【doc】舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽的分离及其对M胆碱受体的激动效应舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽的分离及其对M胆碱受体的激动效应

【doc】舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽的分离及其对M胆碱受体的激动效应舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽的分离及其对M胆碱受体的激动效应 舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽的分离及其对M胆碱受体的激动效应舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽的分离及其对M胆碱受体的激动效应 垣蕉堕型堂堂塑2007Jan,Vo141No1 JFujianMedUniv 舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽的分离及其对M胆碱受体的激动效应 郑佳冰,黄立峰,许盈,俞昌喜 摘要:目的从舟山眼镜蛇Najaatra蛇毒中分离毒蕈碱样多肽,探讨其与M胆碱受体的关系. 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 应用分子筛凝胶SephadexG-50,SephadexG-100,离子交换凝胶CM-SepharoseF.F.分离纯化目的组分;SDS- PAGE鉴定目的蛋白的纯度并测定其相对分子质量;放射受体分析法测定该物质与大鼠脑组织M胆碱受体的亲 和力;选用离体豚鼠回肠纵行肌观察其对M胆碱受体的效应.结果从舟山眼镜蛇蛇毒中获得一种与大鼠脑 组织M胆碱受体具有高亲和力的多肽(K.为1O.12nmol/L),其相对分子质量约14kD.该多肽可引起离体豚鼠回 肠纵行肌收缩,此效应可被阿托品阻断.结论舟山眼镜蛇蛇毒中获得与M胆碱受体具有高亲和力的多肽,该 多肽对M胆碱受体具有激动效应. 关键词:眼镜蛇毒液类;受体,胆碱能;毒蕈碱;胆碱能激动剂;放射受体 分析法 中图分类号:R996.3文献标识码:A文章编号:1672—4194(2007)01—0001-04 蛇毒中含有多种酶类和毒蛋白.人们很早就 从眼镜蛇科和海蛇科等蛇毒中分离获得了大量能 与烟碱型胆碱受体特异结合的神经毒素n],却一直 没有发现与毒蕈碱型胆碱受体具有亲和力的神经 毒素.直到1980年代后期,Adem首先报道,由绿 曼巴Dendroaspisangusticeps蛇毒中分离获得2 种与M胆碱受体有亲和力的毒蕈碱样毒素(musca— rinictoxins,MT)——MT1和MT2l2],此后,陆续 发现其他的MT.迄今为止,从曼巴蛇毒中至少分 离得到12种类似的神经毒素[2_5],研究发现MT对 M胆碱受体亚型选择性较高,在药理和生理研究中 是一种很好的工具药.我国蛇种舟山眼镜蛇与曼 巴蛇同属眼镜蛇科,笔者拟从舟山眼镜蛇蛇毒中分 离毒蕈碱样多肽,并观察其与M胆碱受体的关系. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1蛇毒舟山眼镜蛇蛇毒,广州新源蛇毒生 产基地提供. 1.1.2试剂与仪器SephadexG一5O,SephadexG一 100和CMSepharoseFF(美国Amersham公司); [.H]一QNB,48Ci/mmol,1.0mCi/mL(美国Amer— sham公司);其他试剂均为国产分析纯;GF/C玻璃 纤维滤膜(英国Whatman公司);自动部分收集器 (BSZ一100,上海沪西分析仪器厂);R624O多道生理 信号采集系统(成都仪器厂);2300TR液体闪烁计 收稿日期:2006,l1一O9修回日期:2006—12—13 基金项目:福建省自然科学基金资助项目(C0410018),福建医科大 学教授学术发展基金(JSO6o27),福建省重点高校建设科 研基金重点项目(XZ04008) 作者单位:福建医科大学药学院,福州350004 作者简介:郑佳冰(1982~),女,福建医科大学2004级硕士研究生 通讯作者:俞昌喜 数仪(美国MD公司). 1.1.3动物SD大鼠,体质量(250,280g),雌雄 不限(合格证号:闽实动质准第002205);荷兰种豚 鼠,体质量250,300g,雌雄不限,福建医科大学实 验动物中心提供. 1.2方法 1.2.1蛇毒的分离纯化舟山眼镜蛇粗毒溶于双 蒸水中,4?