制备加压色谱

nullnull第五章 制备型加压液相色谱 本章的重点在于介绍高压液相色谱的制备型应用及相关技术。作者在本章中列举了许多分离实例，以期帮助读者解决分离工作中遇到的具体问题。有关高压液相色谱的介绍，读者可参阅其他一些 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 籍(如Synder和Kirkland，1979；Simpson，1982；Johnson和Stevenson，1 978；Henschen等1 985；Poole和Poole，1991；McMaster，1994；Scott，1995)。关于制备型液相色谱的详细描述，读者还可参阅下列书籍：Verzele和Dewaele，1986；Bidlin~meyer，1987；Ganetsos和Barker，1993；Unger，1994；Porsch。1994等。 本书所指的“加压液相色谱”包括各种施加压力于色谱柱进行的液相色谱，从快速液相色谱(压力2 bar。)至制备型高压液相色谱(100 bar)，样品量可从毫克级至千克级。这有别于靠重力驱动的柱色谱分离。 用常规的色谱方法通常很难分离克数量级的化学结构非常相近的样品。而在半制备型高压液相色谱这样的加压液相色谱中，由于采用了更小颗粒度的吸附剂，使其具有更高的分离因子(a)，因此能够完成难度很大的分离工作。 制备型色谱与分析型色谱的差别在于后者(目的在于分离，鉴别及鉴定)不需对样品进行回收，而前者的目的在于从一混合物中分离得到纯化合物，是一个纯化的过程。制备型液相色谱的上样量较大，通常需要特定的装置和一定的操作条件，本章将对有关内容加以讨论。 大分子的分离常需依靠高压液相色谱完成，有关内容将在第八章详细介绍。 null5．1 基本原理 加压液相色谱的效能取决于分离速度和分辨率。对于制备型加压液相色谱而言，上样量是另一个重要的指标(图5．1)。 对某一个分离参数进行优化常会影响到其他分离参数。例如，增加洗脱液流速会降低分辨率。分辨率也会因上样量过大而下降，上样量过大的原因包括样品溶液的体积过大或数量过大(Golshan-Shirazi和Guioehon，1994)。色谱柱的载样量又取决于柱的直径、长度，吸附剂的颗粒度及装填的紧密程度。 对于偶尔的一次分离而言，分离的主要目的在于获取一定量的某个化合物，达到一定的纯度及回收率。而对于生产规模的色谱分离而言，单位时间内可分离的样品量是一个关键的指标。单位时间获得的样品量，即产量，取决于色谱柱的直径和洗脱剂流速等参数，生产能力与产品纯度是两个相互制约的因素(Unger和Janon，1986)。换言之，分辨能力并不总是制备型液相色谱中首要考虑的因素(Guiochon和Katti，1987)，制备型液相色谱应该首先具有经济、快速地生产所需产品的能力。 null加压在液相色谱中可发挥下列两方面作用(a和b)或其中之一： (a)加快洗脱剂的流速，提高分离速度； (b)允许在分离过程中使用颗粒度更小的吸附剂，从而获得更高的分辨率。 敏感化合物在进行长时间的常压色谱分离时，其结构可能会发生变化，缩短分离时间的最大优点在于可以避免这种变化的发生。 在本书各章节中，“制备型”一词指待分离的样品数量在微克级至千克级之间的所有不仅仅以分析为目的的分离。所需纯化合物的数量取决于其用途： ——微克级至毫克级的样品一般用于波谱测试，如对天然产物进行的分离； ——毫克级样品可用于进一步的结构鉴定，化学反应及某些生物活性测试： ——克数量级的样品可用于进一步的生物活性测试，作为合成、半合成工作的原料以及 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品。 null 对于“制备型加压液相色谱”一词的分类方法有不同观点。例如，对于高压液相色谱，Snyder和Kirkland(1979)根据色谱柱能分离样品的量将其分为分析型(多孔型吸附剂，1～2mg，15min内可分开两个分辨率Rs=1．25的化合物，回收样品的纯度大于99％)、半制备型(100～200mg)和制备型(0．5～1．0g)三种。他们把放大的分析型分离也归类于半制备型分离。通用的术语“大规模液相色谱”则可用于指制备型及按比例放大量操作的分离工作。此外，还可增加生产型色谱(process chromato—graphy)一词，即指那些样品量在几百克至几千克之间的分离。Herbert(1991)限定制备型色谱为样品量在克数量级，柱直径在25-150ram之间的分离；而生产型色谱为所用柱直径大于150mm的分离。因此，在本章中所指的“制备型”一词的范围内，待分离样品的量之间可存在显著差别。 本章将介绍几种不同的加压液相色谱方法，每种方法的大致的应用范围可参见图5．2所示。当然，这种应用范围的划分不是绝对的，尤其是当色谱柱的上样量处于超载情况时。 null 选择制备型分离系统时不仅仅应考虑待分离样品的量。还应考虑拟进行的分离的种类。充分考虑上述因素并正确选择色谱柱的尺寸、固定相的种类、以及压力和流动相等参数，才能保证分离成功。为克服在选择分离条件时的经验主义，一些学者试图通过理论计算的方法来获得这些参数(Hupe和Lauer，1981；Cretier和Rocca，1982；Knox和Pyper，1986；Guiochon和Katti，1987)。Heuer等(1996)还提出了一种理论概念，用以指导放大的制备型色谱分离。然而，制备型色谱分离中经常出现的载样过量现象会使这种对色谱参数的选择出现错误。此外，对分离条件进行优选时，还必须考虑到洗脱过程是线性的或是非线性的(Gareil和Rosset，1982a)。 有时需采取两个步骤来完成一项分离工作：先用低分辨率的色谱柱进行粗分，再用高分辨率的色谱柱进行细分。 5．1．1分离方法的建立和优化 为选择制备型加压液相色谱的分离条件，可采取下列操作步骤： 1．