[最新]正交法研究光合细菌的混杂造就

[最新]正交法研究光合细菌的混杂造就 微生态制剂培养技术—正交法研究光合细菌的混合培养 摘 要 利用光合细菌和蜡样芽孢杆菌协同生长的特点进行混菌培养试验。蜡样芽孢杆菌好氧， 光合细菌兼性厌氧，通过两种细菌的不同添加比例，寻找一种最好的添加比例，使光合细菌活菌数在最短的时间内达到最大值。试验过程中，采用正交试验对两种菌的比例进行了科学的组合，从而找到两种菌的最佳配比:在光合细菌 1%或 5%、芽孢杆菌 1%的添加量的情况下，可以在最短的时间内使光合细菌菌数达到理想值。 关键词 光合细菌;混菌培养;正交法 近年来, 随着生活水平的提高, 人们对畜禽产品 质量的要求越来越高, 绿色食品越来越受到消费者的 青睐。因光合细菌营养丰富, 提高畜禽免疫力方面效 果显著, 而且在水产养殖方面, 能净化水质, 提供一部 分活性氧, 所以很多研究者对其尤为重视 [1-3] 。但因为 光合细菌培养周期长, 菌数很难达到人们要求, 所以, 研究者采用各种 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 进行了光合细菌混菌培养试验 的研究。Giraud E Z 和 Fleischman D(2004)研究发现, 当光合细菌与根瘤菌共同培养时,可增强根瘤菌抗干 扰能力, 储藏的时间更长,在豆科植物上能形成更有 效的根瘤,从而增加植物的产量 [4] 。李勤生等(1998)采 用光合细菌不同菌株、光合细菌菌株与异养菌株混合 培养, 试验结果发现, 不同组合的混合培养物其生长 量均不同程度的高于单株培养物, 最高增长量高达 17.4%,最低也高于对照组 [5] 。 本试验是在光合细菌单菌培养的基础上, 进行了光 合细菌和芽孢杆菌的混菌培养, 目的就是提高光合细菌 的生长速度, 缩短培养周期, 增加光合细菌的活菌数。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种 光合细菌(9.0×10 8 CFU/ml)和蜡样芽孢杆菌(1.0× 10 9 CFU/ml)均由本实验室分离、筛选、鉴定、保存。 1.1.2 培养基 1.1.2.1 光合细菌富集培养基 乙酸钠 3.0 g、丙酸钠 0.3 g、NaCl 1.0 g、(NH 4 ) 2 SO 4 0.3 g、MgSO 4 0.2 g、KH 2 PO 4 0.5 g、K 2 HSO 4 0.3 g、CaCl 2 50 mg、MnSO 4 2.5 mg、FeSO 4 5 mg、酵母膏 0.l g、蛋白胨 10 mg、谷氨酸 0.2 mg、H 2 O 1 000 ml, 将以上组分溶于水 后调 pH 值为 7.4, 然后在 121.0 ?蒸汽灭菌 30 min。 1.1.2.2 芽孢杆菌肉汤培养 牛肉膏 5.0g、蛋白胨 10.0 g、NaCl 5.0 g、H 2 O1 000 ml, pH 值 7.4,7.6, 121.0 ?下蒸汽灭菌 30 min。 1.1.2.3 芽孢杆菌平板普通培养基 在肉汤培养基的基础之上, 加入琼脂 1.0%,121.0 ? 下蒸汽灭菌 30 min。 1.1.2.4 光合细菌计数培养基 NaHCO 3 1.0 g、CH 3 COONa 3.0 g、 酵 母 膏 2.0 g、 K 2 HPO 4 0.5 g、Fe-EDTA0.005 g、NH 4 Cl 1.0 g、MgCl 2 ?6H 2 O 0.2 g、NaCl 5.0 g、H 2 O 1 000 ml, pH 值 7.4,7.6、121.0 ? 下蒸汽灭菌 30 min。 1.1.3 仪器 微量加样器、平板、1 ml 移液管、漩涡振荡器、试 管等。 1.2 培养方式和条件 1.2.1 蜡样芽孢杆菌摇床培养 用接种环刮取斜面保存的蜡样芽孢杆菌, 平板划 线, 进行活化, 37 ?培养 24 h。使用灭菌的 250 ml 三 角瓶装芽孢杆菌肉汤培养基 30,40 ml, 从平板上刮取 菌落, 接种到肉汤培养基上, 37 ?、130 r/min 摇床培 养 24 h。 1.2.2 光合细菌富集培养 [6] 使用光合细菌富集培养基, 在温度 28?, 光照 60W, 光源距离培养物 10,20 cm, 光照强度大约在 600, 1 900 LX之间。选择 1 000 ml 的三角瓶, 装入 1 000 ml 光合细菌富集培养基, 按不同比例接菌, 使用封口膜 封口, 然后光照培养 6,8 d, 观察颜色变化。颜色黑红 色时保存, 供混菌培养使用。 