降落-重叠PCR法四重融合构建平菇同源重组片段(现在在用的方法)

ISSN 1007-7626 CN 11-3870 /Q 中国生物化学与分子生物学报 http:/ / cjbmb． bjmu． edu． cn Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2012 年 4 月 28(4) :375 ～ 379 收稿日期:2011-12-05;接受日期:2012-01-03 河南省科技攻关项目(No． 082102150048) * 联系人 Tel:0371-63555175;E-mail:qliyou@ henau． edu． cn Received:December 05，2011;Accepted:January 3，2012 Supported by Science and Technology Development Program of Henan Province (No． 082102150048) * Corresponding author Tel:0371-63555175; E-mail:qliyou@ henau． edu． cn ·技术与方法· 降落-重叠 PCR法四重融合构建平菇同源重组片段 柴 冉， 孙 强， 邱立友* (河南农业大学生命科学学院，农业部农业微生物酶 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 重点实验室，郑州 450002) 摘要 对多个长片段的基因融合目前仍缺少有效的方法 ． 本文提出一种新的融合 PCR 策略，即在 常规的重叠 PCR 的第 1 步和第 2 步均增加 1 个降落 PCR 程序，减少不适当的退火温度和 PCR 产 物 3' 端额外碱基 A 对片段融合、扩增的影响，提高正确融合与扩增的效率 ． 结果表明，为构建平菇 葡聚糖合成酶启动子的同源重组序列，在 4 个长度分别是1 015 bp、2 822 bp、2 206 bp 和1 008 bp 的片段进行融合时，在重叠 PCR 的第 1 步加上退火温度61. 5 ℃ ～ 57. 5 ℃、每降落0. 5 ℃进行 1 个 循环的降落 PCR 程序，在重叠 PCR 的第 2 步加上退火温度60 ℃ ～ 56 ℃、每降落0. 5 ℃进行 1 个循 环的降落 PCR 程序，经过 1 次 PCR 即获得顺序正确的全长融合片段 ． 测序结果与 4 个片段序列的 一致性达到 98. 5%，降落-重叠 PCR 法对多个长片段的基因融合具有较高的应用价值 ． 关键词 基因融合;重叠 PCR;降落 PCR;同源重组 中图分类号 Q78 Quadruple DNA Fragments Fusion using Touchdown- Overlap Extension PCR CHAI Ran，SUN Qiang，QIU Li-You* (College of Life Sciences，Henan Agricultural University，Key Laboratory of Enzyme Engineering of Agricultural Microbiology， Ministry of Agriculture，Zhengzhou 450002，China) Abstract Here we introduced a genes fusion procedure using touchdown PCR (TD PCR)in the step I and II of classic overlap extension PCR (OE PCR)to reduce the inappropriate annealing and the extra 3'-end adenine which added by Tag DNA polymerase． In an attempt to construct a homologous recombination fragment to replace the glucan synthase promoter in Pleurotus ostreatus，four fragments of 1 015，2 822，2 206 and 1 008 bp in length were used for the fragment fusion． In step I，the annealing temperature were decreased by 0. 5 ℃ from 61. 5 ℃ to a touchdown at 57. 