选择液相色谱系统。在某些情况下，可用薄层色谱分析来初步确定分离条件(Haywood和Munro，1980)——即用硅胶薄层来确定正相柱的条件，用反相硅胶薄层来确定反相柱的条件。当采用该方法时，应牢记薄层色谱中硅胶的表面积是柱色谱中硅胶表面积的两倍，所选的展开剂条件应使样品的Rf值不大于0．3。Loev和Goodman(1967)及Bidlingmeyer(1987)曾讨论过将薄层色谱分析条件直接转换为制备型柱色谱分离的条件。 null 2．少量样品在分析型液相色谱柱上的分离。在找到适当的薄层色谱分离的展开剂条件后，应将该条件转用于分析型液相色谱柱，该柱应装有与制备型色谱柱相同的填料。利用这种初步的分析来获得正确分离条件的方法可以节省时间、样品和溶剂。 3．优化分析型液相色谱条件。应寻求较小的容量因子(K’)，原因在于： ——将分析型洗脱剂系统转换至制备型系统时经常导致分离效能 的下降；’ ——小的容量因子意味着分离时间缩短和出峰体积缩小。 良好的分析型LC分离通常是成功进行制备型LC分离的先决条件。在找到分析型LC分离条件后，一般将分辨率调至高于分析型LC分离所需水平，这样可以与制备型LC分离过程中的过载相适应(图5．3)。在进行反相柱色谱分离时，在溶剂系统中增加水的含量可帮助达到该目的。 null 4．转换至制备型液相色谱系统 (Gareil和Rosset，1982b；Cox和Snyder，1988)。将分析型液相色谱条件直接用于制备型分离时，所用的压力应为分析型分离时的三分之一左右(John．SOn和Stevenson，1978)。Bidlingmeyer(1987)详细介绍了经过薄层色谱一分析型高压液相色谱一制备型高压液相色谱来选择分离条件的方法。近期出现的一种趋势是将分析型大小的填料直接用于制备型色谱柱，这样将无需对流动相做较大的改变。Wate,n公司所生产的Symmetry系列柱(内装100A球形填料)即是这种色谱柱的代表。 5．分离效果。 6．纯化物质的回收。 7．所得物质的分析。可利用薄层色谱或分析型高压液相色谱对被分离的物质(如：图5．3中的峰a)进行分析。 分离结束后，可采用如下程序洗涤色谱柱(Simpson，1982)： 正相柱：丙酮一水一甲醇一丙酮一四氢呋喃—二氯甲烷 反相柱：甲醇：四氢呋喃l：l null5．1．2色谱柱 制备型加压液相色谱分离的关键部件是色谱柱。所选用色谱柱的大小应取决于待分离样品的量，反之亦然(Hupe和Lauer．1981；Verzele等，1988)。几种典型色谱柱的直径与上样量的关系列于表5．1中。 色谱柱的其他一些参数对于分离的成功也至关重要(图5．4)。影响分辨率(R。)的主要参数是选择性(a)和容量因子(k，)，而分离效能(塔板数，N)的影响较小。增大a值(进择性或相对保留时间)对分离的成功非常重要。 增大色谱柱的直径意味着可以承载更多的样品，从而增加产量。增加色谱柱的长度(循环色谱方法也有效地增加柱长度)则意味着可加入的样品量和分辨率的增大，但同时也增加了柱压．一般在这种情况下，色谱柱的产量并不改变(Gareil和Rosset1982b)。短的，直径大的色谱柱一般可填装小颗粒度的吸附剞而长的色谱柱则填充大颗粒度的吸附剂。在有关化学文献中，有些学者喜欢采用大直径色谱柱(De Jong等，1978)，也有些学者倾向于使用长的色谱柱(Scott和Kucera，1976)。对于难于分离的组分(a<1．2)，使用小颗粒吸附剂(及大直径的色谱柱)离的组分(a<1．2)，使用小颗粒吸附剂(及大直径的色谱柱) 可以起到更好的效果(Jones，1988b)。 nullnull 然而，色谱柱的直径不可能无限度地增大，因为柱壁的厚度也需同时增加，以承受更大的压力。 在高压制备型色谱分离中，可采用能承受高达300 bar的大孔径不锈钢柱。玻璃柱虽然价格低廉，但所能承受的压力较小，且容易破碎。 5．1．3固定相 有关液相色谱的专著一般都有关于液一固(吸附)、分配(液一液和键合相)、凝胶和离子交换色谱及其相应固定相的介绍(如Johnson和Stevenson，1978；Snyder和Kirkland，1979)。Unger和Janzen(1986)对制备型加压液相色谱所使用的填料写过一篇出色的综述。该文列出了颗粒度(d。)大于20#m的各种商品吸附剂。但要强调的是，产品在不断发展，不断有新的固定相出现。 null 选择合适的柱填料不仅应考虑其化学性质，还应注意以下几点： (1)颗粒大小(不应忘记孔径体积与孔径大小) (2)色谱柱长度 (3)操作压力 只有恰当地综合考虑上述各种因素，才能得到好的分离效果。增加色谱柱的长度可提高分离率，但需施加更大的压力。而改变色谱柱的直径对样品的渗透性影响不大。增加柱的载样量最好是在柱的装填技术及柱壁的机械承受能力允许范围内，通过增大柱的直径来实现，然而，增大柱的直径意味着增加费用及消耗更多的溶剂。 球形颗粒填料优于不规则形状颗粒的填料(Unger和Janzen，1986)，它具有较高的机械强度，不易破碎，柱的填装重现性较好，并可增加样品在柱中的渗透性等优点。球形颗粒填料价格较高，但其使用寿命也较长。 null5．1．3．1颗粒大小 许多具有不同颗粒度的固定相已经商品化，其中颗粒大小在40～63／．tm之间的较易于干法装柱，载样量大且价格适中。能进行有效分离的最适宜的固定相颗粒大小为15btm左右(Verzele等，1988)。减小颗粒度可增加塔板数及分辨率，但同时引起装柱困难(对小颗粒的固定相来说，装填长于50cm的色谱柱较困难)，需要更高的操作压力，成本也增加许多。然而，当样品量较少、昂贵或难于纯化时，使用高分辨率的颗粒直径为10um的固定相可能会解决问题。尽管如此，使用更小颗粒的固定相及更高的压力操作系统仍是一种发展趋势，例如Franke和Verillon(1988)曾报道用一50×21．