静置过夜;4000r/min离心10min,取 上清液上SephadexG一5O柱(26mm×900ram),用 双蒸水进行洗脱,流速2OmL/h,部分收集器收集洗 脱液,每管10min,测定洗脱液280nm波长处的光 密度值ED(280nm)],绘制洗脱曲线.活性组分经 浓缩脱盐后,上SephadexG一100柱(26mm×900 ram),洗脱过程同上.活性组分经浓缩脱盐后上离 子交换凝胶CMSepharoseFF,用0.02mol/L,pH 8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)及NaC1(0.05,0.6 mol/L)进行阶段性梯度洗脱,洗脱过程同上.整个 分离过程均在低温层析箱内进行. 1.2.2纯度鉴定参照文献[6],采用SDS-PAGE (Tris一甘氨酸系统)碱性不连续电泳,浓缩胶,T一 59/6,C一5;分离胶,T一15,C一2.恒流29 mA,整个电泳过程50rain.电泳结束后,将凝胶用 含5O甲醇和1O乙酸的溶液固定30min,考马斯 亮蓝R250,60?染色10min,使用30%甲醇,1O% 乙酸的混合液脱色. 1.2.3相对分子质量测定将SDS—PAGE电泳样 品凝胶,在ImageMasterVDS凝胶成像系统上成 像,以Marker为对照,通过该系统软件计算样品的 相对分子质量. 1.2.4放射受体分析法 1.2.4.1制备膜受体参照文献[7].大鼠断头 迅速取脑.晌}‟称质量.侪体积冰冷旧 .;32n1I】jlI蘸精熔般冰f{=}于匀浆4【.,1『】I?r, TlliH离心ImiII.取以1.】5?rmin离心 [ILin.卉清.沉淀以n,mc】J1,I】H.4目讷郫 磷酸盐缓蚪-液冼1次,离心琏噬和时间吲前重复1 次.最后用适缓冲被悬浮制城膜噩r1标4王,一!f) (贮存备用】owry法删蛋自台世 1.2.4.2饱和实验参照义献7:每,lI人 的定浓度n0膜赞白(02mRnil.和同浓度的 [H—Q\1{(nl,【I5I1[1loi”1).补充5f】mlno[ I,PH.1的竹钾磷睦盐缓}叶t液至总体积1mI.此 为d-,结台管室温嗡菏3d‟Tl,加A冰冷缓冲液 mI_终止J互应.进速抽脖至玻璃纤维滤膜上.冲洗2 次.滤膜烘f后.投人闪烁液1.用液怍烁他删定 滤膜』的放射性强度缚一浓度作复管.坶一拙 立实验复3次(F同j用Scatchard方程计算 :HQNB与M咀碱受体的解高常数Kd和最大 结台容量Bma×用Hill程求得Hi]1系数 1.2.4.3览予结台实验参照文献:7:结合 管qI加入固定浓度的H]一QNB(0fn1Ilnt])和 固定浓度的膜蛋自(n.21ngn【.).竞争结台管在总 结台管辈础上人不同浓度束标记的受试组分 (1-,1I”11gI),非特异结台管在 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 台管基础 上男姗人终浓度为?‟nmlI阿托品=室温孵育 加m{n,以后步骤同饱和实验,用剂量效应#埘数 法作.采坩分对数转化法.求tP,半数抑制浓度 1.(„ngProsoff 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 求f[I受斌f1分与M脾碱受 体的解离常数}(.值: K.一II.,卜+1.].Kd) 1.2.5离怍豚鼠呵腑纵行肌实验孺击豚鼠头 部使其昏迷.回肓部上端jcn处墩圆脯一段剪 成】.5,!CT3]长-浸于Kreh‟s液中,冼占内『El勺效应的 影响实验重复3次 2结果 苇Il卷《l 2.1F『的组分分离}E化驶其坪化rL质1毒经 SL-ph;.d(丹子筛色谮抒离后扶碍5蛋n峰 (【).其tfI第J组分lil引起豚鼠离体回韵纵}肌 性缩.定为活性卦l抒分于筛Sepl?lrx【一1:进一 步分离L组分(浯11j离了交换凝胶CMSc[ “FF纯化活性组丹.得引称平滑的t峰 在sI)sIA(;EJ显示为一蛋臼条特(3).暂名 为毒蒂碱洋多肽([[1lJS(arh1ipeplidhMP). l系数为1.一jf175.丧示:H] QNB太鼠腑蹦lN‟IIIH_碱受件结合反虚符合ark 横型 5~.alrd方.HF—BmaxKdJ{Kd.1{:特*站台 Ii!;F量由基量,苹位,l~noI】l刳直线斜宰矗Kd.磺 轴栽距为Bnl;ix. 图4H]QNB太鼠脑封iM碱受体结台”- chlird置 Fig4Seatc‟]l~lrd【ln,rormalion(IJrvt)』LHjQE binding1【)r.L】rLxvn „I,I_rit!F~t-rllb空单证为n1;b;秆对 牧logi—inl—I:n.【.式由『抑制苹古阜;l_IIiI叫i,:s4i:M|】 直栽lLI.It郎当lil一一时N‟If]扣徘. 