5 ℃ starting from the second cycle． In step II，the annealing temperature were decreased by 0. 5 ℃ from 60 ℃ to a touchdown at 56 ℃ with the supply of LA DNA polymerase． The desired fusion product of 7. 05 kb was obtained through the overlap PCR with one round，and then cloned into a T-vector and sequenced． A 98. 5% consensus between the fusion product and the four separate DNA fragments was detected． The results suggested that TD-OE PCR could be an effective method to prepare long multiple fragment fusions for the research in somatic cell knockout / in or partial fungal genome synthetic applications． Key words gene fusion;overlap extension PCR;touchdown PCR;homologous recombination 将多个 DNA 片段进行融合时，常采用传统的限 制性内切酶和连接酶法，这种方法用时长，且受到限 制性酶切位点的限制，它需要利用序列中存在的酶 切位点，或者通过 PCR 加上序列中不存在的酶切位 点［1］． 自 20 世纪 80 年代末发展起来的融合 PCR 法，包括重叠(延伸)PCR 法(overlap extension PCR， OE PCR)［2，3］ 和 长 引 物 PCR 法 (megaprimer PCR)［4］，只需经过 PCR 反应即可得到融合的 DNA 中国生物化学与分子生物学报 第 28 卷 片段，并可实现在基因的任一位置进行融合，不需引 入不必要的碱基(如限制性酶切位点) ，以及方便地 进行定点突变［5 ～ 7］，上述方法已被广泛应用 ． Fig． 1 Outline of the strategy combining the touchdown PCR and overlap extension PCR(TD-OE PCR)for the quadruple DNA fragments fusion H1 ～ H4 fragments were the four fragments to be fused，diagonal lines in which represented the homologous sequences between two adjacent fragments． P1 and P8 were 5' and 3' oligonucleotide primers matching with H1 5' sequence and H4 3' sequence，respectively． H1H2H3H4 was the fused quadruple DNA fragments 重叠 PCR 需经 2 步进行，第 1 步是在低的复性 (退火)温度下，第 1 片段的 3' 端和第 2 片段的 5' 端通过碱基互补(互补碱基序列是在上 1 轮 PCR 时 由引物添加的)相连接，形成融合片段;第 2 步是在 较高的退火温度下，利用第 1 片段的 5' 端引物和第 2 片段的 3' 端引物，以融合片段为模板进行 PCR 扩 增 ． 由此可见，为了保证融合的效率，就要求前 1 轮 PCR 设计的全部引物有相同或相近的 Tm 值，否则 会导致引物无法组合使用［8］，这就给引物设计增加 了难度 ． 在第 1 步 PCR 时要求复性温度要低，因为 PCR 启始，模板中互补末端浓度低，其 Tm 值也低 ． 但在第 2 步 PCR 时，需在较高退火温度下进行，以 提高引物的特异性，以便得到完整的融合片段，减少 不需要的短融合片段［9］，同样又增加了引物设计的 难度 ． 另外，对聚合酶的保真性要求较高，扩增长片 段常用的 LA 酶会在 PCR 产物的 3' 端额外加上碱 基 A，虽然有利于 PCR 产物与 T 载体的连接，但却 影响下一步 DNA 片段间的融合［10］． 因此，重叠 PCR 对 2 个或 3 个 DNA 片段的融合效率较高，而对 4 个以上片段的融合往往难以获得成功 ． 