4mm的色谱柱(内装3μm，100A。的C18填料)对一些天然产物进行了分离。 5．1．3．2硅胶衍生的固定相 大孔硅胶是最重要的液固色谱固定相，也被用于制备键合相固定相。根据制备方法的不同，可得到不同孔径、表面积及颗粒形状(不规则或球形)的吸附剂。对于分析型高压液相色谱柱，大都采用颗粒度在5～10μm的填料，而对于制备型液相色谱柱，通常采用直径在10～40μm或更大颗粒的填料。 null 目前在大多数制备型加压液相色谱分离中仍采用未衍生的硅胶，主要原因在于其价格低廉，可供选择的溶剂种类多，分离后溶剂易于除去及流速快。然而，键合相填料(尤其是反相)的应用日趋普遍，这类吸附剂具有许多优点，如减小了样品被破坏的危险，不可逆吸附较少等。 硅胶经过处理后，可使分离效果得到改进。例如，Witt等(1985)在纯化vomitoxin(一种单端孢菌毒素)前，先将低压Adsorbosil硅胶色谱柱用水冲洗，然后用二氯甲烷洗脱色谱柱，除去无关的物质，最后用水洗脱单端孢菌毒素。这种分离是基于液一液分配原理，而不是通常的吸附原理。另一种方法是用缓冲液处理硅胶，即先用适当的缓冲液冲洗固定相，然后将这种改进的固定相彻底干燥。分离时所选用的洗脱剂应不能溶解硅胶上的缓冲物质。Schwarzenbach(1985)曾报道用此方法分离高极性物质，可减少拖尾现象。虽然用这种改进的柱色谱进行的制备型分离工作还很少报道，但它对分离酸、碱、高极性化合物以及异构体的潜力是不可忽视的。 用硝酸银处理过的硅胶来分离含烯键的几何异构体混合物具有较好效果(VaN Beek和Subrtova，1995)，然而这种硅胶用于制备型分离并不常见。有关这类色谱柱的制备方法曾有过介绍(Heath和Sonnet，1980；Morita：等，1983)。Li等(1995)报道了用含有10％硝酸银的硅胶柱进行快速分离，即将200～300目硅胶与硝酸银水溶液一起研磨，然后置于150℃的烘箱中干燥。他们用此吸附剂分离甾体和三萜混合物，每50g吸附剂可上样1g。同时还报道了制备含硝酸银硅胶的薄层色谱板的方法。 null Morita等(1983)报道用一根300×22mm的色谱柱．以正己烷一乙酸乙酯(4：1)为洗脱剂对536mg倍半萜苍术醇(hi—nes01)和p一桉叶油醇(p—eudesm01)的混合物进行了分离。Itokawa~究小组采用硝酸银处理过的硅胶，以正己烷一乙酸乙酯为洗脱剂，从姜科植物山姜(A珍inia J‘aponica)中制备型分得8个倍半萜类化合物(Itokawa等，1985)。Larn等(1985)用10％硝酸银处理过的硅胶(Kiesegel 60，40～63／zm)从咖啡豆中分得二萜类化合物。Weyerstahl等(1996)还利用硝酸银处理过的硅胶进行快速色谱分离，从柏科植物北美崖柏(Thuja occi．dentalis)的精油中分离得到各种倍半萜类化合物。他们先用快速硅胶柱色谱对该木材的油(25g)进行两次分离，得到几个已知倍半萜，然后利用硝酸银处理的硅胶(ICN Silica32～63 μm；石油醚一乙醚为洗脱剂)再进行一次快速色谱分离，得到12mg新的愈创木二烯衍生物1βH，5αH，7βH-愈创木-3，10（14）-二烯-11-醇（1）。Weyerstahl等（1995）用相同的方法从菊科植物Baccharis dracunculifolia nullRoyleanones和coleons(如醌的甲基化物，2)一类高度氧化及脱水的abietanoic二萜类植物色素因会产生严重的拖尾现象。难以用常规的色谱方法进行分离。尽管采用缓冲液处理过的硅胶(见5·1·3·2节)分离效果较好，但仍存在硅胶表面吸附的缓冲剂有可能被洗脱下来的问题。在寻找含有化学键合酸性基团固定相时。研究者发现质子化的强阳离子交换树脂能分离上述二萜类化合物。色谱柱内可装填Partisil 10 SCX(苯磺酸型；由于分离主要是通过吸附原理，化学键合相硅胶需具有游离的硅烷醇基团)，并以己烷一二氯甲烷和己烷一二氯甲烷一甲醇为洗脱剂。利用该方法，Rtiedi(1985)从唇形科植物Plectranthus parvirus和P．strigosus中分得八个parviflorones类化合物(具有化合物2骨架的醌的甲基化物)，所用洗脱剂为己烷一二氯甲烷一氯仿一甲醇100：100：150：3。 此外，离子交换剂银化色谱可用于分离烯烃类的异构体、萜类和脂肪酸。在进行精油的分离时，可用甲醇为洗脱剂，操作比较方便；如甲醇混有四氢呋喃与叔丁基甲基醚，则可提高分离的选择性(Evershed等，1982；van Beek和Subrtova，1995)。 Abbott等(1989)曾比较过该技术与离心分配色谱和非水反相高压液相色谱用于三萜乙酸酯分离的效果。 null5．1．3．4离子对色谱 该技术是在拟进行色谱分离的离子化化合物中加入一种反离子。通过形成离子对使其表现为非离子化状态。该原理可应用于正相与反相固定相，改进分离效果，并使色谱峰变窄。离子对液相色谱尤其适用于生物碱的分离，如应用于从一种紫草科植物雏菊中分离pyrrolizidine生物碱(Huizing等，1981)。Kato等利用Cosmosil 5C18一AR 250×20mm色谱柱，以高氯酸钠溶液和含高氯酸的乙腈混合液为洗脱剂，从芸香科植物Zanthox“Um“s—ambarense和Z·ckalybeum中分得几个季铵生物碱，其中包括一个新的异喹啉生物碱3。Kato等(1996)将植物Z．usam—barense的茎用甲醇提取，在提取液中加入酒石酸，用乙醚除去-其中脂溶性物质，然后将水层碱化，并用乙醚和氯仿提取。在残留水液中加入高氯酸钠，用1，2 Z．氯乙烷继续提取。所得水相用高氯酸酸化后，再用1，2一二氯乙烷提取。合并、浓缩有机溶剂提取液，将其溶于二甲基亚砜和0．5 mol／L高氯酸钠(1：1)的混合液，进行HPLC分离。