及其硒含量测定的研究 2011年第8期中国饲料 亿震糖的利刍舆石含量定的研 浙江工业大学冯海周玲汤湛 【摘要1本文利用壳聚糖为反应物制备硒化壳聚糖并对其硒含量检测方法进行了改进,考察了温度,搅拌时间, pH值及提纯方法对制备硒化壳聚糖的影响,得到最优反应条件为反应温度35?,搅拌2h,pH=5,用70%乙醇作为 提纯试剂得到纯度较高,收率为78.6%的硒化壳聚糖.采用3,3'一二氨基联苯胺分光光度法来测定硒化壳聚糖中硒 的含量,省去了高氯酸消化步骤,简化了实验操作,经验证对结果显着影响,可作为快速简便地测定有机硒含量的方 法. 【关键词】壳聚糖;硒化壳聚糖;分光光度法;3,3'一二氨基联苯胺 【中图分类号】$816.17【文献标识码]A【文章编号】1004—3314(2011)08—0013—04 【Abstract1Chitosanwasusedforpreparationofseleno—ehitosan.rhedetemfinationmethodforthecontentofSeinse— leno—chitosanwasimproved,andthetemperature,stirringtime,pHandpurificationmethodonthei mpactofseleno—chi— tosanpreparationwereinspected.rheoptimalreactionconditionswereobtained:35oC,2h,p H5,with70%alcoholinthe purificationofhighpurityandtheyieldwas78.6%.With3.3'一diaminobenzidinespectrophotometryfordeterminationof seleniumcontentinseleno-chitosan,theneedforhighchlorineaciddigestionstepswereelimi nated,theexperimentalop— erationwassimplified,therewasnosignificanteffectontheresults.Themethodcouldbeused asthedeterminationof quickandeasymethodtodeterminethecontentoforganicselenium. [Keywords】chitosan;seleno—ehitosan;spectrophotometry;3,3'一diaminobenzidine 硒是生物体的必需微量元素.研究表明,硒对 动物抑制肿瘤,提高免疫能力及保护胰脏等均有 显着作用(Boosalis,2008,刘芳印,2008).长期以 来,在畜牧兽医实践中,主要使用的是无机硒制剂 亚硒酸钠,其毒性较大,治疗量和中毒量幅度很 小,使用不慎便会出现中毒,动物体残留超标.因 此,近年来关于有机硒制剂研制倍受关注.目前已 使用的有机硒营养添加剂有富硒酵母,但其硒含 量低(1000,1500ppm).制备工艺繁琐且生产成 本高(陈里等,2009),因此,有必要研制一种含硒 量较高,价格较为经济的有机硒作为饲料添加剂. 壳聚糖是由广泛存在于虾蟹等甲壳类动物的 外壳,乌贼等软体动物骨骼的天然高分子聚合物 甲壳素分子脱乙酰基后的产物,是自然界中可再 生,且生物相容性和降解性良好的天然氨基多糖, 由于壳聚糖结构中存在的N或O上可引入金属 离子或其他活性基团.被广泛应用于不同领域.本 研究利用壳聚糖为反应物与无机硒亚硒酸钠反 应.制备得到有机硒营养添加剂硒化壳聚糖作为 富硒酵母等的代替产品.