图5苹触样多肚埘f_l{:QNI{尢鼠脑织M 碱受摊结舟均竞争j日j制曲线 Fig5]ahihi~oryL…veofthIJiladingL|JHQni(1 ralfor[L,XsynapI~sonlT『lml}ranfhvll![1~t,I_ln IlPtide 2.3MI对离体膊鼠回肠姒行叭张力cl{=J影响实 验中观察到一MP<?g-mI.1引起豚鼠离体肠纵 行帆产垃暂收缩.目.泼敏应可做阿托.”c‟ tool【J}m断.MPrjI起的离f书膊鼠I??IJl而纵f叭 收缩妓血是由M越碱受作介导的t”) 图6嚣蕈碱惮多肚刈驾惟胨阿蒋h水慨/j帕影响 Fig6】c-i.n1I】rinklLI(J.gIIIIII1~ LI..『rrrl‟ion[rt)lllIh:pigil‟,LIII~ 3讨论 文献报道.复巴蛇毒r『1{】Mr?fi【;-,6?j寸,氨 基蕊组成.柏坩分子质量约为k1)笔苦通过凝 歧层析方法从舟?1跟镜蛇蛇毒中执{的MI,批埘分 子质量约Jtk1).禽艟为1.Mt的lf?计分j二质 较MT大近来.Ml”i在眼镜蛇tfJ”“J” . Si)ltlt4t~.,蛇毒-}1鬟现能竞争抑制H:QNB与大 鼠嘶组织MI哦受体.i台反应ff,J蚩闩多肽.申不对分 子质链为J;.k1).垣J在放射受悼舒 析史驻中.发现M『】夫鼠呐组织M础受伴的亲 和力较高(K一1ci.11nmol1.1.其.jMlv{,lli的多 肤tK—u.3nn】?.】接近征菇争结台实验中.发 州b‟lP刊:‟H]一Q\B与大限晒缎纵M胆碱受体结 合厦应产生蠢争抑制m起故浓到箍太浓度范旧 是.1H,lo『J霹m1..弼MT是.1),.JrI1】. 提示N‟IfLjM诚受伟的亲和JfiJjl高于Mr. 比较看出.N‟IP与b‟liyoshih”J多肽较1:l=】似?I于 蛇种的进化不II听禽成j}存在差砰.L述暂是 否属十同类物质,尚待进一步研究 体外功能学研究z乏现.MIr一筮白M目? 碱受体的拮辛『[剂.”蛋白为激动利MIv】】11 职进行丁埘化性质和‟M眦碱受体的亲I』的研 究一但井水鞋甜体外功能研究笔营观察到 MP对离悼豚鼠回肠纵行肌其仃收缩救虚.且陂效 成J『『=l破受悼介导.提水X.‟IP址bIflf{娥受悼激 动制 住埘Mil籼M1”2的讲究中.发观它仃J仅 竞争抑制rH:qN如-b大鼠呐蛳织M胆碱受体 的结合反应,提示其肯M胆简受型选抒 性,在亚型选择性研究中.选用表选人类m受作 亚型(f【1t,Il1)的l[_国仓鼠印巢(【H())绷1世系.发 M一 - 鲫蛐如 宇】l 4福建医科大学2007年1月第41卷第1期 现MT对m和m两种M胆碱受体亚型的选择性 明显高于哌仑西平等亚型选择性拮抗剂,有些已开 发为药理学工具药使用口.其中MT2是一种M 受体选择性激动剂,体内药效学研究发现其作用与 拟胆碱药类似,可改善大鼠认知功能和动作行为能 力口],目前M受体选择性激动剂被认为是阿尔 茨海默病较有前途的治疗药物.MP作为M胆碱 受体激动剂,与M胆碱受体具有高亲和力,但其研 究开发价值还取决于亚型选择性如何.所以MP对 M胆碱受体的亚型选择性的研究将是下一步研究 的主要内容. 参考文献: [1] E23 [3] KarlssonE.Chemistryofproteintoxinsinsnakevenoms[-M]// LeeCY.Handbookofexperimentalpharmacology.Vo1.52. Berlin:Springer-Verlag,1979:159—212. AdemA,AsblomA,JohanssonG,eta1.Toxinsfromtheven— omofthegreenmambaDendroaspisangusticepsthatinhibit thebindingofquinuclidinylbenzilatetomuscarinicacetylcho— linereceptors1,J].BiochimBihysActa,1988,968:340—345. MaxSI,LiangJS,PotterLT.Purificationandpropertiesof ml—toxin,aspecificantagonistofmlmuscarinicreceptors1,J]. .,Neurosci.199313:4293—4300. 