试 验 研 究 《 饲料工业》?2007 年第 28 卷第 4 期 311.2.3 光合细菌和蜡样芽孢杆菌混合培养 光合细菌富集培养基分装于消毒后的 200 ml 三 角瓶中, 接种时采用光合细菌与蜡样芽孢杆菌同时接 种, 其中光合细菌 1%、5%、10%、20% 4 个水平, 而蜡 样芽孢杆菌采用 0.1%、0.5%、1%、2% 4 个水平, 用正 交组合法接种, 然后按光合细菌富集培养条件进行光 照培养。每隔 24 h 采样一次, 进行光合细菌计数培 养, 连续采样 8 d, 每天计数培养一次。 1.2.4 细菌计数培养 1.2.4.1 菌液稀释 采用常规方法对菌液稀释,即用移液管 0.5 ml 菌 液移于盛有 4.5 ml 无菌水的试管中, 漩涡振荡 5 次, 每次 10 s, 以此类推,将菌液稀释至 10 -6 、10 -7 、10 -8 。 1.2.4.2 光合细菌计数培养 用 1 ml 移液管取不同稀释度 (一般为 10 -6 、10 -7 、 10 -8 )和不同接种比例的混合培养后的菌液 1 ml, 加到 灭菌的平板上, 然后加 20 ml 灭菌的(45?1) ?光合细 琼脂含量 0.8%, 摇匀; 培养基冷凝后 菌计数培养基, 上层加 5 ml 灭菌的(45?1) ? 1.0%的琼脂, 冷却后置 25,30 ?,2 000,3 000 LX 下培养 48 h, 如果菌落不明 显, 则继续培养 24,48 h。 1.2.4.3 蜡样芽孢杆菌计数培养 用微量加样器取不同稀释度(一般为 10 -1 、10 -2 、10 -3 、 10 -4 ) 的混合培养菌液 20 μl, 同一稀释度在芽孢杆菌 平板普通培养基上重复点样 3 次, 37 ?培养, 12 h 后 观察计数。 1.3 分析方法 1.3.1 光合细菌的计数方法 [7-9] 一般采用双层培养基, 上层是 1%的琼脂, 底层是 0.8%的琼脂。这种方法既解决了试管计数过程中出现 的重复多次计数的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 , 使计数在同一平面进行, 计 数更准确, 而且上层 1%的琼脂和底层 0.8%的琼脂在 不影响光合细菌生长的情况下, 不但解决了光照问题, 还解决了琼脂渗水的问题。 1.3.2 正交试验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 [10] 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1 为正交试验设计 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 。正交法进行组合L 16 (2 4 )。 项目 光合细菌 蜡样芽孢杆菌 1 1 0.1 2 1 0.5 3 1 1 4 1 2 5 5 0.1 6 5 0.5 7 5 1 8 5 2 10 10 0.5 9 10 0.1 11 10 1 12 10 2 13 20 0.1 14 20 0.5 15 20 1 16 20 2 表 1 正交试验因素与水平设计( %) 注:Maxn 表示在第 n 天光合细菌菌数达到最大值;Means 表示整个培养过程中, 同一个处理 选取的两个菌数最多时的平均值; 第 1 d 和第 4 d 光合细菌菌数未有最大值。 表 2 L 16 ( 2 4 )正交试验结果 处理组 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 K1 K2 K3 K4 R 光合细菌 接种比例(%) 1 1 1 1 5 5 5 5 10 10 10 10 20 20 20 20 400.58 380.25 186.25 197.25 214.33 蜡样芽孢杆菌 接种比例(%) 0.10 0.50 1 2 0.10 0.50 1 2 0.10 0.50 1 2 0.10 0.50 1 2 244.08 251.5 350.25 318.5 106.17 Max2 (10 7 CFU/ml) 41 41 57 52.5 46 50 Max3 (10 7 CFU/ml) 42 43 43 37 47 57 58 Max5 (10 7 CFU/ml) 64.5 150 77.5 54.5 47 Max6 (10 7 CFU/ml) 117 90 79 51 Max7 (10 7 CFU/ml) 82.5 72.5 130 85 97.5 82.5 Max8 (10 7 CFU/ml) 77 114 78 87 Means (10 7 CFU/ml) 73.5 74.75 122 133.5 87.5 87.75 84.25 78.25 41.5 42 50 52.75 44.75 47 51.5 54 2 结果(见表 2) 2.1 光合细菌计数培养基中的形态观察 光合细菌的典型特征是菌落呈粉红色、红色、红 褐色或深红色,在计数培养基中菌落呈铁饼状。 