长引物 PCR 是在 1 个 PCR 反应体系中加入 3 种引物，其中 2 个引物是待融合的第 1 片段的 5' 端 和 3' 端引物，3' 端引物与待融合的第 2 个片段的 5' 端是互补的，但使用浓度较低 ． 第 3 个引物是待融 合的第 2 个片段(称作长引物)． PCR 开始扩增的是 第 1 个片段，待其 3' 端引物浓度耗至很低，PCR 反 应中止后，开始进行融合 PCR，即利用第 1 片段的 5' 端引物和长引物扩增融合片段 ． 长引物 PCR 尽管 没有退火温度的变化，但仅适用于 2 个片段之间的 融合 ． 为确保 PCR 的特异性扩增，1991 年 Don 等创 建了降落 PCR(touchdown PCR，TD PCR)［11］． 该方 法的设计思路是，初始反应循环选择的退火温度较 高，通常大于或等于引物的 Tm 值，随后反应循环的 退火温度持续降低 ． 最初的高退火温度使引物与模 板能高度特异性结合，而低的退火温度则引发高效 的扩增反应 ． 所以，降落 PCR 能减少普通 PCR 的假 阳性现象，降落 PCR 适用于以下情况，普通 PCR 得 不到扩增产物，PCR 中有非特异性产物，DNA 模板 复杂易发生非特异性退火［12］． 降落 PCR 在 DNA 片 段融合中的应用尚未见报道 ． 我们在构建平菇葡聚糖合成酶启动子的同源重 组序列时，需要将 4 个长度1 008 bp ～ 2 822 bp 的片 段进行融合，在重叠 PCR 的第 1 步和第 2 步反应中 分别加入降落 PCR 程序，通过 1 次 PCR 即得到全长 的融合片段，其原理示 意见 文理分科指导河道管理范围浙江建筑工程概算定额教材专家评审意见党员教师互相批评意见 Fig． 1． 1 材料与方法 1. 1 待融合 DNA 片段的设计 4 个待融合的 DNA 片段自左至右分别为 H1、 H2、H3 和 H4. H1 是位于平菇天达 300 葡聚糖合成 酶启动子前的 DNA 序列，长度是1 015 bp，通过引物 P1(5'-TCCCCCGGGACTCGTTATCGTATTC-3')和 P2 673 第 4 期 柴 冉等:降落-重叠 PCR 法四重融合构建平菇同源重组片段 (5'-TAGTCGTTGGCAGGCCAGTTTCCATATC-3')以平 菇天达 300 液体培养的菌丝采用 CTAB 法提取纯化 的 DNA 为模板，常规 PCR 方法得到 ． 引物 P2 序列 的斜体部分 15 个碱基与 H2 的 5' 端部分序列互补 ． 平菇天达 300 来自河南农业大学生命科学学院应用 真菌实验室保存菌株 ． H2 是大肠杆菌潮霉素 B 抗性基因的表达盒序 列，长 度 是 2 822 bp，通 过 引 物 P3 (5'- GATATGGAAACT GGCCTGCCAACGACTA-3')和 P4 (5'-AGATACAAGGGAATTCATCAACATGCTAC C-3') 以 25 号质粒为模板，常规 PCR 方法得到 ． 引物 P3 和 P4 序列的斜体部分 13 和 14 个碱基分别与 H1 的 3' 端和 H3 的 5' 端部分序列互补 ． 25 号质粒由 河南农业大学生命科学学院应用真菌实验室构 建［13］． H3 是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)甘油 3-磷 酸甘油脱氢酶基因(gpd)的启动子序列，长度是 2 206 bp，通 过 引 物 P5 (5'-GGTAGCATGTTGAT GAATTCCCTTGTATCT-3')和 P6(5'-GCTGTGTGAGT CCAATGGAGTATGGATGTAG-3')以 PAN7-1 质粒为模 板，常规 PCR 方法得到 ． 引物 P5 和 P6 序列斜体部 分 16 和 17 个碱基分别与 H2 的 3' 端和 H4 的 5' 端 部分序列互补 ． PAN7-1 质粒由荷兰 TNO 生物医学 实验室 Punt 博士赠送 ． H4 是平菇天达 300 葡聚糖合成酶基因的 5' 端 部分序列，长 度 是 1 008 bp，通 过 引 物 P7 (5'- CTACATC CATACTCCATTGGACTCACACAGC-3')和 P8(5'-CGGGATCCAGTAAGTCTTGAAGAAAA-3')以 平菇天达 300 液体培养的菌丝采用 CTAB 法提取纯 化的 DNA 为模板，常规 PCR 方法得到 ． 引物 P7 序 列的斜体部分 14 个碱基与 H3 的 3' 端部分序列 互补 ． 1. 