此外,在有机硒的测定方 法上.目前较经典的有荧光光度法等(杜明等, 2007;杨雁玲,2007;王未肖等,2006),该法灵敏 度,精密度及准确度高,检出限低;但存在分析时 间长,操作繁琐等不足.本研究则采用3,3'一二氨 基联苯胺分光光度法测定有机晒含量,旨在建立 简单,快捷测定硒化壳聚糖中硒含量的方法. 1材料与方法 1.1材料与仪器供试壳聚糖(浙江澳兴生物科 技有限公司),亚硒酸钠,冰醋酸,硝酸,95%乙 醇,5%乙二胺四乙酸二钠溶液,0.5%3,3'一二 氨基联苯胺(现配现用),5%氢氧化钠溶液,盐 酸1:1.甲苯. 硒标准溶液:精确称取0.1000g硒标准品溶 解于2mL硝酸中,低温下加热溶解至蒸干,用1:1 盐酸溶解,定容至1L.使用时稀释至1p.g/mL. ALl04型电子分析天平(上海奔普仪器), pHS一25型数显酸度计(杭州雷磁分析仪器),JJ—l 增力电动力搅拌器(金坛市杰瑞尔电器有限公 中国饲料2011年第8期 司),DF一101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义 市子华仪器有限责任公司),DHC一9024型电热恒 温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司),752 型紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限 公司)等. 1.2测定原理李雅如等(1992)认为在微酸性 条件下,硒和3,3'一二氨基联苯胺作用,形成黄色 络合物.此络合物在中性溶液中,用甲苯等有机溶 剂提取,根据有机层显色程度.可进行分光光度法 测定.反应方程式: I-I,NNH2se:NN=Se wHz~-2一 之 1.3硒化壳聚糖的制备将1.0g壳聚糖置于 1%HAc100mL水溶液中,充分溶胀形成透明溶 液,在电动搅拌下,取0.4g亚硒酸钠溶于少量水 中,缓慢加人到壳聚糖溶液中,反应2h后,过滤 去除不溶物,加入70%乙醇,醇析过夜,抽滤,反 复冲洗,低温下烘干,粉碎,即得硒化壳聚糖. 1.4样品硒化壳聚糖的处理及测定 1.4.1硒标准曲线的制作准确吸取0.0,1.0, 2.0,4.0,6.0,8.0mL的硒标准溶液(1.0~g/mL),分 别置于125mL分液漏斗中,加水定容至25mL, 分别加入5%EDTA一2Na溶液1mL,用l:1HCI 调节溶液至pH2,3,再加入0.5%3,3'一二氨 基联苯胺溶液4mL,摇匀,置暗处20min后,用 10%NaOH溶液调节至中性.加入10mL甲苯振 荡2min,静置分层,弃水层,甲苯层用1am比色 皿于420nm处测其吸光值. 1.4.2样品的处理及测定准确称取0.05g样品 溶于2mL浓硝酸,在油浴中加热(控制温度160, 180oC)消化,至样品完全溶解,溶液呈澄清,停止 加热并冷却至70?,加入1:1HC1,定容4mL后 备用. 准确移取上述备用溶液0.5mL,定容至 25mL后.取4mL定容至25mL并转入125mL 分液漏斗中,此时若有白色沉淀物(可能是硅胶) 应过滤,以下操作同标准系列.根据样品溶液测得 的吸光值,结合硒标准曲线查找,计算相应的硒含 量. 2结果与分析 2.1硒化壳聚糖红外光谱分析壳聚糖和壳聚 糖硒用KBr压片进行红外光谱测定,结果见图l, 2.由图可得,亚硒酸根主要连接在C2的氨基上和 C的羟基上,可由以下的光谱图形和光谱数据变 化得到证明:壳聚糖吸附亚硒酸根后,壳聚糖分子 中羟基(-OH)的伸缩振动吸收峰由3427.3cm移 至3425.8cm,.但是强度没有变化,羟基的变角振 动吸收峰由1086.1em.