2.2.46色谱分离技术

01/2008:20246 2.2.46 色谱分离技术色谱分离技术色谱分离技术色谱分离技术 色谱分离技术是多级分离方法，在这种方法里样品组分分布在两相里，一个 是固定相，一个是流动相。 固定相可以是固体或支撑在固体上的液体或凝胶。固体相可以填充在柱内， 涂布在薄层板上或分布在薄膜上，等 流动相可以是气体，液体或超临界液体。色谱分离基于吸附，质量分配，离 子交换等原理，或是基于分子理化性质（如大小，质量，体积等）的不同。 本章介绍了（色谱分离中）定义及常用参数的计算公式与常见系统适应性的 要求。也介绍了按下面方法进行色谱分离的原理，使用仪器及操作方法。 — 纸色谱法(2.2.26), — 薄层色谱法(2.2.27) — 气相色谱法(2.2.28), — 液相色谱法(2.2.29) — 分子排阻色谱法(2.2.30) — 超临界流体色谱法(2.2.45) 定义定义定义定义 在专论中用下边的定义计算限度值。 在一些装置中，通过应用制造商提供的软件，一定的参数（如信噪比）可被 计算出来。使用者必须确保软件中所使用的计算方法符合欧洲药典的规定。如不 符合则需进行必要的校正。。。。 色谱图色谱图色谱图色谱图 色谱图是一流出浓度或经测量流出浓度而得的数量对时间、体积或距离的 变化经绘制的或其它检测器响应的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现。理想的色谱图用基线上的一系列高斯峰 表现出来。 保留数据保留数据保留数据保留数据 保留时间和保留体积 层析色谱法中保留值的测定可以以保留时间给出（tR)，它是以色谱图中最高 峰的位置直接定义的。由保留时间可计算出保留体积(VR)。 tR = 保留时间或保留距离（沿基线从给样点到相应组分最高峰的垂 直距离） v = 流动相流速 质量分配比 质量分配比(Dm)（也被认为是容量因子 k’或保留因子 k）被定义为： K C = 平衡分配系数（也被认为是分配常数） V S = 固定相体积 V M = 流动相体积 某一组分的质量分配比率可按下班的公式从色谱图中得出： tR = 保留时间（或体积）或距离（沿基线从给样点到相应组分最高 峰的垂直距离） tM = 滞留时间（或体积）：时间（或体积）或沿基线从进样点至相 应的不保留的组分最高峰的垂直距离。 分配系数 分子排阻色谱法中，特定色谱柱中某一组分的洗脱特性可由分配系数(Ko)表 示： tR = 保留时间（或体积）或距离（沿基线从给样点到相应组分最高 峰的垂直距离） to = 滞留时间（或体积）：时间（或体积）或沿基线从进样点至相 应的不保留的组分最高峰的垂直距离。 tt = 保留时间（或体积）或距离（沿基线从给样点到某种能够完全 通过固定相空隙的组分的最高峰的垂直距离） 滞留因子 平面层析色谱法中的滞留因子(RF)（ 也可被认为是保留因子 Rf）是从给样点 到某点中心的距离与到溶剂前沿的距离之比。 b = 被分析物展开距离 a = 溶剂前沿展开距离 色谱色谱色谱色谱数据数据数据数据 峰值可用于峰面积（A）或峰高度（h）和半高峰宽 (wh)或峰高度(h)与拐点 间的峰宽来定义。在高斯峰中存在如下关系： wh = 1.18wi 图 2.2.46.-1. 对称因子 某峰（如图 2.2.46-2）的对称因子 (As)（或拖尾因子）按下式计算： w0.05 = 二十分之一峰高处的峰宽度。 d = 从最大峰值处到二十分之一峰高处的垂直距离。 若计算值是 1.0则表明完全对称。 图 2.2.46.-2. 柱效能和理论塔板数 根据下面计算式中算出的理论塔板数（N）（算式中 tR，wh 需用相同的单位， 如时间，体积，或距离），柱效能（理论效能）能够从在等温或等密度条件下（根 据仪器条件）获得的数据计算得出。 tR = 保留时间（或体积）或距离（沿基线从给样点到相应组分最 高峰的垂直距离） wh = 半高峰宽 理论塔板数随组分，色谱柱，保留时间的不同而不同。 分离数据分离数据分离数据分离数据 分离度 两个组分间的分离度(Rs)可由以下的算式算得： tR1and tR2 = 保留时间或距离（沿基线从给样点到 2个相邻峰中 最高峰的垂直距离） wh1 and wh2 = 半高峰宽 大于 1.5的分离度符合基线分离。 如果达不到基线分离则不能应用这一表达式。 