采用梯度洗脱方式，在40min内，流动相由A：B 80：20变为60：40(其中A为0．2 mol／L高氯酸-钠60％高氯酸1000：0．2，B为乙腈)，分离得到usambanoline（3），得率0.00039%。 null 聚合物固定相与正相及键合相硅胶相比，优点在于其可承受pH值1～13的洗脱溶剂。此外，它具有较大的容量，在某些情况下，选择性优于键合相硅胶固定相(Smith，1984)。多孔的非极性聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物(如Amberlite XAD一2．XAD一4，Hamilton PRP和Polymer Laboratories PLRP-S)已有商品出售。Pietrzyk研究小组(Pietrzyk和Stodola，1981；Pietrzyk等。1982)试验了Amberlite XAD一4的性能，并用它来分离氨基酸与肽类成分。Kimura等(1981)比较了用Diaion CHP一3C．Amberlite XAD一2，Hitachi gel 3011和JaSCO I-IP一01等几种苯乙烯一二乙烯基苯聚合物分离多粘菌素类抗生素的效果。他们采用较低的洗脱剂流速(大约lml／min)，认为Hitachi gel 3010和Amberlite XAD一2两种固定相的制备型分离效果较好。West和Cardellina(1991)曾研究用Hamilton PRP一1固定相从海绵中分离多羟基甾醇类化合物。Buta(1984)测试了用装有Hamilton PRP一1苯乙烯一二乙烯基苯聚合物(10tzm)的HPLC柱分离植物酚酸和黄酮类化合物的效果，洗脱剂采用含乙腈的稀甲酸溶液。他们发现实验结果具有可重复性，并可与十八烷基硅胶柱相媲美o Musser等(1996)利用PLRP-S柱进行HPLC分离。梯度乙腈一水一三氟乙酸为洗脱剂，从Fusarium monili7{}rme中分得一个纯的fumonisin真菌毒素。 5.1.3.5 聚合物色谱柱 null 反相、多孔聚合物大孔树脂Diaion FIP一20(MitsubishiChemical Industries公司)对于分离极性化合物十分有效。例如-在分离皂苷类成分的开始阶段，可用它进行初步分离，采用梯度水～甲醇、水L腈或水一丙酮系统洗脱，该方法在日本应用尤其普遍(Hostettmann和Marston’．1995)。Matsuura等(1984)用聚合物MCI CHP 20P，以70％甲醇水溶液洗脱，有效地从人参根部分离出达玛烷型皂苷类成分。 Benson和Woo(1984)以及Poole和Poole(1991)在其文章或著作中对聚合物色谱柱作了更为详细的介绍。 5．1．3．6环糊精 环糊精主要用于分离对映体、非对映体和异构体(第九章)，但环糊精键合固定相还有少数(且昂贵的)其他用途。它们与正相的diol柱性质相似(Ward和Armstrong，1986)。West和Cardellina(1991)从海绵Dysidea etheria中分离多羟基甾醇类化合物时，在最后阶段采用了Astec J9一环糊精色谱柱(250×4．6riLrn)，洗脱剂为乙腈一水(1：1、2：1、4：1或5：1，根据各个甾醇而定)。环糊精色谱柱可用于分离侧链有微小差异的类似物。 null 5·l·3·7凝胶过滤柱(见第八章) 从理论上讲，凝胶过滤柱是依分子大小的排阻效应来进行分离的。当将凝胶过滤柱用于分离小分子时，溶剂一溶质一固定相之间相互作用变得十分重要。液相色谱凝胶(如用于蛋白质的分离)具有牢固的结构，从而保证其流体动力性质，并防止其随pH值或离子强度变化产生大的体积变化；它们通常是以共聚物的形式存在(见第八章)。Lesec(1985)曾写过一篇出色的综述，其中涉及制备型凝胶过滤色谱的各个方面。半刚性凝胶，其中包括Styragel和TSK凝胶，已得到普遍采用，更小颗粒(如10μm)的这类凝胶也可购得。刚性凝胶，如Porasil或μPorasil。一般是由玻璃或硅胶制成，因此不应在pH值高于7．5晶条件下使用。这些孔状材料尤其适用于分离水溶性物质。 null5．1．4。装柱方法 根据所选用的制备型液相色谱方法，固定相颗粒度的大小及柱的尺寸，可采用不同的装柱方法(Haywood和Munro，1980：Gareil和Rosset，1982b；Prusiewicz等，1982；Verzele等1988；Unger，1994)。装柱的效果与颗粒度的大小有关，颗粒度减小会导致装柱难度增加。一般来说，颗粒直径小于20～30μm的固定相，需采取湿法装柱，而对于球形硅胶，即使颗粒大／J：为20μm，也可采用干法装柱。如先将固定相用醚类溶剂润湿，则允许装入颗粒大小为10tma的硅胶(Verzele和Geeraert．1980)。尽管从HPLC的使用角度而言，人们通常是购买装好所需填料的预制柱，但从分离方法的角度看，有关制备型液相色谱的装柱方法仍是重要的，这方面内容将在制备型加压液相色谱的相关章节中加以介绍。下面简要介绍一下最常用的装柱方法。 null 5．1．4．1干装法 所谓“敲击一装填”技术适用于颗粒直径大于20～30μm的固定相(Cox，1990)。作为一个例外，通过使用减压及氮气加压法．在中压液相色谱柱中可装填颗粒直径为15／μm的硅胶(Zogg等，1989a)。 5．1．4．2沉降法 该方法有两点不足之处，即耗时长及固定相易发生凝结。后一个问题可通过选择适当的装填溶剂解决(解凝)。例如，Wang等(1990a)用丙酮为溶剂，将颗粒大小为16／μm的C18硅胶装于250×21mm的色谱柱中，然后用甲醇一水(1：1)冲洗加固柱床。Porsch(1994)报道了单独用甲醇为溶剂将颗粒大小为15μm的硅胶和Ct8硅胶装入直径为50 mm的色谱柱中。 5．1．4．