移至1078.5cm,壳聚糖 C的氨基硒化后,氨基一NH的弯曲振动由1596.7 cm变为1559.4cm-.说明壳聚糖中的氨基与亚硒 酸根发生了明显的络合反应.壳聚糖C:位氨基上 未脱干净的乙酰基的羰基振动峰为1652.6cm, 而硒化壳聚糖C:位上未脱干净的乙酰基的羰基振 动峰为1636.9cm,,可能是受到C6位的羟基上亚 硒酸基的影响;同样由于硒化壳聚糖C位氨基上 和C位羟基上亚硒酸根的影响,壳聚糖C—O伸缩 振动峰由1086.1cm变为1078.5cnl.同时,在 806.9C1TI一1处观察到有亚硒酸酯中Se=O双键的振 动峰.上述红外分析结果表明:壳聚糖与亚硒酸钠 可能是通过C位上的酯化反应和C位上氨基的 螯合作用得到硒化壳聚糖. 波数,cm 图1壳聚糖的红外光谱图 波数,cm 图2壳聚糖硒的红外光谱图 2.2乙醇含量对硒化壳聚糖收率的影响在硒 化壳聚糖的醇析过程中,考察了乙醇含量对产品 收率的影响,由图3可知低含量的提纯试剂乙醇 溶液得到硒化壳聚糖的收率较低,随乙醇含量的 2011年第8期中国饲料 增加硒化壳聚糖的收率随之增大,当乙醇含量增 加到一定程度时,曲线趋于平稳,即对收率无明显 影响.研究表明用7O%乙醇作为分离有机硒的提 纯试剂,可得到硒化壳聚糖的最优收率为 78.6%. 100 80 墅6o 冀 蓑 z. O u20406080IO0 乙醇纯度/% 图3提纯试剂中乙醇纯度 对硒化壳聚糖收率的影响 2.3硒标准曲线及硒含量硒标准曲线的回归 方程:以吸光度对硒含量绘制标准曲线,得y= 10899X+0.0168,相关系数RL0.9990,精度符合要 求.由硒标准曲线计算得硒含量,见表1. 表1标准曲线得硒含量值 序号硒含~/(mg/g) 1 2 3 6_37 6.35 6_39 平均值 标准偏差 6-37 0.O2 2.4与仪器ICP-MS测定硒含量的对比为进 一 步验证改检测方法的准确性,结合Jitmanee (2007)采用ICP—MS测定的硒化壳聚糖中硒含 量.仪器生产厂家:美国PerkinElmer公司;型号: ElanDRC—e:检测条件:射频功率为1000W,等离 子气体流量为15L/min,辅助气流量为1.2L/min, 雾化气体流量为0.95L/rain.ICP—MS测定得到硒 含量6.34mg/g.与本研究采用3,3'一二氨基联苯 胺分光光度法来测定相比.两者的相对偏差仅 0.47%,说明本研究所采用的硒含量测定方法具 有较好的准确性,同时省去经典测定方法如荧光 光度法等(杜明等,2007;杨雁玲,2007;申金山和 李献锐,2007;王未肖等,2006)中特殊试剂和仪器 的使用.降低了检测成本,具有操作简单,测定结 果精确等优点. 2.5高氯酸对硒含量测定的影响测定过程中 高氯酸的加入是为使样品完全溶解,溶液澄清(李 雅如等,1992).本研究考察了样品消化反应中高 氯酸对硒含量测定的影响,即在相同的操作条件 下,采取加入高氯酸和不加高氯酸进行两组对比 实验.结果表明:高氯酸的使用与否对硒化壳聚糖 中硒含量的测定结果没有显着影响,得到硒含量 都为6.37mg/g. 2.6掩蔽剂EDTA一2Na对硒含量测定的影响 硒化壳聚糖可能存在铜,锌,镁,铁等离子,对测 定结果可能产生干扰,因此对分析过程中掩蔽剂 的加入与否进行试验.由表2可知不加掩蔽剂的 样品测定的结果明显高于加入掩蔽剂的,研究表 明硒化壳聚糖中含有杂离子会影响硒含量的测 定 表2掩蔽剂量对 硒化壳聚糖硒含量测定的影响 EDTAJJllJkN/mL硒含量/(mg/g)ICP—MS得硒含]~/(mg/g) O7387.167.476.34 16-376-356.39 实验进一步研究了不同掩蔽剂加入量对硒含 量测定的影响,由图4得到一定量的掩蔽剂能消除 杂离子对硒化壳聚糖中硒含量测定的干扰影响,随 掩蔽剂量的增加其吸光度值趋于平稳,且1mL的 5%EDTA溶液就能达到理想的掩蔽效果. 