在定量平面色谱法中，使用迁移距离而不是保留时间，分离度可由下面的公 式算得： RF1 and RF2 = 从给样点到（迁移后）该点中心的距离与给样点到 溶剂前沿距离的比值（滞留因数） wh1 and wh2 = 半高峰宽 a = 溶剂前沿的迁移距离 峰谷比 当 2个峰间达不到基线分离时，可用峰谷比(p/v)作为相关物质的系统适应性 要求的检测。(如图 2.2.46.-3) 图 2.2.46.-3. H p = 较小峰到外推基线的高度 H v = 外推基线与较小峰与较大峰曲线拐点处的高度 相对保留值 相对保留值（r）可由下式估算出 tR2 = 待测峰的保留时间, tR1 = 参照峰的保留时间（通常是相应于供试品的色谱峰） tM = 沿基线自进样点到相应的保留组分色谱峰最高点与基线的垂 直交点的滞留时间或距离 未调整的相对保留值(rG)由下面的式子得出： 除非另有说明，各论中的相对保留值均相应于未调整的相对保留值。 平面色谱法中，常用滞留因子 RF2，RF1而不是 tR2，tR1. 定量精密度定量精密度定量精密度定量精密度 信噪比 信噪比(S/N)影响定量精密度，可由下列方程计算： H = 对照液得到的色谱图中待测组分的色谱峰高度，测定自色谱峰 最高点到半峰宽 20倍距离范围观察到信号的外推基线的距离。 h = 在加入空白品后图谱所显示的背景噪声范围，在由指定参考溶 液得到色谱图中色谱峰半高峰宽的 20倍范围内观察，如有可能，将 其平均坐落在色谱峰出现的位置的两边。 Figure 2.2.46.-4. 重现性 响应的重现性表达为对供试溶液或对照溶液连续多次测定的估计百分比相 对 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 偏差(RSD%)，由下式计算： yi = 峰面积、峰高、或由内标法得到的面积比的单次测定值。 = 单次测定值的平均值 n = 测定次数 对于确定限度值的对照溶液，按下式计算其连续多次进样所允许的最大相对 标准偏差 (RSDmax)： K = 常数(0.349)，由式 得到，其中 代表连续 6次 测定 B=1.0时所要求的 RSD， B = 各论中定义的上限减去 100% n = 对照溶液重复进样的次数（3≤n≤6） t90%,n–1 = 在 90%置信水平、自由度为 n-1时的 Student’s t 系统适系统适系统适系统适用用用用性性性性 系统适用性试验代表某种分析方法的总体分析能力，用以确保色谱系统有足 够的分析性能。在评价色谱柱的性能时，常用表观效率，质量分配比，分离度， 相对保留和对称因子这几项参数。 影响色谱分析性能的因素包括流动相的表观组成、离子强度、温度和 pH， 流速、柱长、温度和压力，固定相的特征，如：孔率，颗粒大小，颗粒种类，比 表面积，以及在反相载体中，化学修饰（封端，载如碳等）的程度。 所应用设备的各种构件需合乎标准，且能够达到进行检查或含量测定所要求 的精密度。 除另有说明外，应符合以下几点要求。 — 除各论中另有说明外，主峰的对称因子应为 0.8~1.5之间。这一要求 通常广泛适用于各论中的检查或含量测定。 — 对指定的对照溶液重复进样的最大允许的相对标准偏差不得超过表 2.2.46-1的值。这一标准仅使用于内容物的含量测定，不适于有关物质的检查。 — 色谱峰的检出限（相应于信噪比为 3）低于有关物质检查的忽略限。 — 色谱峰的定量限（相应于信噪比为 10）等于或低于有关物质检查的 忽略限。 表 2.2.46.-1. — 重复性要求 进样次数 3 4 5 6 B (per cent) 最大允许的相对标准偏差 2.0 0.41 0.59 0.73 0.85 2.5 0.52 0.74 0.92 1.06 3.0 0.62 0.89 1.10 1.27 色谱条件的调节色谱条件的调节色谱条件的调节色谱条件的调节 不根本上改变分析方法，而通过调节色谱检测的各项参数来满足系统适用 性，下列给出了各项参数的调节程度。 下述的色谱分析条件调节范围在各论起草过程中已验证有效。包含的系统适 用性用以确保检查或含量测定时达到满意的性能所需的分离。 然而，由于固定相以笼统的方式表达，且可有多种不同色谱性能的商品化异 的固定相，因此有必要对色谱条件进行调节以满足指定的系统适用性的需要。 尤其是反相液色谱法，多种参数的调节有时不能达到令人满意的效果。在这 种情况下，就需要用能达到所需的色谱性能的同类型（如，硅胶）的色谱柱代替。 对于关键参数，各论中明确规定了调节范围，以确保系统适用性。 避免在系统性能上可能具有累计效果的复杂调节。 