试 验 研 究 曹希亮等:微生态制剂培养技术———正交法研究光合细菌的混合培养 322.2 光合细菌正交试验 从表 2 极差分析可以看出, 光合细菌 K1 和 K2 的值都明显大于 K3 和 K4 的值, 即光合细菌在 1%和 5%的两个水平上, 细菌计数明显高于其它两组; 而芽 孢杆菌的 K3 和 K4 明显大于 K1 和 K2, 即芽孢杆菌 1%和 2%的接种量, 效果比其它两组更好。而光合细 菌和芽孢杆菌的极差分析表明, 光合细菌的 R= 214.33, 明显高于芽孢杆菌的 R=106.17, 从而得出如 下结论, 光合细菌的接种量对光合细菌的总菌数的影 响高于芽孢杆菌的接种量对光合细菌总菌数的影响。 2.3 蜡样芽孢杆菌菌数变化 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 蜡1 2 3 4 5 6 7 样 芽 孢 杆 菌 数 ( 1 0 6 C F U m l ) 时间(d) 图 1 蜡样芽孢杆菌培养的动态方差分析研究 图 1 通过 SPSS13.0 对蜡样芽孢杆菌的菌数变化 进行了方差分析。我们发现, 蜡样芽孢杆菌菌数第 1 d 接种后, 第 2 d 达到最大值, 第 3 d 迅速下降, 以后几 天, 蜡样芽孢杆菌的数量没有明显的变化, 这可能是 因为蜡样芽孢杆菌开始形成芽孢, 进入了休眠状态。 3 讨论 表 2 的结果说明光合细菌的添加比例 1%和 5% 的时候, 光合细菌菌数高于 10%和 20%的接种量。而 10%和 20%的接种量, 最大值出现在第 2 d 或第 3 d (Max2 或 Max3)。虽然 10%和 20%的接种量生长速度增 快, 但是, 由于菌数太低, 效果不好。综合考虑, 从表 2 中发现, 芽孢杆菌 1%的生长效果好一些。添加了芽孢 杆菌由于该培养基营养含量太低, 芽孢杆菌很快就处 于休眠状态如图 1。所以对光合细菌的生长来说因为 芽孢杆菌消耗一部分氧气, 给光合细菌创造了一个有 利于生存的厌氧环境, 所以有利于光合细菌的生长。 在该试验中, 光合细菌的添加比例 1%和 5%的时 候, 光合细菌总数可以达到 10 9 CFU/ml 左右, 明显高于 10%和 20%两个水平。并且光合细菌的添加对光合细 菌总数的增加的影响, 明显高于芽孢杆菌的影响。 从试验结果可以看出, 不管是生长速度还是菌 数, 都没有达到一个理想的值, 即菌数达到最大值的 情况下, 培养速度也提高了, 降低培养时间的情形并 没有出现。究其原因, 可能是因为所使用的分离培养 基里所含的酵母膏太少, 又加入了芽孢杆菌, 所以营 养成分消耗殆尽。说明光合细菌虽然利用很少的营养 成分, 但是仍然需要一定的营养。再有一种可能就是, 刚开始, 芽孢杆菌没有充分给光合细菌创造一个完全 的厌氧环境, 所以, 当光合细菌的加入量比较大时, 很 快就进入了衰退期, 而光合细菌加入量较少的情况 下, 芽孢杆菌充分给光合细菌创造了厌氧环境, 光合 细菌的菌数达到了最大。但是, 因为加入的营养成分 太少, 所以光合细菌生长的速度比较慢。为了达到一 个最佳的效果, 应该优化培养基, 加入一定量的酵母 膏等营养成分, 为芽孢杆菌创造一个增殖的环境, 同 时为光合细菌创造一个更好的厌氧环境, 使光合细菌 生长速度更快。加入一定的营养成分对光合细菌生长 很重要, 大多数营养都被芽孢所利用, 但剩余少量的 营养成分可以促进光合细菌的生长, 可以在更短的时 间内达到更大的产量。所以, 在光合细菌的光照、温度 等条件达到最佳的情况下, 培养基优化对混菌培养来 说是最重要的。 培养基的优化, 因为是光合细菌和芽孢杆菌混菌 培养, 可以根据芽孢杆菌的营养成分设计不同的水 平, 进行正交试验设计, 选择最佳培养基, 这方面的内 容有待于进一步研究。 参考文献 1 刘如林，刁虎欣，梁凤来，等. 光合细菌及其应用[M]. 北京:中国农 业科技出版社，1991. 155,205 2 李东风.光合细菌的开发应用动态[J]. 微生物学杂志，1998,18(2): 44,49 3 Paul F Weaver, Judy D. 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