3湿装法 湿装的目的是迫使相对稀的固定相悬浆以高速装入色谱柱中，从而减少空隙的形成。在压力作用下，溶剂经过过滤后流出柱外，柱床不断增高(“高压过滤”)。然而当柱直径大于20mm，所加压力为30～40 bar时，高压悬浆装柱技术就变得十分复杂。 5．1．4．4可变几何柱 为将小颗粒固定相装入更大的制备型色谱柱，可采用柱床压缩技术。先将固定相悬浆(或偶尔的干填充物)装入柱中加压，即利用物理方法将其压紧。有两种压缩方法可供采用：径向压缩和轴向压缩(图5．5)。 null径向压缩(Sarker等，1996)是利用气体或液体施压于金属柱内紧贴柱壁的柔性层。该技术适用于圆筒形色谱柱的制备，可干装颗粒小至15／．tm的固定相。径向压缩技术由Little等(1976)于70年代中期发明，并已广泛用于受专利保护的Waters公司RCM系统中。只要有适当的圆筒支撑架，就可制备直蟹8～40mm、最大长度可达100mm的各种色谱柱。利用扩展组件，还可组装成一长达300mm的色谱柱。现已有内装Nova—Pak，Bondapak。Delta-Pak及Porasil填料的预制柱出售。Hostettmann等(1986)曾介绍过装有不同填料的Waters公司的PrepPAK色谱柱的几个应用领域。 null轴向压缩可在柱顶端、底端或两端同时进行。可利用机械压力或水压来推动活塞，将所需量的浓缩悬浆压缩至活塞停止运动，该色谱柱即可用于分离，尽管在随后的洗脱过程中柱床还会缩短(Porsch，1994)。利用一可移动的活塞可克服上述缺点，因在洗脱过程中柱床上始终保持着一固定的压力(“动力轴压缩”)(Colin等，1990)，从而保证了填料维持稳定、均匀且没有空隙形成。动力轴向压缩柱可能是最普遍采用的加压柱，柱的内径可达80cm。一些轴向压缩柱在洗脱完成后可用活塞将填料压出色谱柱。 径向与轴向复合压缩柱(图5．5c)是将一楔形杆压入色谱柱内，该技术由Separations Technology公司(SepTeeh)于1987年开发成功(“环形膨胀”)。 轴向压缩技术是由Godbille和Devaux(1974)发展的，在最初应用Jobin-Yvon系统时，施加于柱床的压力在5～20 bar之间(例见Hostettmann等，1986)。Roussel-Uelaf公司原来的专利技术目前被Prochrom公司采用(如Proehrom 150是一直径为15 eln的轴向压缩柱)。其他生产轴向压缩柱的公司还有Amicon公司(N-Pack一300等)，Axxial公司(从前为Jobin-Yvon)，Modcol公司，CEDI公司(为25～150mm直径，50～300ram长度的塑料或钢预制柱)和E．Merck公司(Prepbar) (Unger，1994)。若使用更大的色谱柱，每次可进样分离50～lOOg样品。 null Rainin于1985年发展了两端有螺丝旋帽的色谱柱(动力轴向压缩或称“Dynamax”系统)，通过旋转两端的螺丝旋帽可(手工)压缩柱内填料，并消除洗脱过程中逐渐产生的空隙(图5．5e)。Macherey-Nagel公司对该技术进行了改进，即只在柱的一端安装一螺丝旋帽(“Vario．Prep'’系列柱)。该色谱柱的直径为10～80mm，长度可达250mm。 5．1．5加样 在将样品加到制备型色谱柱上之前，需考虑以下几个因素： ——样品的制备方法 ——溶解样品的溶剂 ——样品重量 ——样品体积 ——上样方法 ——色谱柱和装置 null一般而言，应尽可能选用流动相来溶解样品，但应注意样品在流动相中应有良好的溶解度。如果样品体积太大，分辨能力就会下降(Verzele和Dewaele，1986)；另一方面，如果样品过浓，则可能在柱的顶部形成沉淀(注意：当溶解样品的溶剂比流动相的洗脱能力差时，色谱柱对样品有浓缩作用)。尽管如此，为每次可分离得到更多量的样品，还是应在小体积的流动相中溶解较多的样品(Guiochon和Katti，1987)。将一成功的分析型分离放大为制备型分离时，可能会遇到样品的溶解度问题。对于一些在水中难溶的样品，在进行反相HPLC分离时，就经常会遇到上述问题。例如，对于伞形科植物Musineon divaricatum中的香豆素就无法采用反相I-IPLC进行分离，因为它们在适用于其分离的溶剂中的溶解度很差(Swager和Cardellina，1985)。 有时也可将样品溶于不同于流动相的溶剂，但用此法时需很谨慎。例如，植物毛兜铃Aristolochia clematitis根部的粗提物在甲醇一水系统中溶解度较差，为从该提取物中获得马兜铃酸，Makueh等(1992)在进行反相HPLC分离前，先将样品溶于甲醇一四氢呋喃1：1的溶液中。 正确的上样方法对于保证液相分离的成功十分重要，因此需注意使样品均匀地分布于柱的顶端。De Jong等(1978)曾对色谱柱的顶端进行修饰，以改善样品在柱上的分布。通常的上样方法(Haywood和Munro，1980)包括： ——用注射器进样 ——静止进样 ——通过六通阀进样(有或无进样线圈) ——通过主泵进样 ——通过辅助泵进样 ——固体上样 null 固体上样是解决样品低溶解度的一种方法。可将样品的干粉与柱填料混合或预先吸附在填料上，然后加至柱顶或将混合物加人分离柱前的前置柱中(Miller等，1989)。对于难溶的样品(5mg／ml以下)，每份样品需混入5～10份的柱填料。Miller等(1989)曾报道应用前置柱的方法分离O．1～1900g的样品，其中每份样品混入2～5份的柱填料。 5．1．6泵 由于在制备型加压色谱分离过程中采用较大颗粒的填料，色谱柱的通透性比分析型色谱柱的要大，因此，可施加较低的压力用于溶剂的传输(10～100 ml／min)，相应地可采用压力小一些的输液泵，用往复泵或气动放大泵就十分适合。精确度、完全脉冲调节等对分析型分离准确度来讲很关键的因素，对于制备型分离并不特别重要。