2 融合 4 片段的降落-重叠 PCR 降落-重叠 PCR 的第 1 步反应体系是 47. 5 μL: 100 ng 模板片段 DNA 各 1. 0 μL，10 × 缓冲液(含 Mg2 +)5. 0 μL，dNTP(2. 5 mmol /L)8. 0 μL，5 U LA 聚合酶(TaKaRaTM，宝生物工程 (大连)有限公司) 0. 5 μL，ddH2O 30. 0 μL． 降落 PCR 扩增条件是: 94 ℃ 预变性 5 min，将退火温度设为 61. 5 ℃ ～ 57. 5 ℃，每降落0. 5 ℃进行 1 个循环，分别在不同 的温度进行退火，在梯度降温的循环完成后，选 57. 5 ℃为最佳退火温度，94 ℃变性 30 s，57. 5 ℃退 火 40 s，68 ℃延伸 4 min，再进行 10 个循环，72 ℃延 伸 10 min． 第 1 步反应完成后，直接在反应液中加入引物 (0. 1 mmol /L)P1 和 P8 各 1. 0 μL，补加 LA 酶 0. 5 μL，开始第 2 步反应，降落 PCR 扩增条件是:94 ℃ 预变性 5 min，将退火温度设为60 ℃ ～ 56 ℃，每降 落0. 5 ℃进行 1 个循环，分别在不同的温度进行退 火，在梯度降温的循环完成后，选56 ℃为最佳退火 温度，94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 40 s，68 ℃延伸 7 min，再进行 20 个循环，72 ℃延伸 10 min． 以常规重叠 PCR 为对照，其扩增条件是，第 1 步反应:94 ℃ 预变性 5 min，94 ℃ 变性 1 min， 56 ℃退火 1 min，68 ℃延伸 4 min，10 个循环，72 ℃ 延伸 10 min． 第 2 步反应:94 ℃预变性 5 min，94 ℃ 变性 1 min，56 ℃退火 1 min，68 ℃延伸 7 min，20 个 循环，72 ℃延伸 10 min． 1. 3 PCR 产物的分析 PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，英国 Syngene G:BOX 凝胶成像系统照相 ． PCR 产物回收 采用宝生物公司胶回收试剂盒，按说明书操作 ． PCR 产物与 PMD19-T 载体连接、转化大肠杆菌感受 态细胞、筛选克隆并进行质粒提取，质粒提取按试剂 盒说明书操作(宝生物公司)． 重组片段序列鉴定由 上海博尚生物技术有限公司测序(ABI 3730 XL DNA 测序仪)． 2 结果 2. 1 四片段融合的降落-重叠 PCR 分析 以 H1、H2、H3 和 H4 各片段为模板，经降落-重 叠 PCR 扩增获得全长目的融合片段 H1H2H3H4，目 的条带清晰，重复性高 ． 用常规重叠 PCR 扩增未获 得目的条带，随后经多次调整退火温度和延伸时间 等反应条件，均无法获得目的条带，偶然一次出现条 带，极不稳定 ． 在融合 PCR 第 2 步反应前补加 LA 酶是必要的，否则难以扩增获得任何条带(Fig． 2)． 融合片段与 T 载体连接后经转化、克隆筛选和 质粒提取鉴定，证实已获得含融合片段的质粒 (Fig． 3)． 2. 2 降落-融合 PCR 产物的序列鉴定 融合片段测序结果证实，4 个片段按照设计的 前后顺序正确地融合在一起(Fig． 4) ，全长片段的测 序与 4 个片段的序列比对其一致性达到 98. 5% ． 3 讨论 对多个长片段的基因融合目前还缺少有效的方 法 ． 为提高基因融合的效率，除了需要克服引物对 773 中国生物化学与分子生物学报 第 28 卷 Fig． 2 Electrophoresis analysis of the PCR products for quadruple DNA fragments fusion 1: TD-OE PCR production． TD-OE PCR was that when OE PCR was performed a touchdown PCR (TD PCR)program by introduced in its step I and step II． Primers P1，P8，and TaKaRaTM LA DNA polymerase were supplied in the PCR reaction tube after the step I ended． 2: TD-OE PCR production yielded at similar conditions of lane 1 except without LA DNA polymerase supplied after the step I ended． 