薄层色谱法薄层色谱法薄层色谱法薄层色谱法 流动相的组成：无论哪一个值比较大，次要溶剂组份量可以以相对值±30% 或绝对值±2% 进行调节；对于占流动相 10%的次要组分，30%的相对调节允许 的变化范围是 7-13%而 2%的绝对调节允许的变化范围是 8-12%，因此相对值比 较大；对于占流动相 5%的次要组分，30%的相对调节允许的变化范围是 3.5-6.5% 而 2%的绝对调节允许的变化范围是 3-7%，在这种情况下，绝对值比较大。其余 组分的调节不多于 10%的绝对调节。 流动相中水性组分的 pH：除另有说明，pH为± 0.2pH，当检测中性物质时， pH为±1.0pH。 流动相中缓冲物质的盐浓度：± 10% 点样体积：若使用颗粒细小的色谱板（2-10 µm），为指定点样量的 10-20% 在高效能色谱板中，溶剂前沿的移动距离不少于 50mm 或 30mm 液相色谱法液相色谱法液相色谱法液相色谱法 流动相组成：无论哪个值较大（看以上举例）次要溶剂组分量可以以相对值 ±30%或绝对值±2% 进行调节。其余组分的调节不多于 10%的绝对调节。 流动相中水性组分的 pH：除另有说明，pH为± 0.2，当检测中性物质时，pH 为±1.0. 流动相中缓冲组分的盐浓度：± 10% 检测波长：不允许调整 固定相： — 柱长： ± 70 % , — 柱内径：± 25 % , — 颗粒大小：最多减小 50%，不允许增加。 流速：± 50%。当各论中指明主峰保留时间时，如果柱的内径改变，则流速 也需改变。如果在各论中条件部分中使用了近似理论塔板数，则不能降低流速。 温度：± 10%，最高 60°C。 进样体积：只要满足待测峰的重现性和检测，可以减小。 梯度洗脱：所用仪器的配置可能显著改变方法所述的分离度、保留时间和相 对保留值。如果发生这种情况，可能是由于 2种洗脱液混合处和柱顶端的死体积 造成的。 气相色谱法气相色谱法气相色谱法气相色谱法 固定相： — 柱长： ± 70 %， — 柱内径：± 50%， — 颗粒大小：最多减小 50%，不允许增加， — 薄膜厚度：-50% 到+100% 流速：± 50% 温度：± 10% 进样体积：只要满足待测峰的重现性和检测，可以减小。 超临界流体色谱法 流动相组成：对于填充柱，无论哪个值较大次要溶剂组分量可以以相对值 ±30%或绝对值±2% 进行调节。其余组分的调节不多于 10%的绝对调节。对于毛 细管色谱柱系统，不允许调节。 检测波长：不允许调节 固定相 — 柱长： ± 70 %， — 柱内径： ± 25% （填充柱） ± 50% （毛细管柱） — 颗粒大小：最多减小 50%，不允许增加 流速：± 50% 温度：± 10% 进样体积：只要满足待测峰的重现性和检测，则可以减小 定量定量定量定量 — 检测器响应：检测器灵敏度是进入检测器的流动相中每单位浓度或 每单位质量的物质的信号输出。相对检测器响应因子（通常指响应因子）表示 相对于标准物质检测器的灵敏度。校正因子是响应因子的倒数。 — 外标法。待分析物的浓度通过比较由测试液获得的响应值（峰值） 和由参考溶液获得的响应值（峰值）得到。 — 内标法。将等量的待测物（内标物）中不含的组分加入到测试液和 对照液中。内标物不应与待测物反应；性质稳定，不含有与待测物具有相同保 留时间的杂质。通过比较测试液与对照液中由待测物和内标物的峰面积或峰高 的比值，得到待测物的浓度。 — 归一化法。通过确定一个或几个峰的峰面积占所有峰面积（不包括 溶剂、添加试剂产生的峰及在低于忽略限的峰）的百分比，计算待测物中一个 或多个组分的百分比含量。 —校正法。确定测定或计算的信号（y）与物质的量（浓度，质量等）（x） 的关系，计算校准函数。利用反函数，从分析物质的测定或计算信号计算出分 析结果。 对于含量测定或组分的定量测定，各论中可能会有外标法、内标法或校正法， 一般情况下不用归一化法。在有关物质的检查中，通常采用单一对照溶液的外标 法或归一化法。然而，不管采用外标法还是归一化法，当采用测试液稀释法进行 比较时，有关物质的响应与物质本身相似（响应因子 0.8~1.2），否则文中会包 含校正因子。 当有关物质检查中规定了杂质的总量或对某一杂质进行定量测定时，选择合 适的阈值设定值及合适的色谱面积积分条件很重要。在此种检查中，忽略限（如： 峰面积低于限度的色谱峰面积不予考虑）通常为 0.05%。因此，数据采集系统的 阀值设定相应于至少忽略限的一半。与主峰未完全分离的杂质色谱峰的积分最好 用峰谷-峰谷外推法(tangential skim)。溶解样品的溶剂产生的峰也忽略不计。 翻译人：施美（海外部）电话：66769 校核：赵沈娟 宋雪洁