然而当采用装入小颗粒固定相的粗柱进行制备型HPLC时。例外地需用能提供较大压力的泵。在某些场合，所需压力高达150 bar，此时采用薄膜泵较适合。对小直径制备型色谱柱，可采用最大流速在10～15ml／min的分析型液相色谱泵。 null5．1．7检测器 绝大多数商品检测器都用于分析性工作，它们存在容易饱和的问题，并不适用于制备型分离(尤其是中压液相色谱分离)。然而。一些专门为制备型分离而 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的带有样品槽的检测器也有出售。如GOW-MAC公司的80—800 LC-UV检测器，其中洗脱液以薄膜的形式流经一石英槽(Leutert和von Arx，1984)。使用这种检测器时，洗脱液流速可达500ml／min。此外，一些检测器也可装配不同长度的样品槽(如Knauer公司生产的检测器)。一般说来，带有0．05mm长度样品槽的紫外检测器可承受高达200ml／min的洗脱液流速。 用于制备型加压液相色谱的检测器应能适应高流速洗脱液的经过。因柱上洗脱下来的物质的浓度较高，在高流速下导致的灵敏度下降问题是容许的。实际上，流出液中物质的浓度经常太高，致使超过检测器的最大负荷。避免该情况的一种方法是在溶质紫外吸收较弱的波长处进行检测。另一种方法是采用旁路分离管将，j滢流出液导入分析型检测器(Simpson，1982；yon Arx等，1982)。 加压液相色谱的检测方法种类不多，两种最常用的技术——紫外和示差检测——都有其局限性。示差检测器对温度变化很敏感，对少量物质的检测不理想，且不能采用梯度洗脱方式，然而，它能提供较广泛的检测。对于无紫外吸收物质的另一种日益受到欢迎的检测方法是蒸发光散射检测(ELSD)。ELSD可用于非挥发性成分，并可在梯度洗脱条件下检测。该检测方法需通过加热的方式使溶剂挥发，因此需安装一分流装置，对易分解的成分另外收集。也可用薄层色谱对高浓度的流出液各流分进行检测，所以当其他检测方法不适用时，可求助于薄层色谱检测。 null 进行制备型液相色谱分离时，所用溶剂的纯度很重要。即使含纯化合物的流动相溶剂中含有微量的不挥发性杂质，当大量溶剂经蒸发后，其杂质浓度就会增高。制备型液相色谱往往需消耗大量溶剂，因此应在溶剂纯度(和价格!)与所用数量之间进行权衡。 流动相中的非挥发性添加剂(如应用离子对色谱，置换色谱)会在产物回收时引起麻烦(见下一节)，这时可采用挥发性缓冲物来改进分离效果，又易于将其除去。例如，Reed等(1986)利用Whatman Partisil lOgm M9／cs(500×9．4mm)高压液相色谱柱，以甲醇一0．1mol／I。乙酸铵(pI-I 5．5)(60：40)为流动相，从粗的藜芦碱(veratrine，生物碱混合物)中分得甾体生物碱藜芦定(veratridine)(4)。将所需流分合并后，通过简单的冷冻干燥即能得到纯度为98．4％的藜芦定。 与此类似，Mierzwa等(1985)利用半制备型十八烷基硅胶柱。以乙腈一0．01 mol／L乙酸铵(pH 4．0缓冲液)(40：60)为洗脱剂，分离得到大环内酯抗生素mycinamicin。Edwards等(1996)利用HPLC分离方法，也以乙腈一乙酸铵为洗脱剂，从蓝绿藻类原核生物Microcystis aeroginosa中分得环肽类化合物。 通过梯度洗脱方式或只是几次简单地改变流动相的组成，即可达到使色谱峰变窄的目的(Porseh，1994)。 5．1．8流动相 null5．1．9被分离物质的收集 在制备型分离工作中，需使用大量的洗脱溶剂，因此要采用适当的收集器。如有可能，应对溶剂回收再用，因而也应尽量不使用混合溶剂。 在使用反相或聚合物吸附剂进行分离时，有时从水液中回收样品较困难。一种解决办法是蒸除其中的有机溶剂，然后用甲苯或氯仿提取残留水液。如Du等(1984)在用乙腈一水一乙酸混合溶剂进行反相和TSK凝胶色谱分离后，用正己烷提取其中的漆酚组分。Bruce等(1990)以乙腈一四氢呋喃一水一乙酸为流动相进行制备型HPLC分离，在用碳酸氢钠中和乙酸前，减压蒸除乙腈和四氢呋喃，最后用氯仿提取剩余水液，得到所需成分。另一方法是对已得到纯化的成分进行再次色谱分离，尤其是当使用缓冲溶剂时。如Morishita等(1984)用梯度10 mmol／L磷酸一甲醇为洗脱剂，从咖啡豆中分得氯原酸后，再利用Cis固定相进行再次分离纯化，以水为洗脱剂，以除去其中的磷酸。 Scalbert等(1990)利用Sephadex LH一20凝胶过滤方法，将混于鞣花单宁(ellagitannins) [从Fagaceae科植物欧洲白栎(Quercus robu，．)中获得]中的磷酸除去。他们首先用水进行洗脱。以除去酸，然后用甲醇将单宁洗下。也可用Sephadex G一10或Bio—C-elP一2等型号的凝胶去盐。 如以甲醇一水为洗脱液，可将收集的流分用水稀释5倍，用泵加回到色谱柱上，然后用甲醇将化合物洗脱下来。如从环肽中脱盐时，先用水洗脱重新加到柱上的流分，然后用纯甲醇洗脱所需成分(Edwa~s等，1996)。另一方法是将收集的样品加到Sephadex LH一20柱上，如Sem等(1992)在从植物蔷薇中分离黄酮苷时，采用此法以水洗除HPLC洗脱液中含有的磷酸，而后用甲醇将纯化合物洗下。 目前的发展趋向是实现进样与流分收集的自动化，这样可进行连续的操作及反复的分离。 null5．1．10边缘切割和循环色谱分离 当对两个或多个相距很近的主要成分进行分离时，若色谱系统的选择性不足以将该混合物分开，此时可采用循环色谱分离(Chanon等，1994)(图5．6)。在确定最佳分析型分离条件后进行制备型色谱分离，通过切割相应色谱峰的前部和后部可获得纯a和b。利用此法，对a和b的混合物(循环组分)重新进行分离，可进一步获得纯品。