3:OE PCR production． OE PCR was performed as a control without the TD PCR program． 4:OE PCR production which yielded at similar conditions of lane 3 except without LA DNA polymerase supplied after the step I ended． M:1 kb plus DNA marker Fig． 3 Electrophoresis analysis of the T-vector connected to the quadruple fusion fragment PMD19-T vector (Lane 1)connected to the quadruple fusion product to form a larger DNA molecule(Lane 2)． M:1kb plus DNA marker 重叠 PCR 的影响外，还要减少 Taq DNA 聚合酶在 PCR 产物 3' 端额外加上碱基 A 对融合的影响 ． 为 了避免 Taq DNA 聚合酶在 PCR 产物 3' 端额外加上 碱基 A，可采用 T4 DNA 聚合酶预先使待融合的片 Fig． 4 Sample sequence of three fusion points in quadruple fusion product Expected sequences of connecting primers P2，P4 and P6 were shown as letters upside peaks． Primer P2，P4 and P6 were fusion points between H1 and H2，H2 and H3，and H3 and H4，respectively． Color code:green，A;blue，C;black，G;red，T 段进行钝化［14］，采用高保真的 Pfu 酶［15］，或在 PCR 引物中引入 1 个碱基 A［10］． 但这些方法比较繁琐， 成本高 ． 本室曾多次尝试采用重叠 PCR 将 4 个 DNA 片段进行融合，仅有 1 次得到融合片段(Fig． 2) ，如先用重叠 PCR 将前 2 个片段和后 2 个片段分 别融合，继而再采用重叠 PCR 进行第 2 次融合，未 能获得全长的融合片段(结果未报道)． 本文采用在 重叠 PCR 的第 1 步和第 2 步中都引入降落 PCR 程 序，使用 LA 酶，经过 1 次 PCR 即成功地将 4 个 DNA 片段融合成为 1 个长度高达 7. 05 kb 的目的片段， 该目的片段能够方便地与 T 载体连接，并经转化筛 选、测序，测序结果与 4 个单片段序列高度一致 ． 其 成功的原因有以下几点 ． 首先，在重叠 PCR 的二步反应中引入降落 PCR 程序，在片段较多时，无需对各个引物间退火温度的 一致做过多要求，可以不用摸索退火温度等反应条 873 第 4 期 柴 冉等:降落-重叠 PCR 法四重融合构建平菇同源重组片段 件，降低了融合反应的难度 ． 第二，引入降落 PCR 程序，降低了 Taq DNA 多 聚酶在产物 3' 端额外增加碱基 A 的影响，提高了正 确融合反应的效率 ． LA 酶扩增的 PCR 产物均在 3' 端额外增加碱基 A，仅少量产物的 3' 端无额外增加 A，后者在重叠 PCR 反应中融合效率高 ． 在重叠 PCR 反应的第 1 步引入降落 PCR 程序，在较高的退 火温度下进行融合，提高了融合反应的特异性，使得 含量极少的 3' 端没有加 A 的待融合片段能够进行 特异性结合，为重叠 PCR 反应的第 2 步提供正确融 合的模板。 第三，在重叠 PCR 的第 2 步反应前补加 LA 酶， 弥补了因受热 DNA 聚合酶被钝化的影响 ． 重叠 PCR 要进行 2 次高温长时间的 DNA 预变性，DNA 聚合酶的热钝化损失量也相应大幅度增加 ． 在重叠 PCR 第 2 步反应前不补加 LA 酶，即使引入降落 PCR 程序也难以获得任何条带(Fig． 2) ，因此，在重叠 PCR 的第 2 步反应前补加 DNA 聚合酶非常必要． 本研究应用降落-重叠 PCR 方法顺利得到 4 个 片段融合的 7. 05 kb 产物，重复性好，应用该方法能 否得到更多片段、更大长度的融合片段，还有待进一 步探索 ． 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