图4不同量掩蔽剂对吸光度的影响 2.7还原剂HC1对硒含量测定的影响硒化壳 聚糖在消化过程中,部分硒可能会被氧化成正六 价,而Se不能和3,3'一二氨基联苯胺络合,故在 样品消化液中加入HC1使被氧化成Se+还原为 Se4+.采取加入HCl和不加HCl进行两组对比试 验.由表3可知.加入1:1HCl2mL后硒化壳聚 糖的硒含量明显高于不加HCl的.研究表明在消 化过程中,硒化壳聚糖中的硒有部分被氧化成正 六价态,且加入一定量的还原剂HC1可明显减少 硒含量的测定误差. 一 l6一中国饲料2011年第8期 表3还原剂HC1量对 硒化壳聚糖硒含量测定的影响 3结论 本研究改进了孔涛等(2007)中硒化壳聚糖的 合成方法.进一步考察了提纯试剂中乙醇含量对 硒化壳聚糖收率的影响.制备了含硒量可达 6370ppm的硒化壳聚糖,可代替价格较高的有机 硒营养添加剂富硒酵母,在经济方面较合理,且能 更好地满足饲养动物对有机硒的需要,避免了无 机硒可能产生的毒副作用.另外,本文采用3,3'一 二氨基联苯胺分光光度法来测定硒化壳聚糖中硒 的含量.省去了原有的高氯酸的消化步骤.简化了 实验操作,通过加入还原剂和螯合剂来稳定试样, 可准确,快速地测定硒化壳聚糖中的硒含量. 参考文献 [11陈里,詹逸舒,昊永尧.富硒酵母培养条件的优化?】湖南农业大学, 2009,35(3):237,241 【2]杜明,赵镭,赵光华,等.生物样品中徽量硒删定方法的进展明.理化检 验一化学分册,2007,43(9):797,802. 『3】孔涛,曲.韵笙,朱逢勤,等.壳聚糖硒的合成及其理化性质D】,安般农业科 学,2007,35(1):21 [41李雅如,朱建育,金慧君.光度法测定烟革中微量硒?】.烟革科技, 1992,2:24,26. 【5J刘芳印.硒的生物酶与抑癌机制研究进展?】右江医学杂志,2008,36 (5):15,17. 申金山,孛献锐.液相化学发光法洲定微量硒叩.分析化学.2000,31 (11):1410,1412 【7】王未肖,段惠敏,李景印,等.硒的分析方法?】.理化检验(化学分册), 2006,42(6):505,508. 【8】柄雁玲.微波消解DAN荧光法测定测定饲料中的饭量硒叨.中国饲料, 2007,18(9):35,37. 『9]BoosalisMG.TheroleofseleniuminchronicdiseaseIJ].NutrClinPmct, 2008,23(2):152—160. 【lO]JimaaneeK,TeshimaN,SakaiT,et.DRCICP—MScoupledwith automatedflowinjectionsystemwithanionexchangeminicolumnsfordeter- minadonofseleniumcompoundsinwatersamples?】.Talanta,2007,73:352 357. 『通讯地址:杭州市下城区潮王路18号浙江 工业大学朝晖校区,邮编:310014] 4.有较强的文字功底,能撰写一定 质量的科研学术文章,提升和树立 产品品牌及公司形象. 4.思维敏捷,头脑灵活,吃苦耐劳, 表达能力和沟通能力强.有较强的 团队合作意识. 以上销售工作经验者,有自己的销 售渠道和客户资源. 6.能够配合公司需要出差. 待遇:薪酬丰厚,具体面议. 只要你布力,中雇颖泰是你施展力智的理搀平台. 毫|姆暗巍:豫蝴@26.?m鼍毪跃畚亩式毽翰融眄辏吼6j公飘姑lp时w威0