如果一次循环分离还未将a和b完全分开，则可重复进行循环色谱分离(Coq等，1981)。实际上。循环色谱分离与增加柱长度的效果类似。 色带变宽是由泵内溶剂体积过大等柱外因素引起，应将其控制在最低限度(Haywood和Munro，1980)。循环色谱分离中最先被洗脱的峰不应与上次分离中最后出的峰重叠(即总带宽应小于循环体积)。 ， null 循环色谱分离需具备两个基本装置(Haywood和Munm． 1980)： ——密闭进样器； ——交替柱循环(亦可参见5．1．12节)。 前一种是将流经检测器的色谱柱流出液通过多向阀连于泵的入口。后一种是连结两根色谱柱，使洗脱液从第一根柱直接流人第二根柱。必要时，在收集到纯的样品前，通过阀门控制，可将由第二根色谱柱切割得到的样品再加到第一根柱上。该方法的优点在于样品只流经泵一次。Mohanraj和Herz(1981)报道了用色谱峰边缘切割和循环色谱技术分离labdadienes异构体混合物和labdatfienes异构体混合物的方法。上述每组异构体混合物中三个成分即使在HPLC图中也只表现为一个峰。因分离中使用单一组成溶剂系统(正己烷)，溶剂可回收再用，被分离物质的回收率高达98％。 其他一些分离实例可参见5．2．4节。 null5．1．1l色谱柱的过载和中心切割 为提高制备型分离能力，可使色谱柱超载(使质量或浓度超载。而非容积超载)。由于分离不是在线性条件下进行，最佳的分离条件无法再从分析型数据来预测。在利用“中心切割”技术进行分离时，需避免主要色谱峰前后两端微量组分的污染(图5．7)。 null 用这种方法进行分离，可能损失少量的a，但a的产量却可提高。在实际分离过程中，可逐渐加大上样量直至达到适当的超载程度，并通过中心切割得到一不受色谱峰前后杂质污染的产物。硅胶类固定相的超载量可由每克固定相超载样品lmg起开始摸索(Herbert，1991)。 为达到最大承载的目的，样品应尽可能溶在比流动相溶解能力差的溶剂中。 Farmakalidis和Murphy(1984)利用中心切割法从大豆中分离异黄酮类成分染料木苷(genistin)和大豆苷(daidzin)。也可用超载上样法从混合物中分离微量成分，如图5．8所示，通过切割超载上样的色谱柱得到一富含a的流分，对其再进行一次分离即可得到纯的化合物a。 null5．1．12柱转换 柱转换一词包括改变流动相方向的所有技术。利用这类技术可使一根色谱柱的洗脱液流人另一根色谱柱(Ramsteiner．1988)。该技术具有以下优点： ——分辨能力和选择性得到提高 ——样品可在运转中纯化 ——将第一根柱得到的部分纯化的流分通过后续的柱色谱分离(包括循环色谱)可得到100％纯度的样品 ——微量的样品可得到富集 ——可以减少用于清洗色谱柱等所花的时间 利用转换阀可将第一根柱的一个流分注入第二根柱。在第二 根柱进行分离时，可同时用溶剂清洗第一根柱(Ramsteiner， 1988)。用该方法进行超载分离时十分有用，因中心切割所得组分可立刻被引入第二根柱，使其得到进一步纯化。Little和Sta． hel(1984)利用该方法从菊科植物甜叶菊(Stevia rebaudiana) 叶子的水一甲醇提取物中直接分得甜味剂甜叶菊苷(Stevioside 5)。 null他们先将干燥的植物叶子用甲醇一水80：20浸提，蒸干溶剂后，将提取物直接注入10tim Spherisorb ODS色谱柱(250×10mm)，用甲醇一水7：3洗脱。将通过中心切割所得含甜叶菊苷的流分经转换阀引入另一根相同的色谱柱，并以相同的溶剂进行洗脱，与此同时，用甲醇清洗第一根色谱柱，这样可为后面的分离省去很多时间。即使超载量不很精确(每次注射量30～50mg)，经过第二根柱的分离，也可获得纯的甜叶菊苷。 Okano等(1984)配合使用柱转换和循环色谱分离法从兔血浆中纯化25一羟基维生素D，。他们首先将要分离的物质通过硅胶柱(1)(图5．9)，洗脱液经过六通阀中的5’和4’流出。当需要时，使洗脱液经过5’和6’进入第二根硅胶柱。将含有维生素的流分在两根色谱柱间进行反复循环分离。可得到逐步纯化的样品。 5．1．13色谱峰的大小 色谱峰的大小不仅取决于样品中某个组分数量的相对多少 还与其光学性质有关。例如，混合物中一个主要的具有弱紫外吸收的组分可能被 一个很微量的、但具有很强紫外吸收的组分完全掩盖。根据色谱峰来收集流分可能导致主要组分的丢失。图5.10中所举的例子说明色谱峰的大小不能反映某个化合物的重要程度。 为避免在某一波长处可能产生的检测器超负荷，可再选用另似)，但由于操作的简便性及经济方面经常是首要考虑的因素。因此，快速色谱分离方法得到了普遍应用。 nullnull快速色谱的前身与人们熟知的短柱色谱非常近似(Hunt和Rigby，1967)，用这种短柱色谱分离混合物时可采用Merck公司的硅胶Kieselgel G(用于制备型薄层色谱的细硅胶)，并用瓶装氮气加压。常用的柱直径为3～10cm，长度为7～15cm。 快速色谱首先由Still等于1978年详细介绍，其目的在于缩短常压柱色谱的操作时间，该技术于1981年获专利保护(美国专利4，293，422)。色谱分离时进行长时间的洗脱有两个缺点： 敏感化合物可能被分解和色带容易拖尾，这两个问题在天然产物分离中经常会遇到。需要进行快速色谱分离的一个例子是对昆虫拒食活性成分柠檬苦素类(“monoids)化合物的研究。这些化合物在常压硅胶柱上会逐渐分解，只有配合使用快速色谱分离和半制备型HPLC技术才能获得纯品(Nakatani等，1994)。 图5．11为一典型的快速色谱分离装置。该装置包括一装有活塞、长度适合的玻璃柱，可用于法或湿法将固定相加入其中。干法装柱效果更好，但需用大量溶剂使固定相完全润湿。在固定相的顶部最好加一 层沙子，固定相的上端应留有足够的空间以便反复加人洗脱剂，也可在柱顶装一滴液漏斗作为储液槽。