1-43JolkkonenM,GiersbergenPLV,HellmanU,eta1.Muscarin— ictoxinsfromtheblackmambaDendroaspispolylepis[J]. EurJBiochem,1995,234:579—585. E53VandermeersA,Vandermeers-PiretMC,RatheJ,eta1.Puri- ficationandsequencedeterminationofanewmuscarinictoxin (MT4)fromthevenomofthegreenmamba(Dendroaspisan— gusticeps)[J].Toxicon,1995,33:117卜1179. [6]萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南 [M].2版,北京:科学出版社,1992:880—886. 1,73徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].3版,北京:人 民卫生出版社,2002:363—367 1,83BradleyKN.Muscarinictoxinsfromthegreenmamba1,J]. PharmacolTher,2000,85:87一lO9. [9]MiyoshiS,TuAT.PhospholipaseA2fromNajanajasputa— trixvenomisamuscarinicacetylcholinereceptorinhibitor[J]. ArchBiochemBiophys,1996,328:17-25. [10]AdemA,KarlssonE.Muscarinicreceptorsubtypeselective toxins[J].LifeSci,1997,6O:1069—1076. [11]JerusalinskyD,CervenanskyC,AboV,eta1.Muscariniccho— linergictoxinsfromDendroaspisangusticepsvenom[J].J Neurochem,1991,57(Supp1):93. 1‟123JerusalinskyD,CervenanskyC,WalzR,eta1.Apeptidemus— carinictoxinfromthegreenmambavenomshowsagonist—like actioninan.inhibitoryavoidancelearningtask[J].EurJ Pharmacol,l993,240;l03—105. TheAgonisticEffectofMuscarinicPeptide NajaatraVenomtoMuscarinicCholinergic IsolatedfrOm Receptor ZhengJiabing,HuangLifeng,XuYing,YuChangxi DepartmentofPharmacology,CollegeofPharmacy,FujianMedicalUnivers ity,Fuzhou350004,China ABSTRACT:ObjectiveToisolatemuscarinicpeptide(MP)fromNaja口tr 口venonlandtostudvthe effectofMPinmuscariniccholinergicreceptor(mChR). MethodsMPhadbeenisolatedandDuri”ed fromNajaatravenombygelfiltrationonSephadexG一50andSephadexG一 100,chromatographyonion—ex— changerCM—SepharoseFF.HomogenicityandmolecularweightoftheMPwasdeterminedonSDS— PAGE.Isolatedileallongitudinalmusclesoftheguineapigswereusedtoobser vetheeffectofMPon mChR.TheaffinityofMPtoratbrainsynaptosomalmembranewastestedbyradioreceptorassay . ResultsMuscarinicpeptideisolatedfromNajaatravenomcoulddisplace[.H]一QNBfromratbrain.Its molecularweightwas14kD.Inguinea—pigileum,MPproducedapotentcont ractionwhichcanbe blockedbyatropine.ConclusionThemuscarinicpeptidefromNaja口fr口 venomwasmuscarinicagonist. KEYWORDS:cobravenoms;receptors,cholinergic;muscarinic;muscarinicagonists;radioreceptor assay;chromatography (编辑:曹延)