加样后，使柱与气体人口相联，该处装一针式阀门以控制压缩气体的流速。可施加高于大气压1 bar的压力 使样品洗脱。利用不同尺寸的色谱柱对0．01～10．0g样品所进一波长进行检测，以使杂质的吸收不再被观测到。 null5．2各种制备型加压液相色谱方法 ——快速色谱(约2 bar／30 psi)； ——低压液相色谱(<5 bar／75 psi)； ——中压液相色谱(5～20 bar／75～300 psi)； ——高压液相色谱(>20 bar／300 psi)。 低压、中压与高压液相色谱的压力范围之间会存在一定交叠，只是为了区分方便，才分成这样三类。 分离中所用色谱柱及固定相颗粒的大小需根据分离的难易程度而定。对于小量的难分离的样品(口～1)，应采用小颗粒(5～10脚)的固定相，若采用稍大颗粒的固定相及稍长的色谱柱也可达到相同的分离效能。对于较易进行的分离(a》1)，可采用较大颗粒的固定相及相对多的上样量，此外，也可采用较低压力的色谱分离。如选择性确实很高，则可采用快速色谱分离。 鉴于色谱柱(和样品量)的大小差别很大，最好根据制备型分离中所用压力的大小来区分各种制备型色谱： null5．2．1快速色谱 快速色谱的概念十分简单，使用价廉、易得的实验室常规玻璃仪器即可进行这种变相的常规柱色谱分离。因此，当研究人员遇到简单的分离问题时，常倾向于选用快速色谱分离方法。 快速色谱的分辨率不及中压液相色谱(两者的载样能力相行的分离通常可在15min内完成。 人们还想出了另外一些增大洗脱剂储存体积的方法，其中包括使用廉价的分液漏斗。在使用该方法时，分液漏斗不是直接连于色谱柱的顶端，因此应防止连接处的破损(Leung等，1986)o另一方法是采用在顶端及底部都带有活塞的色谱柱，据称用这种色谱柱可增加分离的重现性(Reiehenb／ieher等，1991)。 Taber(1982)报道了一种称为“薄层色谱目数级柱色谱”(TLC mesh eolurrm chromatography)的技术，其中采用10～15tan的硅胶及与快速色谱非常近似的条件，据称该方法的分辨率很好。 null快速色谱系统的商品有： ——Aldrich公司出售系列色谱柱，流速控制装置及溶剂储液槽。 --Baker公司出售系列色谱柱，流速控制装置，球形接口溶剂储槽及各种固定相。 ——Eyela“快速”色谱装置由Tokyo Rikakikai公司制造，但该装置使用一往复玻璃活塞泵来导人溶剂，类似于低压液相色谱系统。 ——Biotage(Charlottesville VA，USA)径向柱压缩系统，每次可分离1～250g的样品，最大流速可达250 ml／min(压力可达7 bar)。该系统有两种型号：Flash 75型具有一直径为7．5cm的色谱柱(预装200，400或800g KP—Sil 32～63肛60 A硅胶)；Flash 150型具有一直径为15cm的色谱柱(可装2．5或5kg硅胶)。色谱柱与溶剂储槽(4～60L)相连，溶剂流速由压缩空气调控。 null5．2．1．1硅胶吸附剂 快速色谱中使用最广泛的固定相为硅胶。可采用的硅胶有Merck公司生产的LiChroprep si 60 25～40肿，40～63pan或63～200tan，而J．T．Baker公司的40tan硅胶则是专为此技术而设计的。YMC公司也生产专用的球形固定相。Still等(1978) 最早提出的使用40～63μm的固定相可得到最好的分辨率。若使用63～200μm的硅胶，流速可控制在50 ml／min。因流速很快且分离时间很短，通常用100 ml烧瓶手工接收各流分，然后利用 薄层色谱对各流分进行检测。 利用直径为50mm的色谱柱，可对1g薄层色谱板上Rf相距约0．1的混合物进行分离(Still等，1978)。如果分辨率要求不高，用这些色谱柱可分离多达10g的样品(如植物粗提物)。一般来说，上样量与柱的截面积成比例(表5．2)。 null 有时可采用硅胶快速色谱对天然产物进行最终纯化；而更常见的情况是首先用此方法对粗提物或混合物进行初步纯化，然后再利用其他具有高分辨率的技术进一步纯化。换言之，可利用快速色谱将复杂的混合物初步、快速地划分为几个流分，这些混合物也可来自化学合成，快速色谱是纯化中间体的一种理想方法。Smith等(1996)将该方法用于(+)一trienomycinsA和F全合成过程中的分离，这两个化合物是从链霉菌中分得的ansarnycin类抗生素。 干柱快速色谱，顾名思义，是一种干柱色谱(第四章)与快速色谱的结合。’在柱内装入干的填料后，加入样品——通常是吸附在少量填料上。加入洗脱剂后，利用空气或氮气压力使洗脱剂流经填料。Onocha等(1995)用此方法从马钱科植物Antho．cleista djalonensis中分离得到单萜及一个二苯并一a一吡喃酮类化合物，所用填料为硅胶，石油醚一乙醚混合溶剂为洗脱剂。Cabr．era和Seldes(1995)配合使用硅胶和C18反相硅胶干柱快速色谱，并在最后阶段用半制备型HPLC分离，从凤梨科植物Tillandsia gscur~oata中得到cycloartane型三萜及其氢过氧化物(例如，7)。他们首先使用硅胶干柱快速色谱分离(依次用己烷、己烷一二氯甲烷及二氯甲烷洗脱)，然后对二氯甲烷洗脱部位进行C18反相硅胶干柱色谱分离，用甲醇一水和极性渐低的甲醇一二氯甲烷混合溶剂洗脱，得到富含氢过氧化物的流分。 应用快速色谱进行化学合成品及天然产物分离的报道日益增多。实际上，该技术现已成为常规方法，所用色谱柱的尺寸及流速已很少有报道，一般只提及所用洗脱剂。表5．3有选择性地收集了几个应用实例。null5．2．1．2键合相吸附剂 快速色谱技术不仅仅局限于使用硅胶为固定相，包括键合相在内的其他吸附剂也有其潜在的用途。 Kiihler和Lindsten(1983)介绍了一套简单的反相快速色谱系统。在装有十八烷基硅胶的色谱柱上连有一加压泵(加压范围